Obtención de Bromelina

i
UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERA BIOQUMICA
TEMA

OBTENCIN DE UN CONCENTRADO CON BROMELINA A PARTIR DE
PIA (Ananas comosus), Y DETERMINACIN DE SU ACTIVIDAD
ENZIMTICA EN SUSTRATOS PROTENICOS

Trabajo de investigacin (Graduacin). Modalidad: Seminario de graduacin.
Presentado como requisito previo a la obtencin del ttulo de Ingeniera Bioqumica
otorgado por la Universidad Tcnica de Ambato, a travs de la Facultad de Ciencia e
Ingeniera en Alimentos.

AUTORA: Violeta Maricela Dalgo Flores

TUTOR: Ing. Juan de Dios Alvarado. M.Sc

AMBATO ECUADOR
2012

ii

APROBACIN DEL TUTOR DE TESIS

En mi calidad de Tutor del trabajo de investigacin sobre el tema:
OBTENCIN DE UN CONCENTRADO CON BROMELINA A PARTIR DE
PIA (Ananas comosus), Y DETERMINACIN DE SU ACTIVIDAD
ENZIMTICA EN SUSTRATOS PROTENICOS, de la estudiante Violeta
Maricela Dalgo Flores egresada de la Carrera de Ingeniera Bioqumica
considero que dicho informe investigativo rene los requisitos y mritos
suficientes para ser sometido a la evaluacin del jurado examinador
designado.

Ambato, Septiembre del 2012

Ing. Juan de Dios Alvarado. M.Sc.
TUTOR

iii

AUTORA DE LA INVESTIGACIN

Los criterios emitidos en el trabajo de investigacin: OBTENCIN DE UN
CONCENTRADO CON BROMELINA A PARTIR DE PIA (Ananas
comosus), Y DETERMINACIN DE SU ACTIVIDAD ENZIMTICA EN
SUSTRATOS PROTENICOS, as como tambin los contenidos, ideas,
anlisis, conclusiones y propuesta corresponden exclusivamente a Violeta
Maricela Dalgo Flores, como autora de este trabajo de grado.


Srta. Violeta Dalgo Flores
AUTORA

iv

APROBACIN DEL TRIBUNAL DE GRADO
UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS

Los miembros del Tribunal Examinador aprueban el informe de
investigacin, sobre el tema: OBTENCIN DE UN CONCENTRADO CON
BROMELINA A PARTIR DE PIA (Ananas comosus), Y
DETERMINACIN DE SU ACTIVIDAD ENZIMTICA EN SUSTRATOS
PROTENICOS de la estudiante: Violeta Maricela Dalgo Flores.
Por constancia firman:

Ing. MBA Romel Rivera
PRESIDENTE DEL TRIBUNAL

Ing. Mario Manjarrez Ing. William Teneda
MIEMBRO DEL TRIBUNAL MIEMBRO DEL TRIBUNAL

v

DEDICATORIA
A Dios por guiar mi camino.
A mis padres, Hctor y Violeta, a mi abuelita Ofir,
A mis queridas hermanas Geovy y Gaby, y a Lili
que son mi fortaleza diaria, y el pilar para alcanzar mis metas.
A mis amigos y compaeros de aula que me han
brindado su apoyo incondicional.

vi

AGRADECIMIENTO
Presento mi sentido agradecimiento a la Universidad Tcnica de
Ambato y a la Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos,
que me han permitido cumplir con el sueo de mi vida.
Agradezco tambin a aquellos profesores de mi facultad quienes con sus
consejos y aprendizaje supieron guiarme en el desarrollo de mi tesis de grado.
Un sincero agradecimiento a mi tutor de tesis
Ing. Juan Alvarado por su apoyo incondicional, y por brindarme sus
conocimientos, orientaciones, y motivacin, que han sido
fundamentales para mi formacin como investigadora.

vii

NDICE GENERAL
Contenido Pg.
PGINAS PRELIMINARES
Portada i
Aprobacin del tutor de tesis ii
Autora de la investigacin iii
Aprobacin del tribunal de grado iv
Dedicatoria v
Agradecimiento vi
ndice general vii
ndice de tablas xi
ndice de figuras xii
ndice de ecuaciones xii
ndice de anexos xii
Resumen ejecutivo xviii
INTRODUCCIN 1

viii

CAPITULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIN
1.1 Tema de investigacin 2
1.2 Planteamiento del problema 2
1.2.1 Contextualizacin 3
1.2.1.1 Macro 3
1.2.1.2 Meso 4
1.2.1.3 Micro 5
1.2.2 Anlisis crtico 6
1.2.3 Prognosis 7
1.2.4 Formulacin del problema 7
1.2.5 Preguntas directrices 7
1.2.6 Delimitacin del objeto de investigacin 8
1.3 Justificacin 8
1.4 Objetivos 9
1.4.1 General 9
1.4.2 Especficos 10
CAPITULO II
MARCO TERICO
2.1 Antecedentes investigativos 11
2.2 Fundamentacin filosfica 15
2.3 Fundamentacin legal 18
2.4 Categoras fundamentales 22
2.4.1 Marco terico de la variable independiente 22
2.4.2 Marco terico de la variable dependiente 30
2.5 Hiptesis 34
2.6 Sealamiento de variables 34

ix

CAPITULO III
METODOLOGA
3.1 Enfoque 35
3.2 Modalidad bsica de la investigacin 36
3.3 Nivel o tipo de investigacin 36
3.4 Poblacin y muestra 37
3.4.1 Poblacin 37
3.4.2 Muestra 37
3.5 Operacionalizacin de variables 38
3.6 Recoleccin de informacin 38
3.6.1 Obtencin del jugo de pia 38
3.6.2 Extraccin de bromelina 39
3.6.3 Concentracin de la bromelina 39
3.6.4 Determinacin de la actividad enzimtica del concentrado 40
protenico de bromelina
3.6.4.1 Determinacin de la constante K del viscosmetro de 41
Cannon Fenske
3.6.4.2 Determinacin de la densidad de los sustratos protenicos 42
de hidrlisis
3.6.4.3 Medicin de la viscosidad de la leche y jugo de carne 43
al adicionar el concentrado protenico de bromelina
3.6.4.3.1 Preparacin de las muestras 43
3.6.4.3.2 Medicin de la viscosidad 43
3.6.5 Diseo experimental 44
3.6.5.1 Diseo factorial 2
2
44
3.6.5.2 Diseo de bloques completos 46
3.7 Procesamiento y anlisis 47

x

CAPITULO IV
ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS
4.1 Anlisis de los resultados 48
4.2 Interpretacin de datos 51
4.2.1 Humedad y materia seca de los concentrados protenicos 51
4.2.2 Constante K de los viscosmetros de Cannon Fenske 52
4.2.3 Densidad y viscosidad de los sustratos 52
4.2.4 Viscosidad de los sustratos al adicionar los concentrados 53
protenicos de bromelina
4.2.5 Actividad enzimtica 55
4.2.6 Grficas 56
4.2.7 Anlisis estadstico 58
4.3 Verificacin de la hiptesis 60

CAPTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 Conclusiones 61
5.2 Recomendaciones 63

CAPITULO VI
PROPUESTA
6.1 Datos informativos 65
6.2 Antecedentes de la propuesta 66
6.3 Justificacin 67

xi

6.4 Objetivos 68
6.4.1 General 68
6.4.2 Especficos 68
6.5 Anlisis de factibilidad 69
6.6 Fundamentacin 70
6.7 Metodologa 72
6.8 Administracin 74
6.9 Previsin de la evaluacin 75

MATERIALES DE REFERENCIA
Bibliografa 77
NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades fsicas de la bromelina 29
Tabla 2. Operacionalizacin de la variable independiente 38
y dependiente
Tabla 3. Esquema del diseo factorial 2
2
45
Tabla 4. Esquema del diseo de bloques completos 46
Tabla 5. Costos de la propuesta de investigacin 70
Tabla 6. Modelo operativo (Plan de accin) 73
Tabla 7. Administracin de la propuesta 74
Tabla 8. Previsin de la evaluacin 75

xii

NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Niveles estructurales de las protenas 23
Figura 2. Evolucin energtica de una reaccin qumica 25
Figura 3. Modelo llave cerradura de Fisher 26
Figura 4. Estructura de la bromelina 29
Figura 5. Viscosmetro de Cannon Fenske 33

NDICE DE ECUACIONES
Ecuacin 1. Porcentaje de humedad 40
Ecuacin 2. Porcentaje de materia seca 40
Ecuacin 3. Constante K del viscosmetro de Cannon Fenske 41
Ecuacin 4. Densidad absoluta de la muestra 42
Ecuacin 5. Viscosidad 44

NDICE DE ANEXOS
ANEXO A. TABLAS DE RESULTADOS
Tabla A1. Humedad y materia seca de los concentrados protenicos con
bromelina en etanol y NaCl.

xiii

Tabla A2. Constante K de los viscosmetros Cannon - Fenske para la
medida de viscosidad.
Tabla A3. Densidad y viscosidad de la leche y jugo de carne.
Tabla A4. Viscosidad de la leche con concentrado protenico que contiene
bromelina en etanol.
Tabla A5. Viscosidad de la leche con concentrado protenico que contiene
bromelina en NaCl.
Tabla A6. Viscosidad de la leche con bromelina comercial.
Tabla A7. Viscosidad del jugo de carne con concentrado protenico que
contiene bromelina en etanol.
Tabla A8. Viscosidad del jugo de carne con concentrado protenico que
contiene bromelina en NaCl.
Tabla A9. Viscosidad del jugo de carne con bromelina comercial.
Tabla A10. Valores de la actividad enzimtica de los sustratos de hidrlisis
con concentrados protenicos de bromelina.

ANEXO B. GRFICAS
Grfica B1. Cambios de la viscosidad de la leche en funcin del tiempo por
efecto de bromelina extrada con etanol, con la correspondiente ecuacin
polinmica de regresin.

xiv

Grfica B2. Determinacin de la actividad enzimtica mediante pruebas de
cambios de viscosidad de la leche en funcin del tiempo por efecto de
bromelina extrada con etanol, con la correspondiente ecuacin lineal.
efecto de bromelina extrada con NaCl, con la correspondiente ecuacin
bromelina extrada con NaCl, con la correspondiente ecuacin lineal.
efecto de bromelina comercial, con la correspondiente ecuacin polinmica
de regresin.
bromelina comercial, con la correspondiente ecuacin lineal.
Grfica B7. Cambios de la viscosidad del jugo de carne en funcin del
tiempo por efecto de bromelina extrada con etanol, con la correspondiente
ecuacin polinmica de regresin.
cambios de viscosidad del jugo de carne en funcin del tiempo por efecto de
tiempo por efecto de bromelina extrada con NaCl, con la correspondiente

xv

tiempo por efecto de bromelina comercial, con la correspondiente ecuacin

ANEXO C. ANLISIS ESTADSTICO
Tabla C1. Optimizacin del diseo factorial 2
2
.
Grfica C1. Optimizacin del diseo factorial 2
2
Grfica C2. Respuesta de superficie.
Tabla C2. Diseo de bloques completos.
Tabla C3. Prueba de comparacin mltiple Tukey al 95% para los diferentes
tratamientos.
Grfica C3. Prueba de Tukey al 95% para los tratamientos.
Tabla C4. Cuadro de anlisis de varianza.

xvi

ANEXO D. FOTOGRAFAS
Fotografa D1. Seleccin de la pia
Fotografa D2. Fraccionamiento
Fotografa D3. Molienda
Fotografa D4. Jugo de pia
Fotografa D5. Jugo de pia con NaCl y etanol
Fotografa D6. Congelacin
Fotografa D7. Centrifugacin
Fotografa D8. Precipitados
Fotografa D9. Precipitados en NaCl y etanol
Fotografa D10. Pesado
Fotografa D11. Secado
Fotografa D12. Concentrados de bromelina en NaCl y etanol
Fotografa D13. Pesado de la leche
Fotografa D14. Mezcla en agua a 40C
Fotografa D15. Densidad de la leche
Fotografa D16. Adicin del concentrado protenico en la leche
Fotografa D17. Muestras en congelacin

xvii

Fotografa D18. Medicin de la viscosidad de la leche
Fotografa D19. Molienda de la carne
Fotografa D20. Obtencin del jugo
Fotografa D21. Filtracin
Fotografa D22. Densidad del jugo de carne
Fotografa D23. Adicin del concentrado protenico en el jugo de carne
Fotografa D24. Muestras en congelacin
Fotografa D25. Medicin de la viscosidad del jugo de carne

xviii

RESUMEN EJECUTIVO
En esta investigacin se efectu el estudio de la actividad enzimtica de un
concentrado de bromelina a partir de pia (Ananas comosus) en dos
sustratos protenicos de hidrlisis, leche y jugo de carne.
El Ecuador al ser un pas muy diverso en frutas y aplicado a la
Biotecnologa podra extraer enzimas presentes en dichos materiales. La
bromelina es una enzima que se extrae del jugo de pia, y que presenta
varias aplicaciones.
En el proyecto de investigacin se realiz la extraccin y concentracin de
la proteasa de la pia y la determinacin de su actividad enzimtica en
sustratos protenicos, ya que se conoce que esta enzima presenta varias
aplicaciones en la industria alimenticia, farmacutica y en la medicina. Se
utiliz como materia prima pias de la variedad milagrea, en estado de
maduracin verde, porque se conoce que en ese estadio las enzimas tienen
mayor actividad sobre el sustrato. El jugo de pia fue extrado de la pulpa, y
fue sometido a un proceso de precipitacin de protenas mediante
precipitacin alcohlica y salina, utilizando etanol al 96% y NaCl al 10%
respectivamente. Posteriormente se realiz el proceso de concentrado de
las muestras extracto-etanol y extracto-NaCl mediante el mtodo de secado
en estufa. Para determinar la actividad enzimtica del concentrado de
bromelina sobre el sustrato, se baso en el mtodo de coagulacin de la
leche propuesto por Balls y Hoover, el mismo que fue validado al medir la
variacin de viscosidad de las muestras de leche con adicin del
concentrado de bromelina, utilizando el viscosmetro de Cannon Fenske.
Se quiso utilizar otro sustrato para comprobar la accin del concentrado de
bromelina, y se utiliz jugo de carne, su obtencin se realiz mediante un
mtodo propuesto por la investigadora. De la misma manera que para el
sustrato leche, se determin la variacin de la viscosidad del jugo de carne

xix

al adicionar 0,1g de concentrado de bromelina disuelto en 100ml de vinagre
natural. Se realiz entonces una adaptacin del mtodo de coagulacin de
la leche al jugo de carne, en donde tambin se observ que su viscosidad
va aumentando conforme aumenta el tiempo de accin del concentrado de
bromelina, demostrando que se da la hidrlisis de enlaces peptdicos de sus
protenas como son casena y actina respectivamente.
Los resultados indicaron que el etanol permite una mayor precipitacin de
protenas, por lo tanto su concentrado presenta mayor bromelina,
acoplndose as de mejor manera a los sustratos, y en especial al jugo de
carne.

1

INTRODUCCIN
En la actualidad, la demanda de productos mejores, as como de procesos
industriales ptimos, donde los beneficios sean para el consumidor, la
industria y el medio ambiente, incentiva el estudio de nuevas tecnologas
para lograr dicha meta.
En Ecuador existe gran biodiversidad de plantas con principios activos
aplicados, tal es el caso de las enzimas proteasas, las cuales pueden
utilizarse en la elaboracin de muchos productos, en diversas industrias
como las de alimentos, farmacuticas, entre otras.
Las proteasas son enzimas proteolticas que cumplen una importante
funcin en el desarrollo de las reacciones inherentes al metabolismo de la
planta y existen varios estudios desarrollados que demuestran que las
proteasas, desempean un rol importante en la patofisiologa de muchas
enfermedades. Se ha despertado inters en su estudio, tanto en lo
concerniente a su actividad enzimtica, su efecto sobre distintos sustratos y
tambin en lo relacionado a sus inhibidores. Las proteasas constituyen una
muy larga y compleja agrupacin de enzimas usadas para transformar
protenas en simples pptidos.
La pia contiene diversas enzimas entre las que se destacan las proteasas,
sobresaliendo la bromelina que es una glicoprotena bsica del grupo de las
cisten proteasas. Es una protena constituida por aminocidos que se
encuentran enrollados en dos partes separadas por un puente que tiene un
lugar activo con un grupo tiol (SH) libre, la misma que ha reportado varios
usos.
El desarrollo de este proyecto consiste en extraer, y concentrar bromelina a
partir de pulpa de pia (Ananas comosus). Planta cuya actividad enzimtica
mostr buenos resultados sobre los sustratos de hidrlisis seleccionados.
2

CAPTULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACIN

1.1 Tema de investigacin
Obtencin de un concentrado con bromelina a partir de pia (Ananas
comosus), y determinacin de su actividad enzimtica en sustratos
protenicos.
1.2 Planteamiento del problema
En Ecuador existe gran diversidad de frutas con principios activos, por
ejemplo las enzimas, las cuales mediante su aislamiento y purificacin
pueden ser aplicadas en diferentes reas de la industria como en la
farmacutica, alimentaria, qumica, textil, otras. Motivo por el cual, la
presente investigacin se realiz con la finalidad de dar estudios previos a la
obtencin de enzimas puras, desarrollando un mtodo qumico que permite
obtener un concentrado protenico con la enzima bromelina contenida en la
pulpa de la pia, as como la determinacin de parmetros de cintica
enzimtica, datos que son necesarios para monitorizar las reacciones.

3

1.2.1 Contextualizacin

1.2.1.1 Macro
(RAJESHA et al., 2006), citado por (FLIX, 2008), menciona que la mayor
parte de la produccin mundial de enzimas est destinada a la obtencin de
proteasas, las cuales son enzimas proteolticas que cumplen una
importante funcin en el desarrollo de las reacciones inherentes al
metabolismo de la planta y existen varios estudios desarrollados que
demuestran que las proteasas, desempean un rol muy importante en la
patofisiologa de muchas enfermedades. Se ha despertado el inters en su
estudio, tanto en lo concerniente a su actividad enzimtica, su efecto sobre
sustratos y en lo relacionado a sus inhibidores.
La produccin mundial de proteasas representa el 38 % del total de
enzimas obtenidas, si a esto se adiciona la produccin de renina (10 - 15
%) y otras como la papana; CARVAJAL y otros (2010) concluyen que en la
actualidad la mayor parte de la produccin de enzimas est destinada a la
obtencin de proteasas.
Unas 20 compaas de Europa, Japn y Estados Unidos realizan la
produccin de enzimas, pero el mercado es dominado por 3 de ellas: Novo
Nordisk (Dinamarca) con el 50% de las ventas a nivel mundial, seguida por
Gist Brocades (Neatherlands) y Rhom and Haas (Alemania), este ltimo
pas ha adoptado recientemente un gran inters en la investigacin de la
bromelina obtenida de la pia, la cual es actualmente la dcima tercera
enzimas ms utilizada en este pas (GODFREY Y REICHELT) citado por
(ELICER, 2003).
En Amrica latina existen empresas productoras de enzimas en Mxico,
Brasil, Argentina y Uruguay, muchas de las cuales son subsidiarias de
empresas transnacionales, como es el caso de Pfizer en Mxico y Brasil, y
4

Novo en Brasil (IZQUIERDO Y DE LA RIVA, 2000) citado por (ELICER,
2003).
Una de las proteasas ms producidas a nivel mundial es la bromelina la
cual se obtiene de la pia, este es el segundo cultivo tropical de importancia
mundial despus del banano, aportando ms del 20% del volumen mundial
de frutos tropicales. 70% de la pia producida en el mundo es consumida
como fruta fresca por el pas que la produce. Esta enzima bromelina
cataliza la hidrlisis de los enlaces peptdicos de protenas. Se extrajo por
primera vez del jugo de la pia a finales del siglo XIX.
Los principales pases productores de bromelina a nivel mundial son
Estados Unidos, Tailandia y Sudfrica, los cuales son lderes en la
produccin de pia del tipo cayena y espaola, que son las ms adecuadas
para la produccin de esta enzima, dado que contienen concentraciones
aceptables de bromelina.
En su mayora las empresas productoras de bromelina, realizan procesos
de alto nivel, ya que trabajan bajo las normas GMP (Good Manufacturing
Practices) (PULIDO, 2007).
1.2.1.2 Meso
La bromelina es una enzima proteasa contenida en la pia, en Ecuador de
acuerdo a la informacin del Tercer Censo Nacional Agropecuario realizado
por el INEC (Instituto Nacional de Estadsticas y Censos) la superficie
plantada de pia es de 5750 hectreas (CASILARI e HIDALGO, 2007).
CUADRADO (2009) indica que, las principales zonas de cultivo de pia en
el pas se encuentran cerca de las poblaciones de Naranjito, Yaguachi,
Milagro, Huaquillas, Arenillas, Pasaje, Buena Fe, Valencia, Portoviejo,
Chone, El Carmen, Santo Domingo, San Lorenzo.
5

En el pas no existen empresas especializadas en la produccin de
enzimas, sin embargo, al momento se estn realizando investigaciones de
enzimas proteasas de ciertas frutas, como son del babaco, hierba mora e
higuern, en la Escuela Politcnica Nacional, y de toronche y papaya en la
Escuela Superior Politcnica del Litoral. En ambas instituciones se
observan buenos resultados en los mtodos aplicados, y pretenden
continuar con el trabajo para llegar a la industrializacin de las enzimas.
1.2.1.3 Micro
A nivel de Tungurahua, se realiz estudios sobre enzimas vegetales en la
Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos de la Universidad Tcnica de
Ambato, sobre la obtencin, y concentracin de bromelina, papana, y
ficina, y la determinacin de su actividad enzimtica segn el grado de
maduracin de la fruta; investigaciones realizadas para optar por el ttulo de
Ingeniero Bioqumico (ROBAYO y otros, 2011).

6

1.2.2 Anlisis crtico

POCA UTILIZACIN DE BROMELINA Y ESCASO CONOCIMIENTO DE SU ACTIVIDAD ENZIMTICA

Escaso nmero de
profesionales
relacionados a esta
rea

Poco conocimiento de
mtodos de
extraccin de enzima
bromelina

Inexistencia de
equipos
especializados para
su obtencin

Escaso uso de
enzimas vegetales en
la industria nacional

Pocas universidades
con estudios afines a
enzimas

Falta de inters en el
estudio de enzimas
proteasas

Preferencia por la
importacin de
enzimas

Poco conocimiento de
las aplicaciones de
las enzimas en la
industria

Elaborado por: DALGO, 2011.

Poca experiencia en
la determinacin de
actividad enzimtica

Poca importancia en
el estudio de cintica
enzimtica

7

1.2.3 Prognosis
Al no ejecutarse la presente investigacin sobre la obtencin de un
concentrado protenico de bromelina y la determinacin de su actividad
enzimtica, no se contar con una metodologa realizada a nivel de
laboratorio que permita la extraccin y la concentracin de bromelina.
Adems que no se dispondr de datos de cintica enzimtica y su
metodologa, los cuales son necesarios para la purificacin de la enzima e
investigaciones posteriores.
Asimismo, no se conocer informacin de los principios activos que
contienen las frutas del pas y su aplicacin en la medicina y en la industria.
1.2.4 Formulacin del problema
Por qu hay poca utilizacin de bromelina y escaso conocimiento de su
actividad enzimtica?
1.2.5 Preguntas directrices
Cul es el mtodo qumico que se aplicar para la obtencin de un
concentrado protenico de bromelina a partir de pulpa de pia?
Cmo se determinar la viscosidad de la leche y jugo de carne al
adicionar el concentrado protenico de bromelina?
De qu manera se establecer la actividad enzimtica del concentrado
protenico de bromelina en los sustratos de hidrlisis, leche y jugo de
carne?

8

1.2.6 Delimitacin del objeto de investigacin
rea: Bioqumica
Subrea: Enzimologa
Sector: Cintica enzimtica
Subsector: Enzimas proteasas
Delimitacin espacial: Laboratorio de ingeniera de procesos de la
Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos de la Universidad Tcnica de
Ambato.
Delimitacin temporal: Noviembre 2011 Junio 2012.
1.3 Justificacin
El proyecto de investigacin es de inters, ya que se conoce que la enzima
bromelina tiene varias aplicaciones, es as que se utiliza como ablandadora
de carnes, suplemento alimenticio, y se ha descrito que muestra varias
acciones farmacolgicas, entre otras. Es decir que esta enzima se utiliza en
el rea de la medicina y la industria. En el pas, al contar con gran
diversidad de frutas que poseen estos principios activos, es necesario
estudiarlos y establecer mtodos que permitan su obtencin.
Es de importancia esta investigacin pues los avances biotecnolgicos
impulsan a un mayor estudio en el rea de enzimologa, y mejoramiento de
los mtodos de obtencin y concentracin de enzimas. En la presente
investigacin lo que se obtuvo es un concentrado protenico de bromelina,
es decir que no se logr una enzima pura, esto debido a que los mtodos
para la purificacin requieren de equipos de alta tecnologa. El trabajo
experimental se bas en la aplicacin de un mtodo qumico para la
9

extraccin, que incluye la utilizacin de una solucin salina (NaCl) y un
alcohol (etanol). Tambin es de inters el estudio de cintica enzimtica,
parmetros que son necesarios para conocer el estado de las reacciones
qumicas, y para implementar posteriores procesos de purificacin de
enzimas.
En este proyecto se determin la actividad enzimtica del concentrado
protenico de bromelina aplicando un mtodo seleccionado, en donde los
datos procedieron de mediciones de viscosidad de la accin del
concentrado de enzima en muestras de leche y jugo de carne.
Esta investigacin fue factible realizarse en los laboratorios de la Facultad
de Ciencia e Ingeniera en Alimentos, ya que se implement una
metodologa que permiti la obtencin del concentrado protenico de
bromelina y la determinacin de su actividad enzimtica, sin la utilizacin de
equipos de alta tecnologa, sino ms bien empleando mtodos simples, pero
de gran rendimiento.
El proyecto aporta con una investigacin de enzimas proteasas extradas de
frutas, siendo una iniciativa para estudios posteriores en esta rea.
1.4 Objetivos

1.4.1 General
Determinar un mtodo para la obtencin de un concentrado de bromelina a
partir de pulpa pia (Ananas comosus), y la determinacin de su actividad
enzimtica en sustratos protenicos.

10

1.4.2 Especficos

Aplicar un mtodo qumico para la obtencin de un concentrado
protenico de bromelina a partir de pulpa pia (Ananas comosus).

Determinar la viscosidad de la leche y jugo de carne al adicionar los
concentrados protenicos de bromelina, utilizando el viscosmetro de
Cannon Fenske.

Establecer la actividad enzimtica de los concentrados protenicos de
bromelina en los sustratos de hidrlisis, leche y jugo de carne, mediante
un mtodo grfico de regresin lineal.

11

CAPTULO II
MARCO TERICO

2.1 Antecedentes investigativos
En los ltimos aos se ha efectuado trabajos investigativos a nivel mundial
que tienen mucha relacin con el tema propuesto. As, CARVAJAL y otros
(2010), indica que la pia se utiliz como planta medicinal por varias
culturas nativas. La bromelina es una cisteno-proteasa, aislada y purificada
a partir de diferentes rganos de plantas de la familia Bromeliaceae. Como
resultado de su investigacin mencionan que los sistemas de purificacin
batch y semi-batch ofrecen simplicidad, factibilidad de escalado, alta
capacidad de procesamiento de muestra, y reproducibilidad del
procedimiento cromatogrfico. El preparado obtenido por cromatografa de
intercambio inico es un producto hetergeneo en actividades proteolticas,
con una actividad especfica alta y comparable con la de otros preparados
utilizados en la teraputica (0,5 U/mg). La determinacin de la masa molar
por espectroscopia de masa mostr un valor de 24.500 Da. Esta
identificacin constituye un control de calidad de los preparados
enzimticos, lo que demuestra sus potencialidades de uso en la industria y
la biomedicina.
12

GAUTAM y otros (2010), mencionan que la bromelina es una proteinasa
principal, aislada de la pia (Ananas comosus). El objetivo del estudio fue
comparar la cantidad y actividad de la bromelina presente en el tallo y la
fruta de la planta. La bromelina fue aislada de los tallos y los frutos de las
plantas de pia madura por extraccin con solucin de buffer acuosa
amortiguada. La purificacin de la enzima se llev a cabo por centrifugacin,
tcnica de precipitacin de sales, dilisis, cromatografa de intercambio
inico y la estimacin por el mtodo de Lowrys. La bromelina fue ensayada
por su actividad mediante la hidrlisis de la gelatina, representado mediante
el uso de unidad de digestin de gelatina. La homogeneidad de la bromelina
fue confirmada por el anlisis SDS-PAGE (sodio dodecilsulfato-
poliacrilamida por electroforesis en gel). Se encontr que la mejor actividad
es de la bromelina de fruta. Por otra parte, la cromatografa de intercambio
inico con dietilaminoetil celulosa (DEAE), mantiene la integridad estructural
de la bromelina purificada y por lo tanto el producto exhibe una mejor
actividad proteoltica.
En Malasia, el estudio denominado Pilot scale extraction of proteolytic
enzyme bromelain from pineapple (Ananas comosus) PEI y otros (2005),
mencionan que el propsito del estudio fue desarrollar un proceso de
extraccin de bromelina a escala piloto. El mtodo de extraccin de
bromelina con base de frutas de pia en este estudio ha dado un contenido
de protena total de 9,33 mg/ml con una actividad proteoltica de 1400
GDU/ml. Un aumento en el ciclo de homogenizacin para aumentar la
produccin de enzimas ha demostrado ser exitoso. Una triple
homogenizacin ha mostrado tres veces mayor su actividad proteoltica.
En la investigacin realizada en la Habana Cuba, denominada Nueva
tecnologa para la obtencin de un preparado de bromelina de tallo de pia,
HERNNDEZ y otros (2003), mencionan que la bromelina es una proteasa
aislada de rganos de plantas de pia con un amplio espectro de acciones
13

farmacolgicas y alimenticias. Se dise y patent un procedimiento de
extraccin de bromelina en el que se utilizaron protectores del centro activo
de la enzima a un pH cercano al fisiolgico de la planta y alejado del ptimo.
El perfeccionamiento de la tecnologa demostr que se alcanzan
rendimientos de 20,8 g de producto/kg de tallos y 3,9 g de protenas/kg de
tallos, con una actividad especfica de 1,36 U/mg. El procedimiento de
extraccin se puede escalar y tanto en planta piloto como a escala industrial
se logran rendimientos en trminos de actividad superiores al 72% de los
obtenidos en el laboratorio. La purificacin mediante la combinacin de
mtodos cromatogrficos hizo factible el aislamiento, a partir del preparado
crudo de tallo.
A nivel de Amrica Latina tambin se han realizado estudios de la enzima
bromelina, es as que en Brasil, FRATTINI y otros (s.f) en su investigacin
sobre la optimizacin de extraccin de bromelina por micelas invertidas
a base de frutas de pia, indican que la bromelina de la fruta (EC 3.4.22.5)
se obtuvo a partir de extracto de frutas de la pia de las especies
Perola. Con el fin de evitar la desnaturalizacin de la enzima en el proceso
de purificacin, el presente trabajo estaba preocupado por la optimizacin
de las condiciones para la extraccin lquido-lquido de micelas invertidas.
En el diseo factorial fraccionado de experimentos (que se ejecuta por
lotes), se encontr que el factor de purificacin mximo obtenido fue de
aproximadamente 3 y los mejores valores de la variables independientes:
agente tensoactivo, co-solventes y concentraciones de sal, el pH de las
extracciones, fueron respectivamente: 100 mm, 10% v/v, 1 M, 3,5 y 8.
En trminos del factor de purificacin, los resultados mostraron la gran
eficacia de los impulsos en el equipo de micro-columna, en comparacin
con la extraccin de lotes y la fase dos que corresponde a la extraccin
acuosa de la bromelina.
14

GALLARDO y otros (s.f), en su investigacin denominada extraccin de
bromelina a partir de residuos de pia, concluyen que las mejores
condiciones para la extraccin de la bromelina fueron con el solvente etanol,
temperatura de -10 C y durante un tiempo de reposo de 7 das. La mayor
cantidad de protenas se encuentran en la cscara, sin embargo esta tiene
la menor actividad enzimtica y especfica. La bromelina extrada de
cscara de pia tiene un menor costo con respecto a la de las dems partes
del fruto ya que es un residuo agroindustrial. Los resultados obtenidos son
prometedores para que con un mayor grado de purificacin sea factible
aplicar esta enzima en tratamientos biomdicos.
RAMOS y otros (s.f) en los resultados de su investigacin sobre la
obtencin de bromelina a partir de desechos agroindustriales de la pia,
indican que en los tratamientos realizados, se observ una mejor actividad
especfica de la bromelina, en los tratamientos que se realizaron entre:
Acetona con jugo y cscara, y vinagre con jugo y cscara. En las coronas
se observ una pequea cantidad de protenas pero nada de actividad
especfica. En cuanto a las conclusiones, establecieron que, la utilizacin de
los desperdicios de frutos no aprovechados porque ya cumplieron su vida
til, podran emplearse para la obtencin de enzimas proteolticas.
La generacin de hidrolizados protenicos se podra hacer in situ, o
realizando extracciones a travs de un proceso tecnolgico con
precipitaciones con disolventes como acetona y vinagre.
Las enzimas proteasas aisladas de plantas de la familia Bromeliaceae se
utilizan ampliamente en la industria mdica, biotecnolgica y alimenticia.
Los estudios realizados en los ltimos aos sobre la actividad contra
metstasis y tumores de las cisteno-proteasas hacen que se incremente el
inters por explorar nuevas fuentes naturales de obtencin de fitoproteasas.
En el trabajo realizado por PREZ y otros. (2006), se evalu la actividad
proteoltica de extractos enzimticos obtenidos a partir de diferentes
15

rganos de plantas de la familia Bromeliaceae. Se colectaron y clasificaron
cinco grupos. Las plantas que se colectaron pertenecen a 3 gneros de la
mencionada familia: 3 grupos son del gnero Tillandsia, 1 es del gnero
Guzmania y otro del gnero Hohenbergia. Los mayores ndices de actividad
especfica (3,3 U/mg de protenas) se obtuvieron en los preparados
obtenidos a partir de diferentes rganos de Hohenbergia penduliflora Mez,
de cuyos extractos obtenidos se evalu la influencia del pH de extraccin y
la actividad especfica fue superior al realizarla a pH 3 a partir de sus tallos.
En los ltimos aos existen muchas investigaciones encaminadas a explicar
los mecanismos de activacin de las cisteno proteasas in vivo. Se ha
demostrado claramente que la activacin de estas enzimas depende del pH.
Los autores sugieren un predominio de molculas de enzima activa a pH
cido y est claro que las variaciones de pH neutro a pH cido en las
vacuolas provocan cambios en la conformacin nativa de la enzima inactiva,
lo que permite el procesamiento y plegamiento de la enzima activa. Las
proteasas presentes en los extractos enzimticos de H. penduliflora Mez,
pudieran tener usos similares a las obtenidas a partir de A. comosus L.
A nivel nacional, en la carrera de Ingeniera Bioqumica de la Universidad
Tcnica de Ambato existe un estudio sobre la extraccin, concentracin y
cuantificacin de la enzima bromelina de la pia, en la que ROBAYO (2011),
concluye que la extraccin de la enzima es eficiente al macerar la fruta, y
concentrarla mediante un mtodo de secado, a una temperatura de 30C,
que es la ms eficiente ya que a esta temperatura no hay desnaturalizacin
de la protena. Indic adems que la mayor actividad enzimtica de la
bromelina, cuantificada por viscosidad, es con el grado de maduracin
verde.
2.2 Fundamentacin filosfica
Los paradigmas son realizaciones cientficas universalmente reconocidas
(dogmticas) que, durante cierto tiempo proporcionan modelos de
16

problemas y soluciones a una comunidad cientfica en particular
(CONTRERAS, 2004).
El presente proyecto de investigacin se basa en el paradigma cientfico
Positivista.
El paradigma positivista, tambin llamado hipottico-deductivo, cuantitativo,
emprico-analista o racionalista, tiene como fundamento filosfico el
positivismo. Fue creado para estudiar los fenmenos en el campo de las
ciencias naturales, pero despus tambin fue utilizado para investigar en el
rea de las ciencias sociales, sin tener consideracin las diferencias que
existen entre ambas.
La investigacin positivista asume que est regido por leyes, las cuales
permiten explicar, predecir y controlar los fenmenos. En consecuencia, la
finalidad de las ciencias est dirigida a descubrir esas leyes, a arribar
generalizaciones tericas que contribuyan al enriquecimiento de un
conocimiento de carcter universal.
Para el paradigma positivista el estudio del conocimiento existente en un
momento dado conduce a la formulacin de nuevas hiptesis, en las cuales
se interrelacionan variables, cuya medicin cuantitativa, permitir
comprobarlas o refutarlas en el proceso de investigacin. Se busca una
correlacin o causa-efecto, donde los investigadores han de mantener una
actitud neutral frente a los fenmenos. El experimento y la observacin son
considerados los mtodos fundamentales del conocimiento cientfico. Los
resultados y objetivos cuantificados experimentalmente, determinarn o no
la validez de la prediccin inicial.
Para arribar a la fiabilidad de los resultados se necesita delimitar con
criterios estadsticos una muestra representativa de una determinada
poblacin. Solo as los resultados alcanzados pueden considerarse con
17

validez universal, aplicables a cualquier contexto y situacin (GONZLEZ,
2003).
La obtencin de un concentrado de bromelina y la determinacin de su
actividad enzimtica en sustratos protenicos, se basa en el paradigma
positivista ya que se centra en la bsqueda de nuevos conocimientos y su
generalizacin. Adems que la metodologa empleada es de tipo
cuantitativa, ya que se determin la actividad enzimtica de bromelina
mediante la medicin de la viscosidad en dos sustratos de hidrlisis,
obtenindose datos que son analizados para establecer el rendimiento de la
metodologa empleada. Tambin se utiliza este paradigma ya que el
escenario a utilizarse en la investigacin es a nivel de laboratorio,
empleando ciertas metodologas que pueden ser ejecutadas en el mismo.
As tambin, la investigacin se basa en el mtodo inductivo, que es un
modo de razonar que nos lleva: De lo particular a lo general, es decir: De
una parte a un todo.
Inducir es ir ms all de lo evidente. La generalizacin de los eventos es un
proceso que sirve de estructura a todas las ciencias experimentales, ya que
stas, como la fsica, la qumica y la biologa se basan (en principio) en la
observacin de un fenmeno (un caso particular) y posteriormente se
realizan investigaciones y experimentos que conducen a los cientficos a la
generalizacin.
En trminos muy generales, consiste en establecer enunciados universales
ciertos a partir de la experiencia, esto es, ascender lgicamente a travs del
conocimiento cientfico, desde la observacin de los fenmenos o hechos
de la realidad a la ley universal que los contiene. Resumiendo las palabras
de Mill. 1973, las investigaciones cientficas comenzaran con la
observacin de los hechos, de forma libre y carente de prejuicios. Con
posterioridad, y mediante inferencia, se formulan leyes universales sobre los
18

hechos y por induccin se obtendran afirmaciones an ms generales que
reciben el nombre de teoras.
Segn este mtodo, se admite que cada conjunto de hechos de la misma
naturaleza est regido por una Ley Universal. El objetivo cientfico es
enunciar esa Ley Universal partiendo de la observacin de los hechos.
(PLANEACIN ESTRATGICA, 2009).
2.3 Fundamentacin legal
La ejecucin de la presente investigacin se fundamenta en los siguientes
artculos de la Constitucin poltica de la repblica del Ecuador, expedida
por la Asamblea Nacional Constituyente.

TTULO II
DERECHOS
Captulo segundo
Derechos del buen vivir
Seccin primera
Agua y alimentacin
Art. 13.- Las personas y colectividades tienen derecho al acceso seguro y
permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos; preferentemente
producidos a nivel local y en correspondencia con sus diversas identidades
y tradiciones culturales. El Estado ecuatoriano promover la soberana
alimentaria.
19

TTULO VII
RGIMEN DEL BUEN VIVIR
Captulo primero
Inclusin y equidad
Seccin octava
Ciencia, tecnologa, innovacin y saberes ancestrales
Art. 386.- El sistema comprender programas, polticas, recursos, acciones,
e incorporar a instituciones del Estado, universidades y escuelas
politcnicas, institutos de investigacin pblicos y particulares, empresas
pblicas y privadas, organismos no gubernamentales y personas naturales
o jurdicas, en tanto realizan actividades de investigacin, desarrollo
tecnolgico, innovacin y aquellas ligadas a los saberes ancestrales.
El Estado, a travs del organismo competente, coordinar el sistema,
establecer los objetivos y polticas, de conformidad con el Plan Nacional de
Desarrollo, con la participacin de los actores que lo conforman.
Art. 387.- Ser responsabilidad del Estado:
1. Facilitar e impulsar la incorporacin a la sociedad del conocimiento para
alcanzar los objetivos del rgimen de desarrollo.
2. Promover la generacin y produccin de conocimiento, fomentar la
investigacin cientfica y tecnolgica, y potenciar los saberes ancestrales,
para as contribuir a la realizacin del buen vivir, al sumak kawsay.
20

3. Asegurar la difusin y el acceso a los conocimientos cientficos y
tecnolgicos, el usufructo de sus descubrimientos y hallazgos en el marco
de lo establecido en la Constitucin y la Ley.
4. Garantizar la libertad de creacin e investigacin en el marco del respeto
a la tica, la naturaleza, el ambiente, y el rescate de los conocimientos
ancestrales.
5. Reconocer la condicin de investigador de acuerdo con la Ley
(ASAMBLEA CONSTITUYENTE, 2008).

A nivel mundial, en el Codex Alimetarius 2011, se establece que la
bromelina es un aditivo alimentario. La Norma General del Codex para los
Aditivos Alimentarios (GSFA, Codex STAN 192-1995) indica que su uso
est justificado nicamente si ello ofrece alguna ventaja, no presenta
riesgos apreciables para la salud de los consumidores, no induce a error a
stos, y cumple una o ms de las funciones tecnolgicas establecidas por el
Codex. Sus requisitos se indican a continuacin:
a) Conservar la calidad nutricional del alimento; una disminucin
intencionada en la calidad nutricional de un alimento estara justificada
en las circunstancias indicadas en el subprrafo b) y tambin en otras
circunstancias en las que el alimento no constituye un componente
importante de una dieta normal.

b) Proporcionar los ingredientes o constituyentes necesarios para los
alimentos fabricados para grupos de consumidores que tienen
necesidades dietticas especiales.

21

c) Aumentar la calidad de conservacin o la estabilidad de un alimento o
mejorar sus propiedades organolpticas, a condicin de que ello no
altere la naturaleza, sustancia o calidad del alimento de forma que
engae al consumidor.

d) Proporcionar ayuda en la fabricacin, elaboracin, preparacin,
tratamiento, envasado, transporte o almacenamiento del alimento, a
condicin de que el aditivo no se utilice para encubrir los efectos del
empleo de materias primas defectuosas o de prcticas (incluidas las no
higinicas) o tcnicas indeseables durante el curso de cualquiera de
estas operaciones.
La intencin del sistema internacional de numeracin de aditivos
alimentarios (SIN) es que sea un sistema de denominacin armonizado para
aditivos alimentarios, como alternativa al uso del nombre especfico.
Bromelina (1101(iii))
Bromelina es un aditivo alimentario y como tal se puede utilizar en algunos
alimentos en las condiciones de buenas prcticas de fabricacin (BPF)
establecidas en el Prembulo de la GSFA del Codex.
Clases funcionales
Acentuadores del sabor y aroma
Agentes de tratamiento de las harinas
Estabilizadores (CODEX ALIMENTARIUS, 2011).

22

Pia

Enzimologa

2.4 Categoras fundamentales


2.4.1 Marco terico de la variable independiente
Las enzimas consisten en cadenas de L-aminocidos unidos
covalentemente en una secuencia definida, denominada estructura
primaria, y enrollados en forma compleja, en una estructura zwitterinica, y
Enzimas
vegetales

Proteasas

Concentrado
protenico de
bromelina
Cintica
enzimtica

Reacciones
enzimticas

Actividad
enzimtica
VARIABLE INDEPENDIENTE VARIABLE DEPENDIENTE
23

con un centro activo, formado por relativamente pocos aminocidos que son
los responsables directos de la unin con el sustrato y que catalizan la
reaccin caracterstica de cada tipo particular de enzima. La estructura
secundaria de una enzima viene determinada por aquellas secciones de la
cadena polipetdica que adoptan estructuras bien definidas, por ejemplo en
hlice ; la terciaria se refiere al enrollamiento de la estructura del poliptido
producido por fuerzas secundarias, como enlaces inicos, hidrofbicos y
puentes de hidrgeno, y la estructura cuaternaria corresponde a la forma
de asociacin de ciertas enzimas complejas, usualmente intracelulares, que
unen sus cadenas polipeptdicas mediante fuerzas secundarias hasta formar
enzimas con multisubunidades (WISEMAN, 1985).

Fig 1. Niveles estructurales de las protenas (BIXQUERT, sf).
Las enzimas son protenas altamente especializadas que tienen como
funcin la catlisis o regulacin de la velocidad de las reacciones qumicas
que se llevan a cabo en los seres vivos.
24

En una reaccin catalizada por enzimas (E), los reactivos se denomina
sustratos (S), es decir la sustancia sobre la que acta la enzima. El sustrato
es modificado qumicamente y se convierte en uno o ms productos (P).
Como esta reaccin es reversible se expresa de la siguiente manera:

El sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma un complejo
enzima-sustrato. El sustrato por accin de la enzima es transformado en
producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro
sustrato.
Mediante el incremento de la concentracin de sustrato, la velocidad de la
reaccin aumentar debido al aumento de la probabilidad de formacin de
complejos enzima-sustrato. Esto ocurrir hasta que no haya ms enzimas
disponibles para la formacin de complejos enzima-sustrato, lo que
corresponde a un punto en que la velocidad ya no aumenta. Las enzimas
constituyen el factor limitante.
La enzima libre se encuentra en la misma forma qumica al comienzo y al
final de la reaccin.
Las enzimas son catalizadores, y los catalizadores actan disminuyendo la
energa de activacin al permitir que gran parte de las molculas reaccionen
al mismo tiempo.
El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio,
produciendo un estado de transicin de menor energa que en la reaccin no
catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y
puede ser de nuevo utilizado. Las enzimas disminuyen la energa de
activacin, de tal forma que aumentan la velocidad de la reaccin catalizada,
sin afectar a las funciones termodinmicas ni a las constantes de equilibrio.
25

Fig 2. Evolucin energtica de una reaccin qumica (ITESCAM, s.f).

Propiedades generales de las enzimas
Tienen la especial capacidad de acelerar las reacciones qumicas, sin
alterarse como consecuencia de la reaccin, son especficas y solo actan
en un determinado tipo de reaccin. Como todos los catalizadores,
funcionan en una concentracin molar mucho menor que la del reactivo
sobre el cual funciona.
Especificidad
Las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la
enzima, denominado sitio activo, donde tiene lugar la catlisis. La
estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un
determinado sustrato (ni siquiera sus ismeros) es lo que determina la
especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894)
26

enunci: "el sustrato se adapta al centro activo o cataltico de una
enzima como una llave a una cerradura". (HIPERTEXTOS DEL REA DE
LA BIOLOGA, 2003).

Fig 3. Modelo llavecerradura de Fisher (ITESCAM, s.f).

Las enzimas se clasifican en 6 grupos diferentes, dependiendo del tipo de
reaccin que catalice: xido-reductasas, transferasas, hidrolasas, liasas,
isomerasas y ligasas, aunque los grupos 2,3 y 6 son, hablando
estrictamente, transferasas que transfieren grupos sin alterar el estado de
oxidacin de los reactantes.
Oxido-reductasas: Catalizan las reacciones de xido-reduccin que
implican oxigenacin, como las o todas las eliminaciones o
adiciones de tomos de hidrgeno equivalentes, por ejemplo
()
Transferasas: Intervienen en la transferencia de diversos grupos, como
aldehdo, cetona, acilo, azcar, fosforilo, etc, de una molcula a otra.
Hidrolasas: El rango de grupos hidrolizables es muy extenso, e incluye
steres, amidas, pptidos y otras funciones que contienen grupos ,
anhdridos, glicsidos y otros muchos.
27

Liasas: Catalizan las reacciones de adicin o formacin de dobles enlaces
tales como
Isomerasas: Catalizan diversos tipos de isomerizaciones, incluyendo la
racemizacin.
Ligasas: Enzimas denominadas frecuentemente sintetasas, que median en
la formacin de enlaces
Cada clase se subdivide posteriormente hasta que las enzimas individuales
se identifican mediante un cdigo de dos letras maysculas, EC y 4 cifras.
Las proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptdicos de las
protenas. Usan una molcula de agua para hacerlo y por lo tanto se
clasifican como hidrolasas (WISEMAN, 1985).
ELICER (2003), establece que las proteasas son enzimas que hidrolizan
las cadenas polipeptdicas de las protenas sustrato, se caracterizan por
tener gran variedad de especificidades. De acuerdo con el aminocido o
metal que posean en su sitio activo se clasifican en cuatro familias: sern
proteasas, asparticoproteasas, cisten proteasas y metaloproteasas.
Existen diversos ejemplos de enzimas tiles que han sido obtenidas a partir
de plantas por mtodos sencillos mediante procesos biotecnolgicos, por
ejemplo la proteasa bromelina (pia) (GASESA y HUBBLE, 1941).
La pia (Ananas comosus) es una planta monocotilednea que pertenece a
la familia de las Bromeliceas, de las cuales existen cerca de 50 gneros y
alrededor de 2000 especies. Es una fruta tropical rica en vitaminas A, B, C.
La composicin en porcentaje de una pia tpica de la variedad Cayena lisa
es: Pulpa (33%), corazn (6%), cscara (41%) y corona (20%).
28

La pia tiene actividad proteoltica debida a la bromelina que se activa por la
cistena, tiosulfato y glutatin. Es inhibida o inactivada por iones metlicos
oxidantes y por agentes que reaccionan con los tioles (cido ascrbico).
La bromelina (3.4.22.33) se obtiene del jugo, de la fruta o de los tallos de la
pia (Ananas comosus). Es una glicoprotena del grupo de las cisten
proteasas. Acta de preferencia sobre los aminocidos bsicos y aromticos
de las protenas. Su pH ptimo vara con el sustrato, en el rango de 5 a 8.
Es una protena constituida por aminocidos que se encuentran enrollados
en dos partes separadas por un puente que tiene un lugar activo con un
grupo tiol (SH) libre (ELICER, 2003).
Propiedades qumicas de la bromelina
El principal residuo amnico terminal, es la valina, y el carboxilo terminal
es glicina.
La enzima es una glicoprotena que tienen un oligosacrido por
molcula, el cual est unido por covalencia a la cadena peptdica.
La bromelina del tallo tiene un grupo sulfhidrilo reactivo por molcula, el
cual es esencial para la catlisis enzimtica.
Los principales aminocidos contenidos en la bromelina son: Arginina,
cido asprtico, serina, prolina, alanina, valina, glicina, metionina,
amonio, glucosamina (PULIDO, 2007).
Propiedades fsicas de la bromelina
Las principales caractersticas fsicas de la bromelina, se presentan en la
tabla 1.

29

Tabla 1. Propiedades fsicas de la bromelina
PROPIEDADES TALLO DE PIA
Peso molecular 33000 Da
Color Blanco
Estado Polvo
Olor y sabor Caracterstico
Solubilidad En agua
pH ptimo 7
Actividad enzimtica 1200 GDU/g
Temperatura de inactivacin 70C
Fuente: PULIDO, 2007.

Fig 4. Estructura de la bromelina (PUEBLA citado por PULIDO, 2007).

30

2.4.2 Marco terico de la variable dependiente
Los estudios cinticos representan uno de los instrumentos empleables por
el bioqumico en la investigacin de la estructura y funcin de las enzimas,
de tal forma que ha podido desarrollarse una gran variedad de complejos
modelos mecansticos, menciona (FERHT, 1977) citado por (GASESA y
HUBBLE, 1941). Sin embargo, cuando se considera la aplicacin
tecnolgica de las enzimas, los objetivos estn muy claramente definidos y
es a menudo suficiente limitarse al examen de los efectos netos de la accin
de una enzima ms que llevar a cabo un detallado estudio cintico.
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del
mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la enzima. La
velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con
relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar
la enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH,
temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones
saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin
observada es la velocidad mxima (V
max
). La velocidad puede determinarse
bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los
reactivos (GONZLEZ, s.f).
Cuando la concentracin de sustrato es mucho mayor que la de la enzima,
la velocidad de reaccin es de orden cero respecto a los reactantes, es
decir, depende solamente de la concentracin de enzimas presentes. Por
tanto, la velocidad de reaccin es esencialmente constante hasta que haya
reaccionado casi todo el sustrato, momento en que pasa a depender de la
concentracin de sustrato existente y es de primer orden con respecto a la
concentracin de sustratos (WISEMAN, 1985).

31

Actividad enzimtica
Las cantidades de enzima pueden ser expresadas en moles, como las de
cualquier otro compuesto qumico, o pueden ser cuantificadas en trminos
de actividad enzimtica. La actividad enzimtica es una medida de la
cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por
lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que
deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad.
Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de
enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La
actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de
protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml).
Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la
unidad de actividad enzimtica como la cantidad de enzima que transforma
1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol
son 10
6
moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a
60 x 10
6
U (GONZLEZ, s.f).
Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica
Temperatura: Las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo
verse modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas
ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras.
Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver
incrementada su actividad hasta el momento en que comience la
desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva
de dicha actividad.
pH: El rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes
enzimas. Si el pH del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver
32

modificada su carga elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar
la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica.
Concentracin salina: Al igual que en los casos anteriormente
mencionados, la concentracin de sales del medio es crucial para una
ptima actividad enzimtica. Una elevada concentracin o una ausencia de
sales en el medio pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las
enzimas precisan de una adecuada concentracin de iones para mantener
su carga y su estructura.

Cuando se usan enzimas en la industria, su actividad siempre debe ser
expresada en una forma dada, y calculada en condiciones tales que se
relacionen lo ms estrechamente posible con su aplicacin, incluso se
utilizan en anlisis clnicos o en procesos bioqumicos a gran escala. As, en
algunos casos es ms til expresar la actividad enzimtica en funcin de la
velocidad de cambio de solubilidad o viscosidad de un material por unidad
de peso o volumen de enzima aadido, en vez de trminos ms
convencionales como nmoles de producto formado por mg de enzima por
segundo (WISEMAN, 1985).
La viscosidad se define como la resistencia que experimenta una capa de un
lquido al moverse sobre otra capa. Hay varios mtodos diferentes para
medir la viscosidad. El mtodo ms til para medir viscosidades de las
magnitudes que se encuentran en la mayora de los lquidos biolgicos, es el
que se conoce como mtodo de Poiseuille, que se basa en el uso de un
aparato conocido como viscosmetro de Cannon Fenske. El mtodo
consiste en medir el tiempo que tarda en fluir un volumen conocido del
lquido (el que esta contenido entre las marcas) a travs de un capilar, de
longitud y radio conocidos, bajo la accin de la gravedad (CROCKFORD y
KNIGHT, 1991).
33

Fig 5. Viscosmetro de Cannon Fenske (CORREA, 2006).
La ecuacin de Poiseuille es extensamente aplicada en viscometra con tubo
capilar para fluidos newtonianos, y esta dada por la frmula:

Donde:
= Densidad del fluido
h = Altura
R = Radio
L = Longitud
= Viscosidad

34

Esta ecuacin es la base para la operacin de los viscosmetros de tubo y
capilares. Para un viscosmetro dado, h, R
2
y 8L son constantes; en
consecuencia, la expresin de la viscosidad puede ser escrita en la forma
siguiente:

Donde:
K = Constante del viscosmetro
= Densidad del fluido
t = Tiempo que tarda en fluir un volumen conocido de lquido
(ALVARADO, 1996).

2.5 Hiptesis
Ho: Las soluciones extractoras no conducen a la obtencin de un
concentrado de bromelina a partir de pulpa pia, medida por la actividad
enzimtica.
Ha: Las soluciones extractoras conducen a la obtencin de un concentrado
de bromelina a partir de pulpa pia, medida por la actividad enzimtica.
2.6 Sealamiento de variables
Variable independiente: Concentrado protenico de bromelina
Variable dependiente: Actividad enzimtica

35

CAPTULO III
METODOLOGA
3.1 Enfoque
La presente investigacin se enfoc principalmente en la metodologa del
paradigma cuantitativo, pero se complementa con la metodologa cualitativa.
Al enfocarse en la investigacin cuantitativa, se hace referencia a que se
aplic un mtodo de investigacin donde el objetivo fue estudiar las
propiedades y fenmenos cuantitativos y sus relaciones para proporcionar la
manera de establecer, formular, fortalecer, y revisar la teora existente. La
metodologa cuantitativa permiti la determinacin de parmetros cinticos
del concentrado protenico de bromelina como es la actividad enzimtica, la
misma que fue cuantificada mediante la medicin de la viscosidad,
parmetro basado en teoras ya existentes y que mediante el clculo de
modelos matemticos se pudo aceptar o no la hiptesis planteada.
La investigacin se complement con una metodologa cualitativa ya que se
dio la recoleccin de datos que son no cuantitativos, con el propsito de
explorar las relaciones sociales y describir la realidad. Se aplic este
paradigma ya que se implement nuevas metodologas para la solucin del
problema, y se realiz una bsqueda de documentos relacionados al tema
propuesto, estableciendo as discusiones y conclusiones de los resultados
obtenidos.
36

3.2 Modalidad bsica de la investigacin
El proyecto se bas en la investigacin documental, ya que se realiz
consultas a travs de documentos como libros, revistas, publicaciones,
artculos cientficos, papers o en bibliotecas virtuales, la web, entre otros.
Esto con el objetivo de poseer informacin actualizada relacionada con el
tema de estudio, necesaria para una investigacin ms profunda.
El proyecto de investigacin se realiz en los laboratorio de la FCIAL,
utilizando materiales y equipos adecuados para cumplir con los objetivos
propuestos, por tal motivo, el proyecto se fundament tambin en una
investigacin de tipo experimental, en donde a ms de identificar las
caractersticas que se estudian; se controlan, alteran y manipulan las
variables, con el fin de observar los resultados al tiempo que se procura
evitar que otros factores intervengan en la observacin.
3.3 Nivel o tipo de investigacin
El presente proyecto utiliza los siguientes tipos de investigacin:
Investigacin aplicada
El proyecto corresponde a una investigacin aplicada, ya que se acrecent
el progreso cientfico, as como los conocimientos tericos, sobre la
obtencin de enzimas proteasas y de su actividad frente a un sustrato
determinado. Adems, que los resultados obtenidos sern aplicados,
utilizados, o mejorados en futuros estudios, para una posible produccin de
bromelina a nivel industrial en el pas.
Investigacin experimental
Este tipo de investigacin facilita la obtencin y determinacin de la actividad
enzimtica de la bromelina ya que se realizaron ensayos a nivel de
37

laboratorio. El experimento realizado permiti introducir las variables de
estudio, y manipularlas para controlar su aumento, disminucin y as
establecer los mejores parmetros, obteniendo los mejores resultados.
Investigacin descriptiva
Se aplic este tipo de investigacin ya que se describi detalladamente la
metodologa a emplearse, es decir los materiales, e instrumentos utilizados
en el laboratorio, que permitieron el estudio de los parmetros cinticos de la
enzima, as como la medicin de las variables que influyen sobre esta y su
relacin.
3.4 Poblacin y muestra

3.4.1 Poblacin
Para la presente investigacin la poblacin identificada son las siguientes
variedades de pia cultivadas en Ecuador:
Cayena Lisa: Ms conocida como Champaca o Hawaiana, utilizada
mayormente en la agroindustria.
Golden Sweet: Tambin conocida como MD2, la cual se caracteriza por su
sabor dulce, tamao y aroma. Esta variedad es la ms exportada en
Ecuador.
Tipo peroleras: Milagrea (UNIDAD TCNICA DE ESTUDIOS PARA LA
INDUSTRIA, 2006).
3.4.2 Muestra
La muestra utilizada fueron pias milagreas en estado de maduracin
verde, adquiridas en el mercado Sur de la ciudad de Ambato.
38

Se trabaj con 8 pias de esta variedad, repartindolas para las 2 replicas y
para cada solucin extractora.
3.5 Operacionalizacin de variables
Tabla 2. Operacionalizacin de la variable independiente y dependiente

HIPTESIS

VARIABLES

INDICADORES

NDICE

Las soluciones
extractoras conducen
a la obtencin de un
concentrado de
bromelina a partir de
pulpa pia, medida
por la actividad
enzimtica.

VI: Concentrado
protenico de
bromelina
Humedad
Materia seca
%
%
VD: Actividad
enzimtica
Viscosidad

mPa.s

3.6 Recoleccin de informacin

3.6.1 Obtencin del jugo de pia
Lavado: Se lava la fruta con agua potable para eliminar las impurezas
presentes.
Desinfeccin: Utilizando alcohol al 70% se desinfecta la fruta.
Enjuague: Utilizando agua destilada se eliminan los residuos del alcohol.
39

Obtencin: Separar la pulpa de pia de la cscara.
Fraccionamiento: Utilizando un cuchillo fraccionar la pulpa en trozos de
aproximadamente 2cm x 2cm.
Molienda: Moler los trozos de la pulpa de pia en una licuadora a velocidad
alta, para obtener su jugo.
Filtracin: Utilizando un cedazo filtrar el jugo de pia.
3.6.2 Extraccin de bromelina
Medicin: Con una probeta medir el volumen de jugo de pia obtenido.
Mezcla: Aadir etanol al 96% en la muestra 1, y NaCl al 10% en la muestra
2; ambos 1.5 veces ms que el volumen de jugo de pia obtenido.
Almacenamiento: Almacenar en frascos de plstico las muestras extracto -
etanol y extracto - NaCl en el congelador (-10C) por 7 das.
Centrifugacin: Utilizando la centrifuga Hatch, se centrifugan las muestras
1 y 2, colocadas en tubos de Falcon de 15ml a 4500rpm por 20 mins.
Obtencin: Se elimina el sobrenadante de las muestras 1 y 2, y los
precipitados se transfieren a vasos de precipitacin.
3.6.3 Concentracin de la bromelina
Este procedimiento se realiza para las muestras 1 y 2 (precipitado con:
bromelina - etanol y bromelina NaCl).
Secado: Pesar una cpsula de porcelana en la balanza analtica, y adicionar
de 5 a 6g de la muestra de concentrado de bromelina. Registrar el peso.
Poner a secar las muestras en la estufa a 40C durante 48 horas.
40

Sacar las muestras de la estufa y enfriarlas en un desecador durante 10
minutos.
Pesar las muestras secas, si es posible hasta peso constante,
regresndolas 10 minutos a la estufa y enfriando nuevamente.
Clculo: Calcular el contenido de humedad como el peso perdido de la
muestra durante el secado, segn la siguiente frmula:

Donde:
M
1
= Peso de la cpsula ms muestra hmeda
M
2
= Peso de la cpsula ms muestra seca
M = Peso de la muestra
Se determina adems el porcentaje de materia seca mediante la siguiente
frmula:

Almacenamiento: Los concentrados protenicos de bromelina obtenidos se
mantienen en refrigeracin a 5C.
3.6.4 Determinacin de la actividad enzimtica del concentrado protenico
de bromelina
Para determinar la actividad enzimtica del concentrado protenico de
bromelina se ejecuta el siguiente procedimiento.
(Ec.1)
(Ec.2)
41

3.6.4.1 Determinacin de la constante K del viscosmetro de Cannon
Fenske
Limpieza: Limpiar el viscosmetro de Cannon - Fenske con cido ntrico,
luego enjuagarlo con agua destilada, y secarlo con aire.
Adaptacin: En un bao termosttico a 20C, se coloca verticalmente el
viscosmetro, sujetndolo con un soporte, de modo que quede sumergido
todo el bulbo superior en el agua del bao termosttico.
Colocacin de la muestra: Colocar 10ml de agua destilada y esperar 15
minutos para que el conjunto alcance la temperatura del bao.
Medicin: Succionar el lquido por medio de una pera de succin conectada
a la rama capilar hasta que este alcance la marca de aforo situada entre los
dos bulbos. Dejar caer libremente el lquido y mediante un cronmetro,
medir el tiempo de escurrido del agua destilada, es decir el tiempo que tarda
en pasar desde el primer aforo hasta el segundo.
Efectuar una nueva medida, sin limpiar ni desmontarle del termostato.
Promediar las medidas en el caso de que no superen un 5 % de diferencia
entre ellas.
Clculo: Con el dato de tiempo de escurrido, se procede al clculo de la
constante K del viscosmetro de Cannon. Aplicando la siguiente frmula:

Donde:
= Viscosidad absoluta del agua a una temperatura dada
t = Tiempo de escurrido del agua en el viscosmetro
(Ec.3)
42

= Densidad del agua a 20C
3.6.4.2 Determinacin de la densidad de los sustratos protenicos de
hidrlisis
Colocacin: Colocar las muestras de los sustratos protenicos (leche y jugo
de carne) en una probeta, colocada sobre una superficie lisa y horizontal.
Adaptacin: Sumergir el densmetro en la muestra, impartiendo un ligero
giro al soltarlo, para facilitar su puesta en reposo mientras flota apartado de
las paredes de la probeta. Esperar el tiempo suficiente para que se detenga
y todas las burbujas lleguen a la superficie.
Medicin: Cuando el densmetro se detenga y flote libremente apartado de
las paredes de la probeta, leer su escala. La lectura correcta es la de aquel
punto de la escala en el que la superficie principal del lquido corta la escala.
Determinar ese punto poniendo el ojo levemente por debajo de la superficie
del lquido y subindolo lentamente hasta que la superficie que se ve
inicialmente como una elipse se transforma en una lnea recta que corta la
escala del densmetro. La lectura realizada corresponde al valor de la
gravedad especfica (densidad relativa).
Clculo: Con el dato de densidad relativa, determinar la densidad de las
muestras de leche y jugo de carne, aplicando la siguiente frmula:

Donde:
= Densidad absoluta de la muestra

= Densidad relativa

(Ec.4)
43

= Densidad de referencia (agua a 20C).

3.6.4.3 Medicin de la viscosidad de la leche y jugo de carne al
adicionar el concentrado protenico de bromelina
Este ensayo est basado en el mtodo de Balls y Hoover, conocido como el
mtodo de coagulacin de la leche, es, sin duda, uno de los mtodos mas
expeditos para determinar actividad enzimtica de una proteasa.
3.6.4.3.1 Preparacin de las muestras
Leche: En un vaso de precipitacin colocado sobre un agitador, mezclar
15,5g de leche en polvo en 108ml de agua destilada a 40C, y
posteriormente bajar su temperatura a 20C.
Jugo de carne: En un molino, moler la carne, y macerarla hasta obtener su
jugo, medir 108 ml de jugo de carne y llevarlo a 20C.
Disolucin: En un vaso de precipitacin disolver 0,1 g de concentrado
protenico de bromelina en 100 ml de vinagre natural.
Mezcla: Mezclar 10 ml de la disolucin en los sustratos leche y jugo de
carne.
Toma de muestras: Transferir 10 ml de muestra a un vaso de precipitacin
y llevarlo a congelacin (bao crioscpico). Realizar este procedimiento
cada 2 minutos, hasta contar con 10 muestras.
3.6.4.3.2 Medicin de la viscosidad
Medicin: Determinar el tiempo de escurrido de las muestras, como se
indica en el procedimiento antes descrito para el agua destilada. Esta vez
utilizando como muestras leche y jugo de carne al adicionar los
concentrados protenicos de bromelina.
44

Clculo: Con los datos del tiempo de escurrido de las muestras, se calcula
la viscosidad, utilizando la siguiente frmula:

Donde:
K = Constante del viscosmetro
= Densidad de la muestra
t = Tiempo de escurrido
Con los datos de viscosidad se determina la actividad enzimtica del
concentrado protenico de bromelina, utilizando un mtodo grfico de
regresin lineal.
3.6.5 Diseo experimental
Se emple el diseo factorial 2
2
para la verificacin de la hiptesis, as como
el diseo de bloques completos, para la determinacin del mejor tratamiento,
debido a que se trabaj adems con dos testigos.
3.6.5.1 Diseo factorial 2
2
Factores en estudio
Factor A: Soluciones extractoras
Nivel bajo (-1) = Etanol
Nivel alto (+1) = NaCl
Factor B: Sustratos protenicos de hidrlisis
(Ec.5)
45

Nivel bajo (-1) = Leche
Nivel alto (+1) = Jugo de carne
Nmero de repeticiones = 2 rplicas
Tratamientos = 4
(-1)(-1)

= Etanol - Leche
(+1)(-1)

= NaCl - Leche
(-1)(+1)

= Etanol - Jugo de carne
(+1)(+1)

= NaCl - Jugo de carne
Total de unidades experimentales = 8
Parmetros y criterios de evaluacin: Viscosidad
Actividad enzimtica
Esquema de la distribucin del experimento
Tabla 3. Esquema del diseo factorial 2
2
Factores
Nivel bajo
(-1,0)
Nivel alto
(+1,0)
Tratamientos
Actividad enzimtica
R1 R2
A: Soluciones
extractoras
Etanol NaCl
-1,0 -1,0
+1,0 -1,0
B: Sustratos
protenicos
Leche
Jugo de
carne
-1,0 +1,0
+1,0 +1,0
46

Anlisis de varianza: Tabla ANOVA
3.6.5.2 Diseo de bloques completos

Tratamientos = 6
T1

= Etanol - Leche
T2

= NaCl - Leche
T3

= Etanol - Jugo de carne
T4

= NaCl - Jugo de carne
T5

= Bromelina comercial - Leche
T6

= Bromelina comercial - Jugo de carne
Nmero de repeticiones = 2 rplicas
Esquema de la distribucin del experimento
Tabla 4. Esquema del diseo de bloques completos
Observaciones Tratamientos
Actividad enzimtica
R1 R2
1
T1

2
T2

3
T3

4
T4

5
T5

6
T6

47

Anlisis de varianza: Tabla ANOVA
Tipos de anlisis estadsticos: Tukey
Comprobacin de resultados utilizando el software StatGraphics.
3.7 Procesamiento y anlisis
Las respuestas experimentales de viscosidad y actividad enzimtica del
concentrado protenico de bromelina, se ordenaron y tabularon en el
programa Excel, en el cual tambin se realizaron ciertos clculos, y grficos
matemticos y estadsticos.
El diseo experimental planteado, se analiz en el programa de software
StatGraphics, el mismo que integra una gran variedad de anlisis
estadsticos y grficos de alta resolucin.
Los resultados obtenidos se discutieron en relacin a datos presentados en
el marco terico, y referencias bibliogrficas relacionadas.

48

CAPTULO IV
ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

4.1 Anlisis de los resultados
Los resultados obtenidos de la investigacin se presentan en los Anexos A,
B y C.
En el Anexo A se muestran las tablas de resultados, en las cuales se
detallan los diferentes datos obtenidos de la experimentacin realizada, as
como los resultados obtenidos, los cuales fueron calculados mediante
frmulas especficas.
Es importante mencionar que en las tablas de resultados, los datos
presentados corresponden a valores promedios, como producto de dos
rplicas por duplicado.
En la tabla A1 se presentan los valores de porcentaje de humedad y materia
seca de los concentrados protenicos de bromelina en etanol y NaCl. La
Ec.1 permiti la determinacin del porcentaje de humedad de las muestras,
es decir la cantidad de agua presente, mientras que la Ec.2 dio a conocer el
porcentaje de materia seca que permanece en la muestra posterior a la
remocin del agua.
49

La tabla A2 nos muestra las constantes K de cada viscosmetro de Cannon
Fenske existentes en el laboratorio, las cuales fueron establecidas mediante
la aplicacin de la Ec.3, para lo cual se trabaj con datos de viscosidad
(9,9341x10
-1
mPa.s) y densidad (998,2 kg/m
3
) del agua a una temperatura
de 20C.
Con la metodologa planteada se determin la densidad y la viscosidad de
los sustratos protenicos empleados como son leche y jugo de carne, los
cuales fueron calculadas mediante la Ec.4 y Ec.5 respectivamente. Sus
valores pueden ser observados en la tabla A3.
Aplicando la Ec.5 se determin la viscosidad de la leche al adicionar el
concentrado protenico que contiene bromelina en etanol, datos que pueden
ser observados en la tabla A4; en donde se muestra adems los tiempos de
escurrido, el valor de la constante K del viscosmetro utilizado, y la densidad
de la muestra.
Los mismos resultados se presentan en las tablas subsiguientes para las
diferentes muestras utilizadas, as: Tabla A5 Viscosidad de la leche con
concentrado protenico que contiene bromelina en NaCl. Tabla A6
Viscosidad de la leche con bromelina comercial. Tabla A7 Viscosidad del
jugo de carne con concentrado protenico que contiene bromelina en etanol.
Tabla A8 Viscosidad del jugo de carne con concentrado protenico que
contiene bromelina en NaCl. Tabla A9 Viscosidad del jugo de carne con
bromelina comercial.
Los valores de actividad enzimtica en )
.
(
s
s mPa
de los sustratos leche y jugo
de carne, con concentrados protenicos de bromelina en etanol y NaCl se
presentan en la tabla A10. Estos datos fueron obtenidos al aplicar un
mtodo grfico de regresin lineal a las viscosidades de los tiempos de toma
muestra de 360s a 720s.
50

El Anexo B corresponde a las grficas realizadas en funcin a los
resultados obtenidos.
La grfica B1 representa el tiempo (s) Vs. Viscosidad (mPa.s) de la muestra;
es decir, que indica los cambios de viscosidad de la leche en funcin del
tiempo por efecto de la bromelina extrada con etanol. Se observa adems la
ecuacin polinmica de orden 3 ajustada en la curva de reaccin enzimtica.
En las grficas subsiguientes de regresin polinmica de orden 3, se
muestran las mismas representaciones para las diferentes muestras
utilizadas, as: Grfica B3 Cambios de la viscosidad de la leche en funcin
del tiempo por efecto de bromelina extrada con NaCl. Grfica B5 Cambios
de la viscosidad de la leche en funcin del tiempo por efecto de bromelina
comercial. Grfica B7 Cambios de la viscosidad del jugo de carne en
funcin del tiempo por efecto de bromelina extrada con etanol. Grfica B9
Cambios de la viscosidad del jugo de carne en funcin del tiempo por efecto
de bromelina extrada con NaCl. Grfica B11 Cambios de la viscosidad del
jugo de carne en funcin del tiempo por efecto de bromelina comercial.
La actividad enzimtica del concentrado protenico que contiene bromelina
en etanol sobre la muestra de leche se presenta en la grfica B2, en donde
se da la interacciona del tiempo (s) con la viscosidad (mPa.s) de la muestra.
En la grfica se presenta la ecuacin de regresin lineal as como el valor R
cuadrado.
En las grficas subsiguientes de regresin lineal, se muestran las mismas
representaciones para las diferentes muestras utilizadas, as: Grfica B4
Actividad enzimtica del concentrado protenico que contiene bromelina en
NaCl sobre la muestra de leche. Grfica B6 Actividad enzimtica de
bromelina comercial sobre la muestra de leche. Grfica B8 Actividad
enzimtica del concentrado protenico que contiene bromelina en etanol
sobre la muestra de jugo de carne. Grfica B10 Actividad enzimtica del
51

concentrado protenico que contiene bromelina en NaCl sobre la muestra de
jugo de carne. Grfica B12 Actividad enzimtica de bromelina comercial
sobre la muestra de jugo de carne.
El anlisis estadstico, as como los diseos experimentales aplicados a los
resultados obtenidos, se presenta en el Anexo C.
Los resultados que se presentan en este anexo fueron realizados utilizando
el software StatGraphics.
La optimizacin del diseo factorial 2
2
aplicado a los factores: soluciones
extractoras y sustratos protenicos, se presenta en la tabla C1, y su
representacin en la grfica C1. Para observar de mejor manera los niveles
ptimos de los factores A y B, se muestra en la grfica C2 una respuesta de
superficie en 3D.
En la tabla C2, se presenta el cuadro de ANOVA como resultado del diseo
de bloques completos aplicado a los 6 tratamientos, en los que se
encuentran incluidos los dos testigos utilizados.
Para la determinacin de los mejores tratamientos, se aplic la prueba de
comparacin mltiple Tukey al 95%, los resultados obtenidos se presentan
en la tabla C3. Grficamente, los tratamientos y la prueba de Tukey aplicada
se observan en la grfica C3.
El anlisis de varianza global de la actividad enzimtica de las muestras con
los diferentes concentrados con bromelina y bromelina comercial, se
muestran en la tabla C4.
4.2 Interpretacin de datos

4.2.1 Humedad y materia seca de los concentrados protenicos
52

Se determin que el concentrado de bromelina en etanol presenta un mayor
porcentaje de humedad que el concentrado con NaCl. Los valores obtenidos
son 8,1% y 5,6% respectivamente, lo que indica que en el concentrado con
etanol se ha evaporado una mayor cantidad de agua que en la de NaCl,
motivo por el cual esta ltima muestra presenta un mayor porcentaje de
materia seca que corresponde a 94,4 en contraparte con la de etanol que
corresponde a 91,9%; estos valores corresponden al residuo que queda una
vez evaporada el agua libre del sistema.
Se puede mencionar entonces que la muestra de concentrado con etanol al
perder mayor cantidad de agua se encuentra ms concentrada, aun cuando
presenta una menor cantidad de materia seca. Cabe mencionar que la
diferencia es mnima entre ambos concentrados, sin embargo si se obtuvo
mejores resultados con el alcohol.
4.2.2 Constante K de los viscosmetros de Cannon - Fenske
A nivel de laboratorio, se realiz la calibracin de los 9 viscosmetros de
Cannon Fenske existentes, y se observ que en cada uno el tiempo de
escurrido del agua es diferente, variando de 6s a 634,5s, esta variacin es
debido al tamao de cada tubo capilar. Para el trabajo experimental y debido
a los sustratos a utilizarse, se escogi a aquel viscosmetro que present un
tiempo promedio de escurrido (35,5s) el cual corresponde al viscosmetro 4,
con una constante K de 2.8034x10
-5
) . (
3
kg
m
mPa , datos que pueden
observarse en la tabla A2.
4.2.3 Densidad y viscosidad de los sustratos
Para determinar la densidad y la viscosidad de las muestras es importante
trabajar siempre a una temperatura establecida, en este caso se trabaj a
20C. Como se observa en la tabla A3, la densidad del jugo de carne
53

(1038
3
m
kg
) es mayor que el de la leche, que corresponde a 1030
3
m
kg
,
datos que fueron calculados utilizando la Ec.4. Los valores de viscosidad en
este caso son directamente proporcionales a los de la densidad ya que la
viscosidad del jugo de carne (2,52 s mPa. ) tambin es mayor que el de la
leche (2,30 s mPa. ). Se puede mencionar entonces que la muestra de jugo de
carne utilizada es ms densa y ms viscosa que la muestra de leche. Es
importante mencionar que tanto la densidad como la viscosidad son
propiedades fsicas que caracterizan a cada sustancia, y que la una es
independiente de la otra.
4.2.4 Viscosidad de los sustratos al adicionar los concentrados
protenicos de bromelina
Para conocer si los concentrados protenicos de bromelina en etanol y NaCl
son funcionales como catalizadores, se realiz pruebas en muestras de
leche y jugo de carne, para ver si existe aceleracin de las reacciones de
hidrolisis de los enlaces peptdicos de las protenas de las muestras, y esto
se pudo comprobar mediante el aumento de su viscosidad.
Para la determinacin de la viscosidad de los sustratos con los concentrados
protenicos, se realizaron diferentes ensayos para establecer el mejor
intervalo de tiempos de toma de muestra, y se comprob que los datos ms
representativos son aquellos en los que se toman las muestras cada 2mins y
hasta los 20mins.
Al analizar las tablas A4 y A5 se observa que en el tiempo de toma de
muestra 0s, las muestras de leche ya varan su viscosidad, aumentando su
valor inicial de 2,30 mPa.s, a viscosidades mayores a los 3,00 mPa.s,
indicando que los concentrados protenicos con bromelina si estn
actuando.
54

En estas tablas se tambin se observa que la mayor viscosidad que alcanza
la leche con concentrado protenico que contiene bromelina en etanol (7,00
mPa.s) es mayor que la que contiene NaCl (5,67 mPa.s), lo que da a
entender que el concentrado con etanol acta de mejor forma que el NaCl
sobre el sustrato leche. Y esto se comprueba tambin ya que la viscosidad
inicial con etanol es mayor que la de NaCl, indicando que el concentrado
protenico con el alcohol se acopla ms rpidamente con el sustrato. Se
determina adems que los valores de viscosidad son directamente
proporcionales al tiempo de toma de muestra; es decir que la viscosidad
aumenta conforme pasa el tiempo de reaccin.

El mismo anlisis se realiza para las tablas A7 y A8, en donde se observa
que la viscosidad del jugo de carne es mayor cuando el concentrado
protenico que contiene bromelina en etanol acta sobre este (7,88 mPa.s)
que cuando acta el concentrado que contiene NaCl (6,17 mPa.s).
Con los datos presentados de viscosidad se puede establecer que la mejor
solucin extractora es el etanol y el sustrato en el que mejor acta es el
jugo de carne, lo que significa que este alcohol es un buen agente
precipitante de protenas (bromelina), obtenindose un concentrado de alto
rendimiento que permite la ruptura de una mayor cantidad de enlaces
peptdicos de las protenas del jugo de carne, en un menor tiempo que en la
leche y por lo tanto aumenta la viscosidad.
Para comprobar la efectividad de los concentrados protenicos de bromelina
realizados, se adquiri bromelina comercial, y se realiz los mismos
experimentos a nivel de laboratorio. Cabe mencionar que esta bromelina no
se encontraba pura, sino mezclada con otros compuestos, ya que es
utilizada como ablandadora de carnes.
Al analizar la tabla A6 y A9 se puede mencionar que se da una misma
tendencia de aumento de la viscosidad en funcin del tiempo como en los
55

casos anteriores, y se observa que el mejor sustrato en el que acta es el
jugo de carne con una viscosidad mxima de 9,13 mPa.s. Lo que si se
observa en los testigos, es que estos alcanzan valores ms altos de
viscosidad, indicando que las enzimas estn catalizando de mejor manera
las reacciones.
Se puede indicar que los concentrados protenicos con etanol y NaCl si
actan sobre los sustratos establecidos, puesto que se observa que la
tendencia de la curva es similar a aquella curva con bromelina comercial, la
diferencia que se puede notar es que esta ltima comienza a alcanzar su
velocidad mxima desde los 360s mientras que los concentrados
preparados comienzan su mayor actividad tiempo despus, desde
aproximadamente los 480s.
4.2.5 Actividad enzimtica
La actividad enzimtica indica la cantidad de enzima activa presente y su
nivel de actividad sobre el sustrato, es factible expresar esta actividad en
funcin de la viscosidad. Para su determinacin, se realiz una linealizacin,
con su correspondiente ecuacin a las viscosidades de los tiempos de toma
de muestra de 360s a 720s, esto debido a que es en este punto donde
comienza la mayor velocidad de reaccin. De la ecuacin b ax y , el
valor de la pendiente ) (a corresponde a la actividad enzimtica de los
concentrados protenicos al actuar sobre las muestras.
En la tabla A10 se puede observar los valores de la actividad enzimtica
obtenidos, en )
.
(
s
s mPa
donde se tiene una mayor actividad (0,0068) en la
muestra jugo de carne con bromelina comercial. Para las muestras de los
concentrados protenicos elaborados, se tiene la mayor actividad para el
jugo de carne con bromelina en etanol (0.00605), y la menor actividad para
la leche con bromelina en NaCl (0.00335). Se puede establecer entonces
56

que los dos solventes actan sobre los sustratos, pero el concentrado
protenico con etanol presenta mayor actividad enzimtica.
4.2.6 Grficas
Las grficas siempre permiten una mejor representacin de los resultados
obtenidos, en este caso la manifestacin visual de la relacin entre la
viscosidad y el tiempo de toma de muestra.
Curvas de reaccin enzimtica
Se puede observar las curvas de reaccin enzimtica, en donde el
concentrado protenico comienza a actuar sobre el sustrato con una
velocidad inicial, la cual se va incrementando hasta alcanzar una velocidad
mxima, representando as su mayor actividad; en los ltimos segundos la
curva se vuelve asinttica, es decir donde la enzima comienza a inactivarse,
ya que se pretende que se ha formado casi por completo el producto.
En todas las grficas se da la misma tendencia, pero en algunas, como en el
caso de las muestras de jugo de carne, se observa una mejor recta en el
punto en que inicia la velocidad mxima de reaccin hasta antes de volverse
asinttica.
Al analizar estas grficas, lo que representan es que el concentrado
protenico de bromelina comienza a coagular la leche, es decir que se
hidrolizan las protenas (casena, beta-lactoglobulina, alfa-lactoalbmina,
lactoferrina, lactoperoxidasa, inmunoglobulinas) en pptidos ms simples o
en ltimo trmino en aminocidos (producto), esto mediante la ruptura de los
enlaces peptdicos, y por ende la viscosidad de la muestra va aumentando
en funcin al tiempo. Lo mismo ocurre en el caso del jugo de carne, pero
aqu se da la hidrlisis de las protenas actina, miosina, colgeno, reticulina
y elastina.
57

Se puede demostrar entonces, que con el etanol se da una mayor hidrlisis
de protenas tanto de la leche como del jugo de carne, esto debido a que su
concentrado presenta buena afinidad con los sustratos. Con la solucin
salina tambin se da la hidrlisis de enlaces peptdicos, pero requiere de
mayor tiempo para concluir con su funcin cataltica.
Regresin polinmica de orden 3
En las grficas se puede observar adems la lnea de tendencia del tipo
polinmica de orden 3, que es la que ms se ajusta a esta curva, ya que se
ajusta a 4 restricciones (punto, ngulo o curvatura). En la ecuacin
polinmica d cx bx ax y
2 3
, el primer intercepto ) (d corresponde al
efecto inicial de la enzima es decir al perodo de reconocimiento de sustrato,
el segundo ) (cx corresponde al perodo de atemperamiento de la enzima, el
tercero ) (
2
bx y el ms importante ya que es donde se da la velocidad
mxima de reaccin y se producen la mayora de cambios, y el cuarto ) (
3
ax
que es donde se produce la ltima curvatura, en donde esta ya tiende a
volverse asinttica.
Se puede observar las ecuaciones, las mismas que son diferentes para cada
solucin extractora, y sustrato sobre el cual actan, debido a que en cada
minuto, cada concentrado de bromelina ya sea en etanol o NaCl actan de
diferente manera. Lo que se puede notar es que los valores de la ecuacin
polinmica son ms altos en relacin al mejor tratamiento, y viceversa.
Regresin lineal: Actividad enzimtica
La tendencia lineal b ax y es aplicada a las viscosidades que pertenecen
a la velocidad mxima de accin de la enzima sobre el sustrato, es decir los
tiempos desde 360s a 720s. En las grficas se presenta la ecuacin (en
58

donde la pendiente ) (a corresponde al valor de actividad enzimtica) y el
valor R cuadrado.
Los mejores valores de actividad enzimtica son 0,0068 mPa.s/s y
0,0061 mPa.s/s que corresponden a la actividad de la bromelina comercial
en jugo de carne y en leche, respectivamente. Sin embargo los
concentrados protenicos de bromelina elaborados, tambin presentan altos
valores de actividad, como es 0,0061 mPa.s/s para el concentrado con
bromelina en etanol sobre la muestra de jugo de carne. Este corresponde al
mejor tratamiento, y se observa que presenta un valor muy prximo al de la
bromelina comercial, sin embargo el resto de muestras presentan valores
inferiores a 0,0060; lo que indica que presentan menor actividad.
Se puede establecer entonces que los valores de la viscosidad de las
muestras, si permiten obtener los valores de actividad enzimtica de los
concentrados protenicos de bromelina en base a una regresin lineal.
4.2.7 Anlisis estadstico
Se realiz un diseo factorial 2
2
con el objetivo de establecer cuales son los
niveles ms ptimos de las soluciones extractoras y sustratos protenicos.
Se obtuvo como resultados al nivel bajo (-1,0) de las soluciones extractoras
y al nivel alto (+1,0) de los sustratos protenicos como los niveles ms
ptimos para la obtencin de mejores resultados. Estos niveles
corresponden al etanol y al jugo de carne, lo que se corrobora con los
resultados presentados anteriormente, a que el etanol es la mejor solucin
extractora de bromelina, y acta de mejor manera como catalizador en la
reaccin de hidrlisis de enlaces peptdicos de las protenas del jugo de
carne, por ende maximizando la actividad enzimtica.
En la grfica de optimizacin, se observa como el etanol es una mejor
solucin extractora de bromelina que el NaCl, y que en el jugo de carne
59

acta de mejor manera que en la leche. Cabe mencionar que entre las
soluciones extractoras hay mayor diferencia significativa que entre los
sustratos protenicos.
En la grfica de respuesta de superficie, se observa el comportamiento en
tres dimensiones de la combinacin entre soluciones y sustratos de nivel
bajo y nivel alto. Se nota claramente que entre el nivel bajo (etanol) y el nivel
alto (jugo de carne) hay una mejor interaccin, que entre el resto de niveles,
y esto es porque presentan una superficie amplia y una linealizacin.
Debido a que se present la oportunidad de trabajar con una bromelina
comercial, se ejecut un diseo de bloques completos para establecer cual
es el mejor tratamiento; dentro de estos se involucr a la bromelina
comercial y a los concentrados protenicos elaborados. La tabla ANOVA nos
permiti saber que si existe diferencia significativa de los tratamientos,
puesto que RV>Ft, es decir 1305,470 > 3,204, lo que significa que cada
tratamiento es diferente, motivo por el cual hay variacin de la actividad
enzimtica, puesto que un tratamiento es mejor que otro.
Como se determin que si existe diferencia significativa, se realizo la prueba
de comparacin mltiple Tukey con un intervalo de confianza del 95%, para
establecer cual es el mejor tratamiento. Al realizar el anlisis en el software
StatGraphics, establecimos que el mejor tratamiento es el #6, que
corresponde al testigo 2 (Actividad enzimtica del jugo de carne al actuar la
bromelina comercial), seguido del tratamiento 5 que corresponde al testigo 1
(Actividad enzimtica de la leche al actuar la bromelina comercial). Se puede
observar claramente que los mejores tratamientos son aquellos en los que
interviene la bromelina comercial, sin embargo los tratamientos en los que
intervienen los concentrados protenicos de bromelina elaborados tambin
presentan buenos resultados, ya que se observan valores de actividad
enzimtica prximos al de los de bromelina comercial.
60

De los concentrados protenicos elaborados, se observa que el mejor
tratamiento es el #3, que corresponde a la actividad enzimtica del jugo de
carne al actuar el concentrado protenico de bromelina en etanol. Le sigue el
tratamiento 1, posteriormente el tratamiento 4, y por ltimo el tratamiento 2,
como se observa en la tabla C3.
En la grfica C3 se observa la representacin de los seis tratamientos antes
mencionados, en donde se nota que con el tratamiento 3 se obtienen muy
buenos resultados, puesto que se encuentra muy cercano a los valores de
los tratamientos con bromelina comercial. Se puede establecer que la
diferencia existente, es debido a que las enzimas elaboradas no se
encuentran purificadas ya que para esto se requiere de equipos de alta
tecnologa, sin embargo, los resultados obtenidos son muy satisfactorios.
Se realiz una tabla ANOVA con los datos del diseo experimental 2
2
y
diseo de bloques completos para as poder establecer si se acepta o se
rechaza la hiptesis planteada. Debido a que los valores de Ft son menores
a los de Rv, se rechaza la Ho y se acepta la Ha, indicando que las
soluciones extractoras, los sustratos protenicos, el testigo 1 y el testigo 2, si
presentan diferencia significativa en la actividad enzimtica.
4.3 Verificacin de la hiptesis
Los valores de Rv son mayores que los de Ft, ubicndose estos en la curva
de Fisher en la zona de rechazo, motivo por el cual se rechaza la Hiptesis
nula que indica que las soluciones extractoras no conducen a la obtencin
de un concentrado de bromelina a partir de pulpa pia, medida por la
actividad enzimtica, y se acepta la hiptesis alternativa que indica que las
soluciones extractoras si conducen a la obtencin de un concentrado de
bromelina a partir de pulpa pia, medida por la actividad enzimtica.

61

CAPTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones

Esta investigacin ha demostrado que la pia adems de poseer
caractersticas nutricionales, tambin tiene actividad proteoltica debido a
la enzima bromelina. Los resultados obtenidos de la investigacin son
prometedores para que con un mayor grado de purificacin, la bromelina
sea factible aplicar en varias reas de la industria.

Para la extraccin de bromelina a partir de pulpa de pia se pueden
utilizar algunos agentes precipitantes de protenas, como alcoholes o
sales. Esta investigacin utiliz al alcohol y a la sal ms comn como son
el etanol, y el NaCl respectivamente. Con los resultados obtenidos, se
pudo concluir que ambos concentrados de bromelina actan como
proteasas, pero el concentrado con etanol presenta mayor funcin
cataltica que el concentrado con NaCl.

La determinacin de la actividad enzimtica de una proteasa es factible
realizarse basndose en el mtodo de coagulacin de la leche,
propuesto por Balls y Hoover, el mismo que fue aplicado a la muestra de
leche, en la cual se observ que los concentrados protenicos si
62

hidrolizaron los enlaces peptdicos de sus protenas, principalmente la
casena. Este mtodo fue adaptado al jugo de carne, y se obtuvieron
buenos resultados ya que tambin se dio la hidrlisis de sus protenas
(actina), y esto se noto por la variacin de su viscosidad.

Consideramos como fluidos newtonianos a los sustratos utilizados, leche
y jugo de carne, motivo por el cual se emple el viscosmetro de Cannon
Fenske para la determinacin de su viscosidad al adicionar los
concentrados protenicos de bromelina. Se pudo observar que existe un
incremento de la viscosidad a medida que pasa el tiempo de reaccin, lo
que indica que los concentrados de bromelina si funcionan como
catalizadores ya que efectan la hidrlisis de los enlaces peptdicos. Se
puede concluir que mejores resultados se obtuvieron en las muestras de
jugo de carne, ya que se dio un mayor aumento de su viscosidad en
menor tiempo, indicando que las enzimas se acoplaron rpidamente al
sustrato.

Para la comprobacin de la efectividad de los concentrados protenicos
de bromelina elaborados, se aplic el mismo procedimiento de
determinacin de actividad enzimtica utilizando bromelina comercial, la
cual no se encontraba pura, ya que es utilizada como ablandadora de
carnes. Se pudo observar que las curvas de reaccin enzimtica
presentaron la misma tendencia que las de los concentrados de
bromelina elaborados, y se obtuvo mejores resultados en el jugo de
carne. Se puede concluir entonces que con la metodologa aplicada de
obtencin de enzimas vegetales si se obtienen resultados de alto
rendimiento.

Utilizando un mtodo grfico de regresin se determin la actividad
enzimtica de los sustratos protenicos en funcin a la variacin de su
viscosidad con el tiempo. Se puede concluir que existe una mayor
63

actividad enzimtica del concentrado de bromelina en etanol sobre la
muestra de jugo de carne y la de leche, mientras que valores de
actividad enzimtica inferiores presenta el concentrado protenico de
bromelina en NaCl. Se puede observar entonces que el valor ms alto de
actividad enzimtica 0,0061mPa.s/s corresponde al concentrado con
etanol en el jugo de carne, y este valor se encuentra muy prximo a los
obtenidos con bromelina comercial, lo que indica que se obtuvieron
resultados satisfactorios.

5.2 Recomendaciones

Las industrias ecuatorianas, principalmente las alimentarias,
farmacuticas y textiles, deben enfocarse en la utilizacin de enzimas
vegetales para acelerar sus procesos industriales, y con la aplicacin de
la biotecnologa, obtener productos de excelente calidad.

Es importante conocer la clase de enzimas a extraer, y la funcin que
van a desempear sobre el sustrato, para as utilizar las soluciones
extractoras ms apropiadas, permitiendo la precipitacin de las protenas
deseadas. Se requiere adems tener en consideracin la concentracin
de dichos agentes precipitantes.

Si se desea aplicar proteasas sobre otros sustratos diferentes a la leche,
es necesario estudiar cmo el principio propuesto por Balls y Hoover se
puede adaptar a estos sustratos, y comprobar que las enzimas
provoquen la hidrlisis de los enlaces peptdicos.

Cuando se determina la viscosidad de los sustratos, es importante utilizar
viscosmetros con tamaos de bulbo capilar adecuados y que se
encuentren en relacin a la viscosidad de la muestra; es necesario
adems emplear diferentes sustratos para determinar en cual se acoplan
64

mejor los concentrados de bromelina, siempre tomando en cuenta la
estandarizacin de los sustratos, para obtener datos ms confiables.

Para comprobar la efectividad de los resultados que se obtienen de una
fase experimental, es importante utilizar testigos o patrones, que
permitan corroborar los datos obtenidos de la experimentacin. Es
recomendable adems utilizar paquetes estadsticos que concedan el
correcto anlisis de los resultados obtenidos y as poder establecer los
mejores tratamientos.

Es recomendable en prximas investigaciones realizar la purificacin del
concentrado de bromelina extrado con etanol, pues es el que present
mayor actividad enzimtica, y se acopl a dos sustratos diferentes. El
mtodo de purificacin a emplear deber ser seleccionado de acuerdo a
las propiedades de la proteasa, y en funcin a las aplicaciones en las
que se desee emplear.

65

CAPTULO VI
PROPUESTA

6.1 Datos informativos
Ttulo: Purificacin del concentrado protenico de bromelina extrado con
etanol mediante cromatografa de intercambio inico, y determinacin de su
actividad enzimtica en sustratos protenicos.
Institucin Ejecutora: Universidad Tcnica de Ambato - Facultad de
Ciencia e Ingeniera en Alimentos.
Beneficiarios: Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos, personas
interesadas en el estudio de las enzimas e industrias que deseen aplicar
tecnologa enzimtica.
Ubicacin: Laboratorio de Ingeniera de Procesos FCIAL.
Tiempo estimado para la ejecucin: 8 meses
Costo: $ 3685,50 aproximadamente

66

6.2 Antecedentes de la propuesta
La produccin de pia en Ecuador ha evolucionado favorablemente en la
ltima dcada gracias a las excelentes condiciones para el cultivo de esta
fruta, en el perodo de 2005 a 2010 se registr un incremento del 6.40% en
la superficie cosechada, mientras que la produccin de la fruta fresca
medida en toneladas mtricas ha tenido un crecimiento del 4.09%.
Las variedades de pia (Anans) producidas en Ecuador son las siguientes:
- Cayena Lisa, ms conocida como Champaca o Hawaiana, utilizada
mayormente en la agroindustria.

- Golden Sweet o tambin conocida como MD2, la cual se caracteriza por
su sabor dulce, tamao y aroma. Esta variedad es la ms exportada en
Ecuador (PROECUADOR, 2011).
Dentro de la cadena de valor de la pia, el Ecuador se encuentra,
principalmente, en el eslabn agrcola y recin est incursionando en la
etapa industrial (UTEPI, 2006).
La pia es una fruta tropical de la familia de las bromeliaceae la cual tiene
actividad proteoltica debida a la bromelina contenida (EC 3.4.22.33), que es
una glicoprotena del grupo de las cisten proteasas. Es una protena
constituida por aminocidos que se encuentran enrollados en dos partes
separadas por un puente que tiene un lugar activo con un grupo tiol (SH)
libre. Esta fraccin enzimtica cida acta hidrolizando protenas como la
casena, la hemoglobina y la gelatina (ELICER, 2003).
La obtencin de bromelina se realiza a partir de pulpa de pia, en donde los
procedimientos de extraccin se caracterizan en general por realizarse a
bajas temperaturas, y precipitar la enzima empleando solventes orgnicos o
sales (CHVEZ y otros, 1995).
67

La bromelina presenta un amplio espectro de acciones en varias reas de la
industria y a nivel de la medicina, lo que le ha convertido en una de las
cisten proteasas ms estudiadas, motivo por el cual su purificacin es un
paso muy importante posterior a la extraccin (ELICER, 2003).
La purificacin de enzimas consiste es una serie de procesos que permiten
aislar un slo tipo de protena de una mezcla compleja. La purificacin por
cromatografa ha sido una prctica de laboratorio durante muchos aos.
Estos mismos procedimientos cromatogrficos pueden ser empleados de
forma similar para el aislamiento de cantidades muy superiores de protenas.
La cromatografa es la nica metodologa con la selectividad suficiente para
purificar una protena de una mezcla proteica compleja con un grado de
purificacin final superior al 99,8% (RODAS, 2010).
6.3 Justificacin
Es importante y necesario dar un mayor valor a las frutas cultivadas en
nuestro pas que tienen principios activos, los cuales se conocen que
presentan gran cantidad de aplicaciones en diferentes reas de la industria,
y a nivel medicinal.
La pia es una de las frutas con alto valor nutricional a ms de contener a la
bromelina, que es una enzima proteasa con alta funcionalidad ya que
hidroliza las cadenas polipeptdicas de las protenas sustrato.
La bromelina tiene una potencial aplicacin en la biotecnologa,
emplendose de forma general para hidrolizar protenas y especficamente,
por ejemplo, para la elaboracin de medios de cultivo y la obtencin de
hidrolizados proteicos; en la alimentacin en el ablandamiento de carnes, la
hidrlisis de gelatina, la clarificacin de la cerveza, hidrlisis del grano de
soya y otros, mientras que en la medicina son empleadas como
antinflamatorio, digestivo, para facilitar el transporte de antibiticos en el
68

organismo, en la lisis de clulas tumorales, para eliminar tejidos necrosados;
asumiendo adems una creciente significacin en estudios relacionados con
la regulacin biolgica (CHVEZ y otros, 1995).
Debido a las varias aplicaciones que tiene la enzima bromelina, y a la
disponibilidad de la pia durante todo el ao en el pas, se ha propuesto
realizar la purificacin del concentrado protenico de bromelina extrado con
etanol, mediante cromatografa de intercambio inico. Esto es importante
realizar debido a que se obtuvo resultados satisfactorios en la fase de
extraccin y concentracin de la bromelina, proponiendo que se aplique la
metodologa adecuada de cromatografa y as evaluar el porcentaje de
purificacin alcanzado de la enzima, ya que este mtodo es ideal porque los
intercambiadores celulsicos inicos son ideales para diversas operaciones
como primera etapa en varios procesos.
La creciente apertura comercial, impone al pas el desafo de incorporarse
de manera cada vez ms intensa a las corrientes internacionales del
conocimiento, el desarrollo de ciencia y tecnologa, la transferencia
tecnolgica y la innovacin.
6.4 Objetivos

6.4.1 General
Determinar la actividad enzimtica del concentrado protenico de bromelina
purificado.
6.4.2 Especficos

- Cuantificar las protenas del concentrado protenico de bromelina
extrado con etanol, mediante el mtodo de Lowry.

69

- Purificar el concentrado protenico de bromelina extrado con etanol,
mediante cromatografa de intercambio inico.

- Determinar la actividad enzimtica del concentrado protenico de
bromelina en los sustratos de hidrlisis, leche y jugo de carne, mediante
variacin de su viscosidad.

6.5 Anlisis de factibilidad
El proyecto de investigacin se relaciona con la rama de la bioqumica y en
particular con lo referente a la obtencin de enzimas con actividad
proteoltica y su aplicacin, adems, con la Biotecnologa, la Industria
Alimenticia y la Medicina.
El presente estudio es de tipo investigativo y tecnolgico ya que se puede
implementar una nueva metodologa confiable para la obtencin de un
concentrado de bromelina por precipitacin alcohlica, y su purificacin
mediante cromatografa de intercambio inico, alcanzando una enzima con
excelente actividad. Esto es, comprobndose su catlisis ya que acelera la
hidrlisis de los enlaces peptdicos de la leche y del jugo de carne, y esto se
puede determinar por la variacin de su viscosidad.
La obtencin de proteasas influye adems en el mbito econmico ya que
enzimas purificadas pueden ser empleadas en la industria para mejorar los
procesos y as obtener nuevos productos de alta calidad.
Es de carcter investigativo ya que la metodologa empleada y los valores
de actividad enzimtica obtenidos de la evaluacin son importantes porque
permiten continuar con estudios o contribuyen a otros tipos de
investigaciones relacionadas con el tema.

70

Tabla 5. Costos de la propuesta de investigacin
CONCEPTO VALOR ($)
Recursos humanos 430,00
Recursos materiales
Materia prima 30,00
Reactivos 200,00
Instrumentos 350,00
Equipos 2400,00
tiles de oficina 100,00
Subtotal 3510,00
Imprevistos 5% 175,50
Total 3685,50
6.6 Fundamentacin
La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la purificacin,
al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere
generalmente un gran esfuerzo ya que una clula contiene miles de
sustancias diferentes, la molcula que buscamos puede ser extremamente
inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas.
Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga,
tamao o afinidad de las diferentes protenas. Uno de los mtodos ms
habitualmente utilizados para la separacin de protenas es la cromatografa
en columna, aunque tambin existe la cromatografa en papel y en placa.
La columna est rellena con un material slido con las caractersticas
qumicas adecuadas (fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace
pasar a travs de la columna (fase mvil). El extracto crudo se aplica en la
71

parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con
la fase mvil. Cada protena migrar a distinta velocidad segn su grado de
afinidad por la fase estacionaria.
Generalmente estas cromatografas se realizan de una forma
semiautomtica, la fase mvil se hace pasar a la columna a travs de una
bomba peristltica y un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que
sale de columna. Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto
nmero de gotas o de volumen. Despus hay que localizar en que tubo o
tubos est la protena que se pretende purificar.
El tipo de cromatografa que se propone utilizar para la purificacin del
concentrado de bromelina es la de intercambio inico, debido a que
presenta caractersticas como: Alta resolucin, de fcil uso, resultados
altamente reproducibles y de bajo costo.
Cromatografa de intercambio inico:
En ella, la columna est rellena con un soporte al que van unidos grupos
cargados positivamente (intercambio aninico) o negativamente (intercambio
catinico). Estos grupos cargados normalmente estn neutralizados por
iones del tampn. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las
protenas con ms tendencia a unirse al soporte. Las protenas cargadas
pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catinicos o aninicos
dependiendo de su carga neta. Las protenas ms cargadas se unirn ms
fuertemente al intercambiador y por lo tanto sern ms difciles de eluir. La
afinidad con la que una protena se une a un intercambiador inico depende
de la fuerza inica del medio, debido a la competencia entre los grupos
cargados de la protena y los iones de la fase mvil.
Una vez pegadas las protenas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se
suele ir subiendo la fuerza inica de la fase mvil (aumentando la
72

concentracin de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las protenas
mas dbilmente retenidas y cuando la fuerza inica sea mayor saldrn las
protenas ms cargadas y por lo tanto ms retenidas.

Fig 6. Cromatografa de intercambio inico (ITESCAM, s.f).

6.7 Metodologa
Para la purificacin del concentrado con bromelina extrado con etanol, y la
determinacin de su actividad enzimtica en sustratos protenicos, se
seguir el siguiente modelo operativo:
73

Tabla 6. Modelo operativo (Plan de accin)
FASES METAS ACTIVIDADES RESPONSABLES RECURSOS PRESUPUESTO TIEMPO
1. Formulacin de
la propuesta
Purificar el
concentrado protenico
de bromelina y
determinar su
actividad enzimtica
en sustratos
protenicos.
Revisin bibliogrfica Investigador
Humanos
Tcnico
Econmicos
450 2 meses
2.Desarrollo
preliminar de la
propuesta
Cronograma de la
propuesta
Pruebas preliminares
de la purificacin del
concentrado de
bromelina
Investigador
Humanos
Tcnico
Econmicos
600 1 mes
3. Implementacin
de la propuesta
Ejecucin de la
propuesta
Determinar la
viscosidad de los
sustratos al aplicar la
enzima
Investigador
Humanos
Tcnico
Econmicos
2500 3 meses
4. Evaluacin de
la propuesta
Comprobacin de la
metodologa
implementada
Determinacin de la
actividad enzimtica
Investigador
Humanos
Tcnico
Econmicos
135 2 meses
74

6.8 Administracin
La ejecucin de la propuesta estar coordinada por los responsables del
proyecto de investigacin Ing. Juan Alvarado y Egda. Violeta Dalgo F.

Tabla 7. Administracin de la propuesta
INDICADORES
A MEJORAR
SITUACIN
ACTUAL
RESULTADOS
ESPERADOS
ACTIVIDADES RESPONSABLE
Determinacin
de la actividad
enzimtica del
concentrado
protenico de
bromelina por
viscosidad
Aplicacin de
mtodos
espectromtricos
de alto costo
Concentrado de
bromelina con
alto nivel de
actividad sobre
los sustratos.
Datos confiables
de la actividad
enzimtica.
Optimizacin de
la metodologa
planteada.
Cuantificar las
protenas del
concentrado de
bromelina.
Purificar el
concentrado de
bromelina.
Utilizando
ecuaciones lineales,
evaluar la actividad
enzimtica del
concentrado en
funcin a la
variacin de su
viscosidad.
Investigadores:
Ing. Juan
Alvarado
Egda. Violeta
Dalgo

75

6.9 Previsin de la evaluacin

Tabla 8. Previsin de la evaluacin
PREGUNTAS BSICAS EXPLICACIN
Quines solicitan evaluar?
Estudiantes de la facultad, interesados
en el rea de enzimologa e industrias
que deseen aplicar tecnologa
enzimtica.
Por qu evaluar?
Provee informacin tcnica de
importancia para la extraccin y
purificacin de enzimas vegetales.
Para qu evaluar?
Para establecer la actividad
enzimtica de la bromelina sobre los
sustratos
Qu evaluar?
Catlisis de la bromelina sobre los
sustratos
Quin evala?
Tutor del proyecto
Calificadores
Cundo evaluar?
Todo el tiempo, desde las pruebas
preliminares hasta la fase final de
experimentacin
Cmo evaluar? Mediante instrumentos de evaluacin
Con qu evaluar?
Experimentacin
Datos bibliogrficos

76

MATERIALES DE REFERENCIA
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Mxico. Pgs. 38 49.
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Bioqumica, Universidad Tcnica de Ambato. Ambato, Ecuador. 60pp.
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ROBAYO, F., DE LA CRUZ, C., VILLAVICENCIO, C., ALVARADO, J. 2011.
Variacin de la actividad enzimtica de tres proteasas de origen vegetal,
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Alimentos de la Universidad Tcnica de Ambato. Vol. 19. Pgs. 90 95.
SINGH, P & HELDMAN, D. 1998. Introduccin a la ingeniera de los
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Pia Estudio agroindustrial en el Ecuador. Disponible en:
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WISEMAN, A. 1985. Manual de Biotecnologa de los Enzimas. Segunda
edicin. Ed. Acribia S.A. Zaragoza Espaa. Pgs. 48 63.

ANEXOS

ANEXO A

TABLAS DE
RESULTADOS

Tabla A1. Valores de humedad y materia seca de los concentrados
protenicos de bromelina extrados con etanol y NaCl.
Muestra * Humedad (%) * Materia seca (%)
Concentrado de
bromelina en etanol
8,1 91,9
Concentrado de
bromelina en NaCl
5,6 94,4
* Valores promedios de dos rplicas y por duplicado.
Fuente: Laboratorio de Ingeniera de Procesos

Tabla A2. Constante K de los viscosmetros Cannon - Fenske para la
medida de viscosidad.

Viscosmetro

* Tiempo de
escurrido del
agua
t (s)

Viscosidad

Densidad

Constante K

1 634,5 9,9341E-01 998,2 1,5685E-06
2 6,0 9,9341E-01 998,2 1,6587E-04
3 294,0 9,9341E-01 998,2 3,3851E-06
4 35,5 9,9341E-01 998,2 2,8034E-05
5 72,5 9,9341E-01 998,2 1,3727E-05
6 33,0 9,9341E-01 998,2 3,0158E-05
7 75,5 9,9341E-01 998,2 1,3182E-05
8 78,8 9,9341E-01 998,2 1,2638E-05
9 35,0 9,9341E-01 998,2 2,8434E-05

(
3
)
(. )
(.
)

Tabla A3. Densidad y viscosidad de la leche y jugo de carne.
Sustrato
Densidad
) (
3
m
kg

Viscosidad

) . ( s mPa
Leche
1030 2,30
Jugo de carne 1038 2,52

Tabla A4. Viscosidad de la leche al adicionar el concentrado protenico de
bromelina extrado con etanol.

Tiempo de toma
de muestra
t (s)

* Tiempo de
escurrido
t (s)
Constante K

Densidad Viscosidad

0 116,3 2,8034E-05 1030 3,36
120 122,0 2,8034E-05 1030 3,52
240 133,3 2,8034E-05 1030 3,85
360 146,3 2,8034E-05 1030 4,22
480 164,3 2,8034E-05 1030 4,74
600 187,5 2,8034E-05 1030 5,41
720 211,0 2,8034E-05 1030 6,09
840 223,0 2,8034E-05 1030 6,44
960 234,5 2,8034E-05 1030 6,77
1080 238,8 2,8034E-05 1030 6,89
1200 242,3 2,8034E-05 1030 7,00

(.
) (. )
(
3
)

Tabla A5. Viscosidad de la leche al adicionar el concentrado protenico de
bromelina extrado con NaCl.

Tiempo de toma
de muestra
t (s)

* Tiempo de
escurrido
t (s)
Constante K

Densidad Viscosidad

0 106,8 2,8034E-05 1030 3,08
120 113,5 2,8034E-05 1030 3,28
240 125,3 2,8034E-05 1030 3,62
360 137,0 2,8034E-05 1030 3,96
480 147,8 2,8034E-05 1030 4,27
600 162,8 2,8034E-05 1030 4,70
720 178,5 2,8034E-05 1030 5,15
840 185,3 2,8034E-05 1030 5,35
960 190,8 2,8034E-05 1030 5,51
1080 193,5 2,8034E-05 1030 5,59
1200 196,3 2,8034E-05 1030 5,67
* Valores promedios de dos rplicas y por duplicado

(.
) (. )
(
3
)

Tabla A6. Viscosidad de la leche al adicionar bromelina comercial.

Tiempo de toma
de muestra
t (s)

* Tiempo de
escurrido
t (s)
Constante K

Densidad Viscosidad

0 142,5 2,8034E-05 1030 4,12
120 154,5 2,8034E-05 1030 4,46
240 164,8 2,8034E-05 1030 4,76
360 184,5 2,8034E-05 1030 5,33
480 209,5 2,8034E-05 1030 6,05
600 239,5 2,8034E-05 1030 6,92
720 264,5 2,8034E-05 1030 7,64
840 280,0 2,8034E-05 1030 8,09
960 290,5 2,8034E-05 1030 8,39
1080 290,8 2,8034E-05 1030 8,40
1200 291,0 2,8034E-05 1030 8,40

(.
) (. )
(
3
)

Tabla A7. Viscosidad del jugo de carne al adicionar el concentrado
protenico de bromelina extrado con etanol.

Tiempo de toma
de muestra
t (s)

* Tiempo de
escurrido
t (s)
Constante K

Densidad Viscosidad

0 126,8 2,8034E-05 1038 3,69
120 135,5 2,8034E-05 1038 3,94
240 147,0 2,8034E-05 1038 4,28
360 162,8 2,8034E-05 1038 4,74
480 182,0 2,8034E-05 1038 5,30
600 207,8 2,8034E-05 1038 6,05
720 237,0 2,8034E-05 1038 6,90
840 252,3 2,8034E-05 1038 7,34
960 262,5 2,8034E-05 1038 7,64
1080 267,5 2,8034E-05 1038 7,79
1200 270,8 2,8034E-05 1038 7,88

(.
) (. )
(
3
)

Tabla A8. Viscosidad del jugo de carne al adicionar el concentrado
protenico de bromelina extrado con NaCl.

Tiempo de toma
de muestra
t (s)

* Tiempo de
escurrido
t (s)
Constante K

Densidad Viscosidad

0 112,5 2,8034E-05 1038 3,27
120 119,0 2,8034E-05 1038 3,46
240 127,3 2,8034E-05 1038 3,70
360 141,3 2,8034E-05 1038 4,11
480 157,0 2,8034E-05 1038 4,57
600 176,0 2,8034E-05 1038 5,12
720 192,8 2,8034E-05 1038 5,61
840 200,5 2,8034E-05 1038 5,84
960 204,5 2,8034E-05 1038 5,95
1080 208,5 2,8034E-05 1038 6,07
1200 212,0 2,8034E-05 1038 6,17

(.
) (. )
(
3
)

Tabla A9. Viscosidad del jugo de carne al adicionar bromelina comercial.

Tiempo de toma
de muestra
t (s)

* Tiempo de
escurrido
t (s)
Constante K

Densidad Viscosidad

0 166,3 2,8034E-05 1038 4,84
120 177,5 2,8034E-05 1038 5,17
240 189,5 2,8034E-05 1038 5,51
360 207,3 2,8034E-05 1038 6,03
480 230,5 2,8034E-05 1038 6,71
600 261,0 2,8034E-05 1038 7,60
720 290,5 2,8034E-05 1038 8,45
840 303,0 2,8034E-05 1038 8,82
960 312,5 2,8034E-05 1038 9,09
1080 313,5 2,8034E-05 1038 9,12
1200 313,8 2,8034E-05 1038 9,13

(.
) (. )
(
3
)

Tabla A10. Valores de la actividad enzimtica de los sustratos de hidrlisis
con concentrados protenicos de bromelina.
Sustrato
Actividad enzimtica )
.
(
s
s mPa

Rplica 1 Rplica 2 Promedio
Leche Bromelina en etanol 0,0052 0,0053 0,00525
Leche Bromelina en NaCl 0,0034 0,0033 0,00335
Leche Bromelina comercial 0,0065 0,0065 0,00650
Jugo de carne Bromelina en etanol 0,0061 0,0060 0,00605
Jugo de carne Bromelina en NaCl 0,0042 0,0042 0,00420
Jugo de carne Bromelina comercial 0,0068 0,0068 0,00680

ANEXO B

GRFICAS

efecto de bromelina extrada con etanol, con la correspondiente ecuacin

y = -5E-09x
3
+ 8E-06x
2
+ 0,0001x + 3,3674
R = 0,9979
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)
y = 0,0052x + 2,2923
R = 0,9963
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
240 360 480 600 720
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)

efecto de bromelina extrada con NaCl, con la correspondiente ecuacin

y = -3E-09x
3
+ 4E-06x
2
+ 0,0015x + 3,07
R = 0,9974
3,00
4,00
5,00
6,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)
y = 0,0034x + 2,7067
R = 0,993
3,00
4,00
5,00
6,00
240 360 480 600 720
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)

efecto de bromelina comercial, con la correspondiente ecuacin polinmica
de regresin.

y = -7E-09x
3
+ 1E-05x
2
+ 0,0006x + 4,1417
R = 0,9973
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)
y = 0,0065x + 2,9745
R = 0,9986
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
240 360 480 600 720
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)

tiempo por efecto de bromelina extrada con etanol, con la correspondiente

y = -6E-09x
3
+ 1E-05x
2
+ 0,0001x + 3,7264
R = 0,9972
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)
y = 0,006x + 2,4898
R = 0,9918
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
240 360 480 600 720
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)

tiempo por efecto de bromelina extrada con NaCl, con la correspondiente

y = -4E-09x
3
+ 5E-06x
2
+ 0,001x + 3,2497
R = 0,995
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)
y = 0,0042x + 2,5807
R = 0,9988
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
240 360 480 600 720
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)

tiempo por efecto de bromelina comercial, con la correspondiente ecuacin
.
y = -7E-09x
3
+ 1E-05x
2
+ 0,0005x + 4,8708
R = 0,996
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)
y = 0,0068x + 3,5273
R = 0,9967
5,50
6,00
6,50
7,00
7,50
8,00
8,50
9,00
240 360 480 600 720
V
i
s
c
o
s
i
d
a
d

(
m
P
a
.
s
)

Tiempo (s)

ANEXO C

ANLISIS
ESTADSTICO

Tabla C1. Optimizacin del diseo factorial 2
2

FACTOR
NIVEL BAJO
(-1,0)
NIVEL ALTO
(+1,0)
PTIMO
Soluciones extractoras Etanol NaCl -1,0
Sustratos protenicos Leche Jugo de carne 1,0

Grfica C1. Optimizacin del diseo factorial 2
2

Grfica C2. Respuesta de superficie

Tabla C2. Diseo de bloques completos

Tabla C3. Prueba de comparacin mltiple Tukey al 95% para los diferentes
tratamientos
TRATAMIENTOS
AE
GRUPOS
HOMOGENEOS
Jugo de carne bromelina comercial 6 0,0068 A
Leche bromelina comercial 5 0,0065 B
Jugo de carne etanol 3 0,0061 C
Leche etanol 1 0,0053 D
Jugo de carne NaCl 4 0,0042 E
Leche NaCl 2 0,0034 F
FUENTE DE
VARIACIN
SUMA DE
CUADRADOS
GRADOS DE
LIBERTAD
CUADRADOS
MEDIOS
RAZN DE
VARIANZA
RV
Ft
FV SC GL CM
A: Observaciones 8,333E-10 1 8,333E-10 0,294 4,844
B: Tratamientos 1,849E-05 5 3,699E-06 1305,470 3,204
Residuo 1,417E-08 5 2,833E-09
Total 1,851E-05 11

Grfica C3. Prueba de Tukey al 95% para los tratamientos

Tabla C4. Cuadro de anlisis de varianza
FUENTE DE VARIACIN
SUMA DE
CUADRADOS
GRADOS DE
LIBERTAD
CUADRADOS
MEDIOS
RAZN DE
VARIANZA
RV
Ft
FV SC GL CM
A: Soluciones extractoras 7,031E-06 1 7,031E-06 2556,818 4,844
B: Sustratos protenicos 1,361E-06 1 1,361E-06 495,000 4,844
AB: Soluciones * Sustratos 1,250E-09 1 1,250E-09 0,455 4,844
Testigo 1 4,273E-06 1 4,273E-06 1553,787 4,844
Testigo 2 5,828E-06 1 5,828E-06 2119,104 4,844
Rplicas 1,250E-09 1 1,250E-09 0,455 4,844
Error 1,375E-08 5 2,750E-09
Total 1,851E-05 11

ANEXO D

FOTOGRAFAS

OBTENCIN DEL JUGO DE PIA

Fot D1. Seleccin de la pia Fot D2. Fraccionamiento
Fot D3. Molienda Fot D4. Jugo de pia
UTA / FCIAL / INGENIERA BIOQUMICA
LABORATORIO DE INGENIERA DE
PROCESOS

EXTRACCIN DE BROMELINA

Fot D5. Jugo de pia
con NaCl y etanol
Fot D6. Congelacin
Fot D7. Centrifugacin Fot D8. Precipitados
PROCESOS

CONCENTRACIN DE LA BROMELINA

Fot D9. Precipitados en NaCl y etanol Fot D10. Pesado
Fot D11. Secado Fot D12. Concentrados de bromelina en
NaCl y etanol
PROCESOS

PREPARACIN DE LA LECHE DESHIDRATADA

Fot D13. Pesado de la
leche
Fot D14. Mezcla en
agua a 40C
Fot D15. Densidad de
la leche
PROCESOS

VISCOSIDAD DE LA LECHE CON LOS CONCENTRADOS
PROTENICOS QUE CONTIENEN BROMELINA

Fot D16. Adicin del
concentrado protenico en la
leche
Fot D17. Muestras en
congelacin
Fot D18. Medicin de la
viscosidad de la leche
PROCESOS

OBTENCIN DEL JUGO DE CARNE

Fot D19. Molienda de la carne Fot D20. Obtencin del jugo
Fot D21. Filtracin Fot D22. Densidad del
jugo de carne
PROCESOS

VISCOSIDAD DEL JUGO DE CARNE CON LOS CONCENTRADOS
PROTENICOS QUE CONTIENEN BROMELINA

Fot D23. Adicin del
concentrado protenico en el
jugo de carne
Fot D24. Muestras en
congelacin
Fot D25. Medicin de la
viscosidad del jugo de carne
PROCESOS

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i

UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

= Densidad de referencia (agua a 20C).

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