FACULTAD DE INGENIRIA AGROINDUSTRIAL-JUANJUI

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

TRABAJO ENCARGADO

VITAMINAS
ASIGNATURA:
METODOS DE ANALISIS AGROINDUSTRIAL
DOCENTE:
ING.ENRIQUE TERLEIRA GARCIA
ALUMNO:
ALBERTO SANCHEZ ROSALES
JERRY ESCOBEDO USHIAHUA
JOEL TUANAMA ONORBE
MELISSA TARAZONA DIAZ
KALLY MARIZA CALDERON UPIACHIHUA




UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTIN- TARAPOTO

INTRODUCCION

El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un gran desafo para los
analistas dado que se asocia con problemas significativos. Muchos de estos
problemas han sido eliminados gracias a los recientes avances en la tecnologa
y el desarrollo de nuevos enfoques analticos. Todos los antiguos mtodos
biolgicos utilizados para determinar o incluso demostrar la actividad biolgica
de las vitaminas, han sido en la actualidad reemplazada por mtodos microbio-
lgicos (EMB). Los mtodos fisico-qumicos, principalmente la cromatografa
gas lquido (GLC) y la cromatografa lquida de alta presin (HPLC) han sido
aplicados para solucionar muchos problemas relacionados con el anlisis de
las vitaminas. En ellos se entrega una revisin de los mtodos que se estn
utilizando para la determinacin de las vitaminas en los alimentos. Vale la pena
mencionar que los procedimientos bsicos pueden en la mayora de los casos
aplicarse a los anlisis en los alimentos para animales siempre que se
consideren los ajustes correspondientes a los cambios de la matriz. Los
mtodos discutidos se aplican actualmente en la determinacin de las
vitaminas por muchos laboratorios. Algunos de los antiguos procedimientos no
son tratados en forma extensa dado que no satisfacen los requerimientos
actuales en relacin a exactitud, precisin y selectividad. Est claro que no se
mencionan en este artculo todos los detalles de los procedimientos. Analizar
vitaminas en los alimentos no es, a pesar de los recientes avances, una tarea
fcil y se necesita experiencia y los conocimientos adecuados para producir
resultados repro-ducibles, que sean exactos y vlidos.











Laboratorio y equipamiento
La mayora de las vitaminas son sensibles a la luz y algunas se oxidan muy
rpidamente. Por lo tanto, debera evitarse la luz solar directa y la luz brillante.
La iluminacin artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes
dorados. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberan
realizarse en material de vidrio mbar para prevenir la degradacin. Dado que
el calor tambin contribuye a la isomerizacin o a una posterior alteracin de
las vitaminas, debera evitarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse
cuidado que, por ejemplo, la evaporacin de los solventes se realice lo ms
suave posible utilizando un equipamiento adecuado como por ejemplo un
evaporador rotatorio con un buen control de la temperatura, un enfriamiento
adecuado de los condensadores y un vaco ptimo.
VITAMINAS LIPOSOLUBLES
Las vitaminas A, D, E, K y los carotenoides activos de provitamina A estn
siendo determinados principalmente utilizando HPLC. G.F.M. escrito una
amplia revisin de los ensayos de vitaminas liposolubles en alimentos.
Vitamina A
La vitamina A se utiliza como un nombre genrico para describir al retinol, sus
steres y los correspondientes ismeros. La vitamina A se encuentra
principalmente en productos animales tales como leche, crema, mantequilla,
queso, huevos, carne, hgado, rin y aceite de hgado de bacalao. Por lo
general, se encuentra como steres de cidos grasos de cadena larga pero
tambin se encuentra como retinol. Los alimentos son fortificados normalmente
con steres de retinol tales como acetato, palmitato o propionato utilizando
formulaciones especiales que mejoran la estabilidad.
a) Frmulas y propiedades
Frmula emprica
Retinol C
20
H
30
O
(P. molecular 286,5)
Acetato de retinol C
22
H
32
O
2

(P. molecular 328,5)
Palmitato de retinol C
36
H
60
O
2

(P. molecular 524,9)


Descripcin
Retinol: Polvo cristalino amarillo
(P. fusin 62-64C)
Acetato de retinol: Polvo cristalino amarillo brillante
(P. fusin 57-60C)
Palmitato de retinol: Polvo cristalino amarillo o aceite amarillo
(P. fusin 28-29C)
Espectro de absorcin
La vitamina A y los correspondientes steres muestran un espectro de
absorcin caracterstico, la posicin del pico mximo depende del solvente; en
isopropanol es a 326 nm, en ciclohexano es a 328 nm. El retinol tiene un
coeficiente de extincin (E 1% -1cm) = 1835 en etanol (5) y de 1826 en n-
hexano; este valor es vlido slo para el solvente mencionado; puede cambiar
significativamente con otros solventes.
Estabilidad
El retinol y sus steres son rpidamente destruidos por la luz, el oxgeno y los
cidos. Deben almacenarse en frascos mbar sellados con gas inerte (por
ejemplo: nitrgeno).
Unidades biolgicas
Una Unidad Internacional (UI) corresponde a la actividad de 0,344 g de acetato
de vitamina A puro cristalino; 0,300 g de retinol o 0,550 g de palmitato de
retinol corresponden a 1 UI. 1g de retinol es equivalente a 3,333 UI de
vitamina A.
b) Mtodo
Primeramente, se determinaba la vitamina A mediante una reaccin
colorimtrica de retinol con tricloruro de antimonio (reaccin de Carr-Price). El
retinol obtenido despus de saponificar y extraer los componentes no
saponificables tena que ser purificado utilizando cromatografa de columna
abierta con el fin de eliminar los componentes interferentes. La HPLC se ha
convertido en la actualidad en el mtodo de eleccin dado que esta tcnica
acorta considerablemente el procedimiento del anlisis y aumenta la
reproducibilidad y exactitud.



Saponificacin y extraccin
La mayora de los procedimientos de anlisis estn utilizando una etapa de
saponificacin antes de la extraccin con un solvente orgnico adecuado. Una
comparacin de los mtodos basada en los datos obtenidos en un estudio
colaborativo revela que las condiciones para la saponificacin pueden variar
dentro de ciertos lmites sin afectar los resultados. En generalmente 2-10 g de
la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrgeno utilizando una
mezcla de hidrxido de potasio acuoso, etanol o metanol, agua y con la adicin
de un antioxidante como cido ascrbico, pirogalol o BHT. Los antioxidantes
deberan ser agregados a la muestra antes de la adicin de la solucin de
hidrxido de potasio. El Cuadro muestra un ejemplo de la proporcin de estos
reactivos.

Cuadro: Proporcin de reactivos para saponificacin

Peso de la
muestra (g)
Alcohol (ml) Acido ascrbico Hidrxido de potasio
2-5 50 (metanol) 0,25 g 5 ml (50%)
5-10 100 (etanol) 1,0 g(+ 0.04 Na
2
S) 12 g (+ 20 mi de agua)
10-20 150 (etanol) 1,0 g 50 ml (80%)

El tiempo normal de saponificacin es entre 15-45 minutos con temperaturas
que fluctan de 80 a 100C (reflujo).
La vitamina A es extrada de la solucin de saponificacin por medio de un
solvente adecuado por ejemplo: ter dietlico, tertbutil metil ter, n-hexano 3 a 4
veces, con volmenes que fluctan de 50-150 ml. Los extractos combinados
son lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).
Evaporacin y dilucin
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la
evaporacin utilizando un evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una
temperatura que no exceda 50C Deben tomarse medidas para remover restos
de agua tales como secar con sulfato de sodio, o destilacin azeotrpica con
etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separacin de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil u otro solvente
compatible con HPLC de tal modo de obtener una concentracin apropiada
para la inyeccin dentro de la columna de HPLC. Esta la solucin final de la
muestra.

HPLC
Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y
fase reversa) para la cuantificacin de la vitamina A. El Cuadro muestra dos
procedimientos de trabajo a partir de las mltiples posibilidades que existen
para lograr buenas separaciones.
Los estndares y soluciones estndares deberan controlarse
espectromtricamente en cuanto a la pureza y la concentracin corregida
debera utilizarse para el clculo.
En algunos de los sistemas cromatogrficos, se logra una separacin entre el
retinol "slo trans" y el 13-cis retinol. En estos casos, los resultados deberan
informarse como equivalentes de retinol "slo trans" lo cual es la suma del
retinol "slo-trans" y el 13-cis retinol despus de corregir considerando la
menor biopotencia (75% del retinol "slo-trans"). Es importante indicar
claramente las unidades utilizadas para informar los resultados.
Cuadro: Condiciones de los sistemas de cromatografa para
vitamina A

Sistema de Fase Normal
(FN)
Sistema de Fase Reversa
(FR)
Columna Acero inoxidable; 125x4,0
nm
Acero inoxidable; 250x4,0 nm
Fase
estacionaria
Lichrosorb Si 60 (Merck);
5 m
Hypersil ODS (Shandon);
5m
Fase mvil n-hexano: 2-propanol (98:2) Metanol: H
2
O (93:7)
Flujo l,0ml/min 0,8 ml/min
Presin 35 bar 60 bar
Volumen de
inyeccin
20-50 l 20 l
Deteccin Fluorescencia; Em: 470 nm
Ex: 325 nm
UV: 325 nm
Tiempo de
retencin
aprox. 6 min aprox. 5 min
Estndar aprox. 2 g/ml (6,6 Ul/ml) aprox. 2 g/ml (6,6 Ul/ml)
Clculo Mtodo de estndar externo;
Recuento de rea o altura
Mtodo de estndar externo;
Recuento de rea o altura

c) Resumen

1. La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la
oxidacin.
2. La saponificacin bajo reflujo debera llevarse a cabo preferentemente
bajo nitrgeno utilizando antioxidantes.
3. Los antioxidantes (BHT) deben agregarse antes de la evaporacin de los
solventes bajo un vaco parcial y sin exceder 50C.
4. Separar adecuadamente el retinol y sus ismeros de los otros
componentes.
5. Control espectromtrico de la pureza del estndar.
6. Informar las unidades relacionadas al resultado.
7. Hacer una referencia a los anlisis de carotenoides, dado que algunos
tienen actividad de vitamina A tal como el caroteno.

VITAMINAS HIDROSOLUBLES
Las vitaminas del grupo B presentan buena solubilidad al agua y por lo tanto,
no es sorprendente que se haya desarrollado mtodos principalmente
microbiolgicos para la determinacin de estos compuestos. Los mtodos
microbiolgicos tienen claras ventajas como por ejemplo, son capaces de medir
cantidades muy pequeas de una vitamina en particular en un amplio rango de
matrices y con una precisin razonable. Por otra parte, estos mtodos
necesitan una infraestructura de laboratorio especfica, personal capacitado y
en general demandan mucho trabajo y tiempo. Algunas de las vitaminas del
grupo B tambin pueden determinarse utilizando procedimientos HPLC o
mediante mtodos colorimtricos. Se discuten los mtodos microbiolgicos slo
para aquellas vitaminas en que no se dispone de otro mtodo atractivo y
confiable.
Tiamina. Vitamina B
1

La tiamina existe en la naturaleza como tiamina, monofosfato de tiamina,
difosfato de tiamina, trifosfato de tiamina y unida a las protenas. Las
principales fuentes de vitamina B
1
son los granos de los cereales, cscara de
arroz, germen de cereales, levaduras, clara de huevo, vegetales, frutas, papas,
huevos, leche, hgado y carne.



a) Frmula y propiedades
Frmula emprica
Vitamina B
1
(hindrocloruro)
C
12
H
17
ON
4
CIS*HCI (P.M.337,3).
Descripcin
Polvo cristalino blanco.
Punto de fusin
Vitamina B
1
, (hidrocloruro): 250C (descomposicin).
Espectro de absorcin
La vitamina B
1
muestra un espectro de absorcin caracterstico en la regin de
200 a 300 nm. Las posiciones del pico mximo y las respectivas extinciones
dependen marcadamente de los solventes utilizados y del pH de las
soluciones. En una solucin de cido clorhdrico 0,1 N, la tiamina muestra una
absorcin mxima a 245 nm.
Estabilidad
En la ausencia de luz y humedad, la sales de tiamina son relativamente
estables al oxgeno atmosfrico incluso cuando tibio. La solucin cida tambin
es estable; sin embargo, ocurre descomposicin en una solucin neutra o
alcalina.
b) Mtodo del tiocromo
El mtodo ms ampliamente utilizado para la determinacin de la vitamina B
1
,
incluye una hidrlisis cida seguida por una defosforilacin enzimtica de los
steres y la cuantificacin de la tiamina liberada. La medicin de la vitamina B\
en el extracto final se realiza mediante fiuorometra despus oxidar a tiocromo
que es un compuesto fluorescente. Ms recientemente, se han publicado
procedimientos por HPLC que se utilizan para cuantifcar, el propio tiocromo o
a travs de una derivatizacin postcolumna.
Extraccin y desfosforilacin
La muestra (hasta 25 g) es hidrolizada utilizando cido sulfrico 0,1 M durante
15 min a 121C. El pH de la mezcla enfriada se ajusta a 4,5 a travs de la
adicin de buffer acetato. Se agregan 500 mg de Takadiastasa y la suspensin
se incuba al menos por 20 minutos a 45C. Debe mencionarse que las
condiciones de incubacin dependen del tipo de enzima y del lote utilizado, as
como tambin del tipo de muestra y pueden variar considerablemente.

Purificacin y reaccin del tiocromo
El extracto puede ser purificado si es necesario a travs de una columna de
intercambio inico, como Amberlite CG 50 (100-200 mesh). La tiamina es
retenida en el intercambio inico y luego es eluda con cido clorhdrico 0,15 M.
El eluido se ajusta a un volumen definido con cido clorhdrico (0,15 M).
Alcuotas de esta solucin se mezclan con isobutanol, una solucin de
hidrxido de sodio (50%), una solucin de hexa - cianoferrato de potasio (5%) y
se agita vigorosamente durante 60 segundos. En una serie paralela con los
mismos reactivos, se prepara un blanco bloqueando la reaccin a travs de la
adicin de cloruro de benceno-sulfonilo. Se agrega cloruro de sodio despus de
la oxidacin para optimizar la extraccin. Despus de la centrifugacin se
toman 10 ml del extracto de isobutanol, se mezcla con 0,5 ml de etanol y se
mide la fluorescencia en contra del blanco. Es importante seguir exactamente
el protocolo para obtener resultados reproducibles.
c) Mtodo HPLC
Derivatizacin en precolumna
El tiocromo formado como se describi en el procedimiento anterior puede
tambin cuantifcarse utilizando HPLC. Este enfoque es de algn modo ms
fcil debido a que la reaccin es detenida por la adicin de cido, el tiocromo
es purificado a travs de una extraccin de fase slida y el extracto obtenido
medido por HPLC en un sistema de fase reversa. Las condiciones de HPLC
pueden ser como se indica en el Cuadro.

Cuadro: Condiciones de cromatografa para tiamina
Columna 250x 4,0 nm acero inoxidable
Fase estacionaria Bakerbond C8; 5 m
Fase mvil Buffer Fosfato: Metanol: 2-Propanol
(63: 27: 10)
Flujo 0,8 ml/min
Volumen de inyeccin 20 l
Deteccin Fluorescencia: Ex: 366 nm; Em: 435
nm
Tiempo de retencin aprox. 5 min
Clculo Estndar externo

Derivatizacin postcolumna
La cuantificacin de la tiamina tambin puede lograrse utilizando un sistema
HPLC de fase reversa que separa en gran medida la tiamina de los otros
componentes. En una etapa de derivatizacin postcolumna se realiza la
oxidacin a tiocromo mezclando el eluente con la solucin de ferricianato
alcalino seguida por deteccin fluorescente .
d) Resumen
1. La tiamina es extrada por hidrlisis cida seguida por una etapa de
desfosforilacin enzimtica.
2. Debe tenerse cuidado que la preparacin enzimtica utilizada est
funcionando.
3. El protocolo para la oxidacin a tiocromo debe ser seguido en forma
precisa a fin de obtener resultados reproducibles.
4. Debe llevarse un blanco durante el ensayo completo.
5. Los procedimientos por HPLC estn disponibles tanto para
derivatizacin en precolumna como tambin para derivatizacin
postcolumna.
Riboflavina. Vitamina B
2

La riboflavina se encuentra en los alimentos como riboflavina libre o como
riboflavina-5'-fosfato (FMN) y como flavin adenina dinucletido (FAD).
Las principales fuentes de vitamina B
2
son hgado, rin, carne, pescado,
leche, queso, huevos y vegetales. La solubilidad de la riboflavina en el agua es
ms bien deficiente (aprox. 7, mg/100 ml) pero en lcali diluido es fcilmente
soluble.
a) Frmula y propiedades
Frmula emprica
Vitamina B
2
C
17
H
20
O
6
N
4

(P.M. 376,4)
Na-Riboflavina-5'-fosfato
C
17
H
20
O
9
N
4
PNa (P.M. 478,4)
Descripcin
Polvo cristalino amarillo a naranja amarillento.
Punto de fusin
Vitamina B
2
: 280-290C (descomposicin)
Rotacin especfica
Riboflavina:[] 20-D = -122
o
a -136
o

(c=0,25 en NaOH 0,05 N)
Na-Riboflavina-5'-fosfato:[] 20-D = +38 + 42
o
(c=1,5 en HCl 20%).
Espectro de absorcin
Las soluciones de riboflavina y del fosfato en HC1 0,1 N muestran una
absorcin mxima a ca. 223, 267, 374 y 444 nm.
Estabilidad
Ambos compuestos son sensibles a la luz y a la radiacin UV, pero son
estables al calor y al oxgeno atmosfrico.
En soluciones alcalinas, la descomposicin es rpida, especialmente si se
expone a la luz.
b) Mtodo
Debido a sus propiedades fsico-qumicas, la riboflavina puede determinarse
fluoromtricamente. Este modo de deteccin posee claras ventajas dado que
es ms especfico que por ejemplo UV. Sin embargo, todava existen distintos
componentes en los alimentos que interfieren, lo cual complica el anlisis. Se
han utilizado diferentes mtodos en el pasado que incluyen la irradiacin de un
extracto de muestra purificada con luz lo que lleva a la formacin del llamado
lumicromo. Este es un compuesto que tiene fuertes propiedades fluorescentes
y puede cuantificarse fcilmente. Sin embargo, el procedimiento de trabajo
requiere tiempo y trabajo. Por lo tanto, los ensayos microbiolgicos son
utilizados rutinariamente adems de los mtodos HPLC lo que permite una
preparacin ms simple de la muestra que el mtodo del lumicromo.
Extraccin y desfosforilacin (15)
La muestra (hasta 10 g) se hidroliza utilizando cido sulfrico 0,1 M durante 15
min a 121C. El pH de la mezcla enfriada se ajusta a 4,5 a travs de la adicin
de buffer acetato. Se agrega 500 mg de Takadiastasa y la suspensin es
incubada al menos durante 20 minutos a 45C. Debe mencionarse que las
condiciones de incubacin dependen del tipo de enzima y el lote utilizado as
como tambin del tipo de muestra y pueden por tanto variar
considerablemente. La reaccin enzimtica es detenida por la adicin de cido
sulfrico.



Precipitacin y dilucin
La mezcla acidificada es llevada a volumen con cido sulfrico 0,1M y es
filtrada despus de mezclarla completamente. Una alcuota del filtrado es
mezclada con volmenes iguales de metanol y luego centrifugada. Dos partes
del sobrenadante transparente son diluidas con una parte de agua e inyectada
al sistema HPLC. Este tipo de preparacin de muestra evita la obstruccin de la
columna por una posible precipitacin despus de la inyeccin. Es muy
importante proteger la muestra y los extractos de la luz. Toda la manipulacin
de la muestra deber realizarse en frascos de vidrio mbar y las soluciones
mantenerse en la oscuridad.
Condiciones de HPLC
Existen numerosas y diferentes posibilidades de obtener una buena
separacin. En la mayora de los casos el pico de riboflavina ser el nico pico
principal del cromatograma (Cuadro).

Cuadro: Condiciones de cromatografa para riboflavina
Columna 250x 4,0 nm acero inoxidable
Fase RP18 ejemplo Spherisorb (16) 5 m o
estacionaria Bondapack(17)
Fase mvil Metanol: H
2
O (35:65) o (70:30) o mezclas de
metanol con buffers y/o PIC B6, B7 etc.
Deteccin Fluorescencia: Ex: 445-50 nm: Em: 525-30 nm
c) Resumen
1. La vitamina B
2
se extrae de la matriz alimentaria mediante hidrlisis
cida seguida por una etapa de desfosforilacin enzimtica.
2. Debe tenerse cuidado que funcione la preparacin enzimtica a utilizar.
Esto puede hacerse inyectando estndar de FMN en la lnea de HPLC y
controlando la muestra tratada para FMN residual.
3. La riboflavina liberada debera protegerse de la luz.
4. Se logra la mejor cuantificacin y separacin utilizando HPLC de fase
reversa.
5. El modo de deteccin es preferentemente realizado por fluorescencia
dado que ste es ms selectivo.
Vitamina C
El cido L-ascrbico se encuentra en todos los tejidos vivos como un
importante compuesto redox del metabolismo celular. Fuentes importantes de
la vitamina C son las frutas frescas (ctricos, uvas negras, escaramujo, pimiento
rojo) y vegetales (repollo, papas, lechuga, tomates etc.).
a) Frmula y propiedades
Frmula emprica
Acido ascrbico C
6
H
8
O
6

(P.M. 176,1)
Ascorbato de sodio C
6
H
7
O
6
Na
(P.M. 198,1).
Descripcin
Acido ascrbico: Polvo cristalino blanco
Ascorbato de sodio: Polvo cristalino con tinte amarillo.
Punto de fusin
Acido ascrbico 190C (descomposicin)
Ascorbato de sodio
Descomposicin sin un punto de fusin definido a los 220C.
Espectro de absorcin
En la luz UV, el cido ascrbico en una solucin fuertemente cida muestra
una absorcin mxima a ca. 245 nm, la cual cambia a pH neutro a 265 nm y
aproximadamente 300 nm a pH 14.
Rotacin especfica
Acido ascrbico: [] 20-D = -22 a -23 (c=2,0 en agua)
Ascorbato de sodio: [] 20-D = + 103 a 106 (c=5,0 en agua).
Estabilidad
El cido ascrbico cristalino es relativamente estable en el aire en ausencia
completa de humedad, mientras la sal sdica tiende a volverse amarilla. Las
soluciones acuosas son atacadas por el oxgeno atmosfrico y otros agentes
oxidantes; el primer cido formado, el cido dehidroascrbico es oxidado
posteriormente en forma irreversible. Los lcalis y los iones de metales
pesados (por ejemplo, cobre) actan como catalizadores.
b) Mtodos
cido ascrbico (AA) es fcilmente oxidado a cido dehidroascrbico (ADA) y por lo
tanto, es necesario seleccionar las condiciones de extraccin en forma cuidadosa con
el fin de minimizar las posibles prdidas debido a las etapas de preparacin de las
muestras. Las soluciones de extraccin ms comnmente utilizadas son las de los
cidos metafosfrico, oxlico y actico y mezclas de ellos. Bsicamente existen dos
enfoques diferentes para la determinacin del cido ascrbico:
-La determinacin del cido ascrbico presente en la muestra ignorando alguna
presencia posible de ADA

-La determinacin del cido ascrbico "total" que incluye la suma de AA y ADA
utilizando

MTODOS DE DETERMINACIN:
La concentracin de una solucin de cido ascrbico puede ser determinada
de varias formas espectrofotomtrico, ampermetro, cromatografa aunque la
ms comn es la titulacin con un agente que se oxida.
a) Mtodo Titulacin:

1.-DCPIP: Un agente muy utilizado es el tinte 2,6-diclorofenol-indofenol
(DCPIP). El tinte azul se echa en la solucin de cido ascrbico hasta que un
color rosado dbil persista durante15 segundos.

2.- Yodo: Otro mtodo implica usar el yodo y un indicador de almidn, en
donde el yodo reacciona con el cido ascrbico, y, cuando todo el cido
ascrbico ha reaccionado, el yodo queda entonces en exceso, formando un
complejo azul oscuro con el indicador de almidn. Esto indica el punto final de
la titulacin. Como alternativa, el cido ascrbico puede reaccionar con el yodo
en exceso, seguido de una titulacin con tiosulfato de sodio usando almidn
como indicador.

3.-N-Bromosuccinimida Un agente de oxidacin mucho menos comn es la
N-bromosuccinimida (NBS). En esta titulacin, la NBS oxida el cido ascrbico
(en presencia de yoduro potsico y almidn). Cuando la NBS est en exceso
(es decir, la reaccin est completa) libera el yodo del yoduro potsico, que
forma entonces un complejo azul/negro con el almidn, indicando el punto del
final de la titulacin.

PROCEDIMIENTOS:

1.- procedimiento de determinacin de cido ctrico con NaOH:

Coloque 5 ml de jugo de limn en el matraz y adiciona 50 ml de agua destilada y luego
aade 2 gotas de fenolftalena, y procede a titular con la solucin estndar de NaOH
hasta la aparicin de una coloracin rosa. Re p i t a l a o p e r a c i n y c o mp a r e
l o s v o l me n e s d e Na OH c o n s u mi d o s , d e b e n s e r iguales.
2.- procedimiento de determinacin de cido ctrico por 2,6 diclorofenol-
indofenol:
Paso 1. Se extraen los zumos de las frutas que vamos a investigar y se guardan en
frascos cuentagotas en la oscuridad
Paso 2. Se prepara una disolucin patrn de vitamina C de concentracin 1%, Se
toma una alcuota de 2ml del ms 5 ml de cido metofosforico-acetico (solucin
extractora) en un matraz Erlenmeyer
Paso 3. Se prepara una disolucin de 2-6 diclorofenol-indofenol, indicador que
utilizaremos para la deteccin de la vitamina C. Para ello disolvemos 0,2 g del reactivo
en 100 ml de agua destilada, dejamos reposar durante 24 horas y filtramos y titulamos
gota a gota. Hasta el viraje de color.
3.- procedimiento de determinacin de cido ctrico por lugol y almidn:
Paso 1. Se coloca 5ml de la muestra de algn jugo, que servir para la titulacin
Paso 2. Luego se aade unas gotas de almidn que sirve de indicador, determina el
punto final de la oxidacin de la vitamina c.
Paso 3. Titular con lugol.
b) MTODO CROMATOGRAFA:
El material (1-5 g) es extrado con 25-50 ml de cido metafosfrico 0,5% que contiene
ditiotreitol 0,2% (DTT) utilizando un homogenizador o mediante agitacin. Despus de
la centrifugacin, el extracto es diluido con buffer acetato pH 4,8 que contiene DTT
0,2%, se filtra usando un filtro de 0,45 m y se inyecta en el HPLC. El Cuadro muestra
las condiciones de HPLC.





Cuadro: Condiciones de cromatografa para cido ascrbico
Columna Acero inoxidable; 250x4,0 m
Fase estacionaria Hypersil ODS (Shandon), 5 m
Fase mvil Buffer acetato": Metanol: Agua
(15:40:945)
Flujo 0,8ml/min
Presin 90 bar
Volumen de inyeccin 10-20 l
Deteccin UV: 254 nm
Tiempo de retencin aprox. 6-8 min
Estndar aprox. 10 g/ml
Clculo Mtodo estndar externo
Recuento de rea o altura
a Buffer acetato:36,8 g de acetato de sodio*3H
2
0 disueltos en
800 ml de agua, 101 ml de cido actico, pH ajustado a 3,8 y
diluido a 1000 ml con agua.












BIBLIOGRAFIA

1. Augustin, J., et al, eds. 1985. Methods of vitamin assay. 4 ed. New York,
John Wiley & Sons.
2. Brubacher, G.; Mller-Mullot, W. and Southgate, D.A.T., eds. 1985.
Methods for the determination of vitamins in foods. London, Elsevier
Applied Science Publishers.
3. Lumley, I.D. Vitamin analysis in foods. In: Ottaway, P.B., ed. The
technology of vitamins in foods.
Glasgow, Blackie Academic & Professional.
4. Ball, G.F.M. 1988. Fat-solublc vitamin assays in foods analysis. London,
Elsevier Applied Science.
5. The Merck Index. 1983. 10 ed.
6. Finglas, P.M., et al. 1995. The certifcation of the mass fraction of
vitamins in a margarme, a mk powder and a lyophilized Brussels sprout
powder reference material. Brussels, Commission of the European
Union. (CRMs 122,421 &431). In Press.
7. Pocklington, W.D. and Diefenbacher, A. 1988. (Pure & Appl. Chem.
60:877-892).
8. National Research Council. Commission on Life Sciences.
Subcommittee on the Tenth Edition of the RDA's Food and Nutrition
Board. 1989. Recommended Dietary Allowances. 10 ed. Washington
DC, National Academy Press.
9. The Pharmaceutical Codex, Incorporating the British Pharmaceutical
Codex. 1979. 11 ed. The Pharmaceutical Press.
10. Bell, J.G. and Christie, A.A. 1973. (Analyst 98:268-273; 99:385-396).
11. AOAC. 1990. Official methods for analysis. 15 ed. (Section 967.22;
984,26:1059-1061).