ANTI- Scl70 ANTIBODIES

COD 44863 96 Determinaciones CONSERVAR A 2-8C Reactivos para la determinacin de anticuerpos anti-Scl70 Slo para uso in vitro en el laboratorio clnico

ANTICUERPOS ANTI- Scl70

Enzimoinmunoanlisis PRUEBA EN MICROPLACA

FUNDAMENTO DEL MTODO

Los anticuerpos anti-Scl70 presentes en el suero se unen al antgeno adsorbido a la superficie de los pocillos de la microplaca. A continuacin, se incuba con anticuerpos anti-IgG humana conjugados con peroxidasa. Finalmente, se aade el sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en presencia de H2O2, que al ser degradado por la peroxidasa da lugar a un producto de color azul. La reaccin enzimtica se detiene con una solucin de cido clorhdrico y la formacin de producto amarillo se mide a 450 nm. La concentracin de anticuerpos en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto de la reaccin1.

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS

Tampn de lavado. Efectuar una dilucin 1/20 del Tampn de Lavado Concentrado (A) con agua destilada y mezclar. Se necesitan aproximadamente 50 mL de Tampn de Lavado para el lavado de una tira. Una vez diluido, el reactivo es estable 30 das a 2-8C. Los dems componentes estn listos para su uso.

EQUIPO ADICIONAL
Cmara hmeda. Aspirador multicanal o lavador automtico de microplacas. Lector de microplacas o fotmetro con microcubeta y filtro de 450 10 nm.

CONTENIDO Y COMPOSICIN
A. Tampn de Lavado Concentrado. 50 mL. Tampn fosfatos , azida de sodio 15 mmol/L. B. Diluyente de Muestra. 100 mL. Tampn Tris, azida de sodio 15 mmol/L. C+. Control Positivo. 1,5 mL. Listo para su uso. Suero humano con anticuerpos anti-Scl70 , azida de sodio 15 mmol/L. C-. Control Negativo. 1,5 mL. Listo para su uso. Suero humano negativo para anticuerpos anti-Scl70 , azida de sodio 15 mmol/L. D. Conjugado. 15 mL. Inmunoglobulinas policlonales de conejo anti-IgG humana conjugadas con peroxidasa. E. Sustrato. 15 mL. 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB). F. Solucin de Paro. 15 mL. cido clorhdrico 1 mol/L. M. Microplaca: 12 mdulos de 8 pocillos cada uno sensibilizados con Scl70 altamente purificado. S1-S6. Patrones. 1,5 mL listos para su uso. Suero con anticuerpos antiScl70, azida de sodio 15 mmol/L. Las concentraciones de anticuerpos son 0, 6,25, 12,5, 25, 50, y 100 U/mL, segn se indica en la etiqueta. Calibrados frente al suero de referencia ANA Human Reference Serum AF/CDC9 de los Centers for Disease Control (CDC), Atlanta, USA. Los sueros humanos utilizados en la preparacin de los patrones, del control negativo y el control positivo eran negativos para el antgeno HBs y para los anticuerpos anti-HCV y anti-HIV. Sin embargo, los patrones y los controles deben tratarse con precaucin como potencialmente infecciosos.

MUESTRAS
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. Diluir las muestras 1/100 con Diluyente de Muestra antes del ensayo. Utilizar siempre diluciones frescas.

PROCEDIMIENTO
1. Atemperar los componentes del kit a temperatura ambiente (Nota 1). 2. Abrir la bolsa de la microplaca (M) y retirar la cantidad necesaria de pocillos (Nota 2). 3. Determinacin cuantitativa: Pipetear 100 L de cada uno de los patrones (S1-S6), Control Positivo (C+), Control Negativo (C-) y muestras diluidas en distintos pocillos. Determinacin cualitativa: Pipetear 100 L de Patrn S3, Control Positivo (C+), Control Negativo (C-) y muestras diluidas en distintos pocillos. Pipetear 100 L de Diluyente de Muestra para el blanco. 4. Incubar los pocillos durante 30 minutos en cmara hmeda a temperatura ambiente. 5. Aspirar el lquido y lavar los pocillos con 300 L de Tampn de Lavado durante unos 10 segundos 3 veces (Notas 3 y 4). 6. Pipetear 100 L de Conjugado (D) en cada uno de los pocillos. 7. Incubar los pocillos durante 15 minutos en cmara hmeda a temperatura ambiente. 8. Lavar como en el paso 5. 9. Pipetear 100 L de Sustrato (E) en cada uno de los pocillos. 10. Incubar los pocillos durante 15 minutos en cmara hmeda a temperatura ambiente. 11. Pipetear 100 L de Solucin de Paro (F) en cada uno de los pocillos e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (Nota 5). 12. Medir la absorbancia del contenido de cada pocillo a 450 nm usando el Patrn S1 o el blanco para el ajuste a 0. El color es estable durante al menos 30 minutos.

CONSERVACIN
Conservar a 2-8C. Los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del kit sin empezar, siempre que se conserven bien cerrados y se evite la contaminacin durante su uso. Una vez abiertos, se recomienda utilizar los componentes antes de 4 semanas. Indicaciones de deterioro: Reactivos: Presencia de partculas, turbidez. Microplaca: Roturas en el sobre contenedor, defectos macroscpicos como ralladuras en la base del pocillo.

CLCULOS
Determinacin cuantitativa. Representar grficamente los valores de absorbancia obtenidos para los Patrones frente a sus respectivas concentraciones de anticuerpos anti-Scl70 (U/mL). La concentracin de anticuerpos en la muestra se calcula por interpolacin en la curva de calibracin. Determinacin cualitativa. Calcular la absorbancia del Valor Discriminante aplicando la siguiente frmula: A450 nm Valor Discriminante = A450 nm S3 x F El valor F es 0,8 y relaciona S3 con el valor discriminante terico de la prueba. Calcular la razn de absorbancias aplicando la siguiente frmula: A450nm de la Muestra Razn de absorbancia = A450nm del Valor Discriminante

Lmite de deteccin: 0,5 U/mL. El kit Anti-Scl70 reconoce solamente anticuerpos especficos de Scl70. No se han observado reacciones cruzadas con otros autoantgenos ENA. Interferencias: La hemlisis (hemoglobina < 1000 mg/dL), la lipemia (triglicridos < 3000 mg/dL) y la bilirrubina (< 40 mg/dL) no interfieren. Otras sustancias y medicamentos pueden interferir2. Intervalo de medida: 1,5100 U/mL. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra con Diluyente de Muestra y repetir la medicin.

CARACTERSTICAS DIAGNSTICAS
La presencia de niveles elevados de anticuerpos contra Scl70 es indicativa de escleroderma. Estos anticuerpos se encuentran en aproximadamente el 20-40% de pacientes con esta enfermedad 3,4,. La sensibilidad y especificidad para escleroderma del kit de Anticuerpos Anti-Scl70 de BioSystems fue del 76,0% y 99,0%, respectivamente, en un estudio con 125 muestras clnicas. Los detalles del estudio estn disponibles bajo solicitud. El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.

Cuando se obtengan valores de absorbancia por encima del lmite superior del rango del lector de microplacas, diluir la muestra con Diluyente de Muestra y repetir la operacin.

VALORES DE REFERENCIA
Se consideran positivas las muestras con concentraciones superiores a 12,5 U/mL o con razn de absorbancia superior a 1,0. Se consideran negativas las muestras con concentraciones inferiores a 7,5 U/mL o con razn de absorbancia inferior a 1,0. Las muestras con concentraciones comprendidas entre 7,5 y 12,5 U/mL deben considerarse dudosas y se recomienda la repeticin del ensayo o la determinacin de parmetros alternativos de valor diagnstico. Estos valores se dan nicamente a ttulo orientativo. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

NOTAS
1. No mezclar componentes de distintos lotes de kit. 2. Guardar los pocillos que no se utilicen en la bolsa bien cerrada y con el saquito desecante en su interior. 3. Tener cuidado de no rayar la superficie interior de los pocillos durante todo el procedimiento. 4. Es importante que no queden restos de Tampn de Lavado en los pocillos. 5. La Solucin de Paro (F) detiene la reaccin enzimtica, por lo que se debe pipetear en los pocillos siguiendo el mismo orden y a los mismos intervalos de tiempo con que se inici la reaccin pipeteando el Sustrato (E) en el paso 9.

CONTROL DE CALIDAD
El valor de absorbancia del blanco debe ser inferior a 0,150. El valor de absorbancia del Patrn S6 debe ser superior a 1,300. La concentracin del Control Positivo (C+) debe quedar comprendida entre 22 U/mL y 32 U/mL, y la del Control Negativo (C-) debe ser inferior a 7,5 U/mL. La razn de absorbancia para el Control Negativo debe ser inferior a 1,0. Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de Calidad interno, as como procedimientos de correccin en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias aceptables.

BIBLIOGRAFA
1. Butler JE. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. En: Howard GC ed. Methods in Nonradioactive Detection. Appleton & Lange, 1993. 2. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press, 1997. 3. Vzquez-Abad D, Rothfield NF. Topoisomerase-I (Scl-70) autoantibodies. En: James B. Peter and Yehuda Shoenfeld eds. Autoantibodies. Elsevier, 1996. 4. Kuwana M, Medsger TA, Wright TM. Detection of anti-DNA Topoisomerase I antibody by an enzyme-linked immunosorbent assay using overlapping recombinant peptides Clin Immunol Immunopathol 1995;76 (3): 266-278.

CARACTERSTICAS METROLGICAS
Repetibilidad (intraserie):
U/mL 22,9 45,2 92,1 CV % 2,0 1,6 1,7 n 24 24 24

Reproducibilidad (interserie):
U/mL 20,6 45,0 78,7 CV % 1,4 1,4 1,2 n 30 30 30

M44863c-01

BioSystems S.A. Costa Brava 30, Barcelona (Spain)

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06/2008