UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

UNAD

PREINFORMES DE LABORATORIO

BIOQUIMICA

PRESENTADO POR
ELIZABETH PEZ
CODIGO: 1013596077

10 DE SEPTIEMBRE DE 2014

PRCTICA No. 1
METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE
AMINOACIDOS Y PROTEINAS

OBJETIVOS
Que el estudiante reconozca los aminocidos como unidades estructurales de las
protenas.
Que el estudiante analice, mediante reacciones cualitativas coloreadas la presencia de
aminocidos y enlaces peptdicos en las muestras.
Que el estudiante establezca la relacin entre la estructura y la funcin de las protenas
y prdida de esta al variar su pH y solubilidad (precipitacin y desnaturalizacin).

INTRODUCCION
Se realiza este pre informe relacionado con la prctica numero 1 correspondiente al
programa de Bioqumica, llamada METODOS CUALITATIVOS PARA LA
IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS, con la intensin de abordar la
prctica con conocimientos previos, enterados de los procedimientos que vamos a llevar a
cabo en el laboratorio y de esta manera agilizar y hacer ms fcil el desarrollo de la misma.
De igual manera tambin se ha consultado con anterioridad las normas de laboratorio y
bioseguridad.
Se espera que sea de agrado al lector y que el documento cumpla con las expectativas y
requisitos.

MARCO TEORICO
AMINOACIDOS: Son unidades de compuestos orgnicos que al unirse entre s forman las
protenas necesarias para la existencia, funcionamiento y mantenimiento de nuestro
organismo. Se pueden clasificar segn sus propiedades qumicas, Aminocidos con grupo R
no polar (alifticos y aromticos), aminocidos con grupo R polar sin carga, aminocidos
con grupo R con carga positiva o aminocidos con grupo R con carga negativa.

CLASIFICACIN
Aminocidos con grupo R no polar

NOMBRE AA

ESECIAL / NO ESENCIAL

Glicina
Alanina
Valina

Aminocido no esencial
Aminocido no esencial
Aminocido esencial

Leucina
Isoleucina
Fenilalanina
Triptfano

Aminocido esencial
Aminocido esencial
Aminocido esencial
Aminocido esencial

Metionina

Aminocido esencial

Aminocidos con grupo R polar sin

Prolina
Serina

Aminocido no esencial
Aminocido no esencial

carga

Treonina

Aminocido esencial

Asparagina
Glutamina
Cistena

Aminocido esencial
Aminocido no esencial
Aminocido no esencial

Tirosina

Aminocido no esencial

Acido asprtico
Acido glutmico

Aminocido no esencial
Aminocido no esencial

Histidina
Lisina

Aminocido esencial
Aminocido esencial

Arginina

Aminocido no esencial y esencial,

Alifticos

Aminocidos con grupo R no polar

Aromticos

Aminocidos con grupo R con

carga negativa
Aminocidos con grupo R con
carga positiva.

depende de la edad, es esencial

para los jvenes en crecimiento,
pero no lo es para los adultos.

Reaccin de la ninhidrina: Es positiva para aminocidos y protenas que tengan un grupo

-NH2 libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con ninhidrina, se forma un complejo azulvioleta.
Reaccin xantoproteica: Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser
nitrados produciendo un compuesto Amarillo
Reaccin de millon: Es un Ensayo qumico que sirve para saber si existe tirosina en la
solucin, si esto es as se genera un cogulo blanco que por calentamiento pasa al rojo
carne.
Reaccin del cido glioxlico o Reaccin de Hopkins Cole: El anillo indlico presente en
la cadena lateral de los alfa-aminocidos libres o haciendo parte de pptidos y protenas se
puede reconocer mediante reaccin con el cido glioxlico a pH cido, puesto que forma
complejos de coloracin violeta o amarillo violeta, permitiendo as identificar al triptfano.

Prueba de Pauly: Esta prueba es especfica para detectar grupos imidazoles, fenoles y
aminas de ciertos aminocidos. En esta prueba el cido sulfanilico disuelto en cido
clorhdrico se mezcla con el nitrito de sodio se produce Acido nitroso, el cual reacciona con
la sal produciendo sal de diazonio. En la segunda etapa de esta prueba se le incorpora un
compuesto fenlico, imidazol o amina y un cido o base dbil para que la sal de diazonio se
asocie con el compuesto generando un compuesto azo de color rojo.
Prueba del Nitro prusiato: En esta reaccin los aminocidos que presentan grupos
sulfhdricos libres como en la cistena los cuales reaccionan con el nitro prusiato de sodio
en presencia de un hidroxico de amonio concentrado produciendo una reaccin con
coloracin rojiza.
Reaccin de Sakaguchi: El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina
reacciona con soluciones de alfa naftol en presencia de bromo en medio alcalino formando
complejos coloreados rosados o rojos.
Prueba de Biuret: Es una prueba general para protenas, no especifica. Cuando una
protena reacciona con sulfato de cobre (II) (color azul) se forma como respuesta positiva
un complejo color violeta.

PROCEDIMIENTOS

Pruebas Cualitativas - Obtencin de los Extractos

Para alimentos en polvo
Coloque 30 gramos de
muestra en un vaso de
precipitado

Agregue 10 ml
de agua
destilada

Agite durante 10
minutos y filtre a
travs de tela
limpia

Para alimentos solidos

Muela o macere por
separado y recoja el molido
en un vaso de precipitado

Agregue 10 ml de agua
destilada, agite durante 10
minutos y filtre a travs de la

Recoja los filtrados en vaso de

precipitado previamente
marcados. Deseche los
residuos.

Para la solucin de clara de huevo

Haga un pequeo orificio en uno de los
extremos del huevo y vierta por l a
clara en un vaso precipitado, dejando
dentro la yema

Agregue a la clara 10 ml de agua

destilada y agite con el fin de
disolverla

PRACTICA # 2
FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILAS DE LEGUMINOSAS Y
CEREALES POR SOLUBILIDAD
OBJETIVOS

Que el estudiante compruebe la teora con la prctica en relacin al comportamiento

segn la solubilidad de protenas.
Que el estudiante obtenga las fracciones de albminas, globulinas, pro lminas y
glutelinas a partir de tejidos biolgicos.
Que el estudiante calcule mediante espectrofotometra, la concentracin de protenas en
cada una de las fracciones anteriores

INTRODUCCION
Se realiza este pre informe relacionado con la prctica numero 2 correspondiente al
programa de Bioqumica, llamada FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILAS
DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD, con la intensin de abordar la
prctica con conocimientos previos, enterados de los procedimientos que vamos a llevar a
cabo en el laboratorio y de esta manera agilizar y hacer ms fcil el desarrollo de la misma.
De igual manera tambin se ha consultado con anterioridad las normas de laboratorio y
bioseguridad.
Se espera que sea de agrado al lector y que el documento cumpla con las expectativas y
requisitos.

MARCO TEORICO

SOLUBILIDAD DE LAS PROTEINAS: Las protenas son solubles en agua cuando

adoptan una conformacin globular. La solubilidad es debida a los radicales (-R) libres de
los aminocidos que, al ionizarse, establecen enlaces dbiles (puentes de hidrgeno) con las
molculas de agua. As, cuando una protena se solubiliza queda recubierta de una capa de
molculas de agua (capa de solvatacin) que impide que se pueda unir a otras protenas lo
cual provocara su precipitacin (insolubilizacin). Esta propiedad es la que hace posible la
hidratacin de los tejidos de los seres vivos.
DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS: Se refiere a la ruptura de los enlaces
que mantenan sus estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria, conservndose solamente
la primaria. En estos casos las protenas se transforman en filamentos lineales y delgados
que se entrelazan hasta formar compuestos fibrosos e insolubles en agua. Los agentes que
pueden desnaturalizar a una protena pueden ser: calor excesivo; sustancias que modifican
el pH; alteraciones en la concentracin; alta salinidad; agitacin molecular; etc.
CLASIFCACIN DE OSBORNE DE LAS PROTENA: Segn Osborne, las protenas
vegetales pueden clasificarse segn su solubilidad en: albminas, globulinas y glutelinas.
Las albminas corresponden al grupo de protenas que son solubles en agua destilada y en
soluciones salinas diluidas. Las globulinas son insolubles o muy ligeramente solubles en

agua destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas. Con base en las propiedades
de solubilidad no es posible distinguir entre albminas y seudoglobulinas. Si se aplican los
conceptos de precipitacin por salado, se observa que las globulinas precipitan en
soluciones de sulfato de amonio del 50% de saturacin, mientras que las albminas lo
hacen a concentraciones mayores del 75% de saturacin. Estas precipitaciones son mejores
si se hacen a pHs cercanos a sus puntos isoelctricos. Las prolaminas son insolubles en
agua pero se disuelven en soluciones acuosas de alcoholes de bajo peso molecular, en
concentraciones entre el 50 y el 90%. Las glutelinas son insolubles en los solventes
anteriores pero se solubilizan en soluciones diluidas de cido o bases. Estos dos ltimos
grupos solo se encuentran en mate riales vegetales, mientras que las protenas animales
estn constituidas bsicamente por albminas y globulinas.
MTODOS CUANTIATIVOS PARA LA DETERMINACIN DE PROTENAS
METODO BIURET: Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y
los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas y la
reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad
del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en
preparados muy concentrados por ejemplo en suero.
METODO FOLIN-LOWRY: Uno de los mtodos ms empleados para determinar la
cantidad de protenas en una muestra es el mtodo descrito por Lowry, que est basado en
la asociacin de dos reacciones complementarias: Reaccin del Biuret: caracterstica de
grupos amino peptdicos, con los que el Cu(II) en medio alcalino forma enlaces de
coordinacin, originando complejos de color violeta. Y reactivo de Folin-Ciocalteu:
caracterstica de grupos -OH reductores que, junto con los complejos cuproproteicos de la
reaccin del Biuret, reducen el reactivo de Folin, el cual vira a color azul oscuro.
METODO BRADFORD: Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 a las
protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las
protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un
coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g),
simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las
sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

PROCEDIMIENTOS
Preparacin de la muestra

Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso

ser una de las harinas de: arveja,
soya, frjol, haba, trigo, cebada, etc.)

Pasarla a un tubo de ensayo,

agregar 10 ml de H2O
desmineralizada, agitar
manualmente durante 10

Vaciar el sobrenadante a un baln

aforado de 25 ml. Al residuo agregar
de nuevo otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir
exactamente el proceso anterior.

Despus de centrifugar, el
sobrenadante de esta segunda
extraccin se adiciona al baln que
contiene al primer sobrenadante.

Despus de centrifugar, los

sobrenadantes de la primera y
segunda extraccin con NaCl al 1%,
se llevan a otro baln aforado de 25
ml y se completa hasta el enrase con
el mismo NaCI al 1%. Esta es la
fraccin de las globulinas

Sobre el residuo anterior se extrae en

idntica forma la fraccin de las
prolaminas, usando esta vez alcohol
etlico al 75% y una temperatura de
extraccin cercana a 60C

Centrifugar la suspensin a
250 rpm por 3 minutos

Se completa su volumen a 25 ml
con H2O desmineralizada hasta el
enrase. As se tiene separada la
fraccin de las albminas

Sobre el residuo que queda de la

separacin de las albminas, se
repite ahora todo el proceso
anterior, pero agregando esta vez

Por ltimo sobre el mismo residuo,

con la adicin de solucin de NaOH
0.1 N y aplicando el mismo
procedimiento general, se separa la
fraccin de las glutelinas.

Mtodo de Biuret

Sobre cada uno de los extractos que

contienen las diferentes fracciones
cada grupo proceder a la
determinacin de protenas, aplicando
el mtodo de Biuret.

La curva de calibracin se har

utilizando como patrn una
solucin de albmina de huevo
de concentracin conocida.

Para las muestras de soya, arveja y frjol, de

las fracciones de albminas y glutelinas
deber tomarse para cada una y por aparte,
una alcuota de 0,5 ml y levarse a un
volumen de 5 ml (dilucin 1 a 10) con agua
desmineralizada para las albminas y con
NaOH 0,1 N para las glutelinas. Estas
diluciones se usarn como extractos

En 15 tubos de ensayo
rotulados pipetear en
c/u las cantidades de
reactivos

Mezclar bien y dejar en reposo por

30 minutos a temperatura
ambiente o introducir los tubos en
un bao de agua a 30C durante 10
minutos para desarrollo del color

Leer en cada tubo porcentaje de

transmitancia a 540 nm usando el
tubo B para ajustar el 10% de
transmitancia

Mtodo de Foln- lowry

A 1 ml de muestra agregue 5 ml de
una solucin alcalina (mezclar 50 ml
de la solucin alcalina de carbonato
de sodio ms 1 ml de solucin de
sulfato de cobre tartrato sdico

Mezcle vigorosamente y deje reposar

a temperatura ambiente por 10 min o
ms. Agregue 0. 5 ml del reactivo de
Folin en forma rpida y mezclando
inmediatamente

Determine la concentracin de
protenas de una solucin problema
despus de preparar una curva
patrn con BSA (albmina srica

Despus de 30 minutos lea la

Absorbancia a 750 nm. Utilice un
blanco de reaccin

PRACTICA # 3
ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS
OBJETIVOS
Que el estudiante entienda el papel de las enzimas como catalizadores de los diferentes
procesos bioqumicos y su importancia en los diferentes procesos metablicos.

Que el estudiante analice mediante reacciones cualitativas la actividad enzimtica de la

sacarasa y alfa-amilasa.
Que el estudiante establezca relaciones entre la estructura y la funcin de las enzimas y
prdida de esta al variar al variar su temperatura ptima de trabajo.

INTRODUCCION
Se realiza este pre informe relacionado con la prctica numero 3 correspondiente al
programa de Bioqumica, llamada ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS, con la
intensin de abordar la prctica con conocimientos previos, enterados de los
procedimientos que vamos a llevar a cabo en el laboratorio y de esta manera agilizar y
hacer ms fcil el desarrollo de la misma. De igual manera tambin se ha consultado con
anterioridad las normas de laboratorio y bioseguridad.
Se espera que sea de agrado al lector y que el documento cumpla con las expectativas y
requisitos.
MARCO TEORICO

LA SACARASA: Conocida tambin como invertasa, es una enzima que convierte la

sacarosa (azcar comn) en glucosa y fructosa. Est presente en el intestino delgado, en el
borde del cepillo de las vellosidades intestinales. La ausencia de sacarasa provoca una
enfermedad denominada intolerancia a la sacarosa, de difcil diagnstico, muchas veces se
confunde con la intolerancia a la lactosa. Pertenece a la familia de las disacaridasas, que
son las enzimas que se encargan de romper los disacridos en los monosacridos que los
forman.
REACTIVO DE FEHLING
El reactivo de Fehling, tambin conocido como Licor de Fehling, es una disolucin que se
utiliza como reactivo para la determinacin de azcares reductores. Sirve para demostrar la
presencia de glucosa, as como para detectar derivados de sta tales como la sacarosa o la
fructosa. El licor de Fehling consiste en dos soluciones acuosas:
Sulfato de cobre cristalizado, 35 g y agua destilad hasta 1.000 ml.
Sal de Seignette o Tartrato mixto de potasio y sodio 150 g, solucin de hidrxido de
sodio al 40 %, 3 g y agua hasta 1.000 ml.
Ambas se guardan separadas hasta el momento de su uso, para evitar la precipitacin del
hidrxido de cobre. El ensayo con el licor de Fehling se fundamenta en el poder reductor
del grupo carbonilo de los aldehdos. ste se oxida a cido y reduce la sal de cobre en
medio alcalino a xido de cobre, formando un precipitado de color rojo.

PROCEDIMIENTOS

Experimento No. 1 Sacarasa, Extraccin de la enzima

Tome 17 gramos
de levadura
granulada en un
mortero y

Una vez reducida a

polvo, transfirala a
un vaso de precipitado
que contenga 100 ml
de agua destilada y
agite durante 10

Decante parte del lquido cuidando

de no perder el precipitado porque
es donde est la enzima sucrasa,
colquela en hielo para evitar la
desnaturalizacin. Marque el
recipiente como SOLUCIN DE

Filtre a travs
de tela y luego
a travs de
papel de filtro
en un embudo.

Vierta el filtrado en un vaso de

precipitado y agregue 50 ml de
acetona. Mezcle bien y deje la
mezcla quieta durante 10 minutos.

Experimento No. 2: -amilasa, Obtencin de la enzima:

Se debe recolectar
una muestra de
saliva para
obtener una
solucin de

Para ello enjuguese

varias veces con agua
de bolsa y proceda a
recoger en un beaker de
50 ml aproximadamente
10 ml de saliva.

Adicione a la
saliva 10 ml de
agua destilada
y mezcle bien

Filtre la solucin de saliva y rotule el

erlenmeyer como SOLUCIN DE ENZIMA
- AMILASA, mantngala incubada a 37 38C

Preparacin de la solucin de enzima y Efecto de la concentracin de la enzima sobre

la velocidad de reaccin.

Se debe recolectar
una muestra de
saliva para
obtener una
solucin de

Para ello enjuguese

varias veces con agua
de bolsa y proceda a
recoger en un beaker de
50 ml aproximadamente
10 ml de saliva.

Adicione a la
saliva 10 ml de
agua destilada
y mezcle bien

Filtre la solucin de saliva y rotule el

erlenmeyer como SOLUCIN DE ENZIMA AMILASA e incube a 38C

PRACTICA # 4
ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA
OBJETIVOS
Que el estudiante entienda el papel de las enzimas como catalizadores de los diferentes
procesos bioqumicos y su importancia en los diferentes procesos metablicos.

Que el estudiante evale la capacidad enzimtica de la ureasa frente a cambios de pH,

concentracin de enzima y temperatura.
Que el estudiante compare mediante dos mtodos (espectrofotomtrico y volumtrico),
la capacidad enzimtica de la ureasa frente a cambios de pH, concentracin de enzima y
temperatura.

INTRODUCCION
Se realiza este pre informe relacionado con la prctica numero 3 correspondiente al
programa de Bioqumica, llamada ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA, con la
intensin de abordar la prctica con conocimientos previos, enterados de los
procedimientos que vamos a llevar a cabo en el laboratorio y de esta manera agilizar y
hacer ms fcil el desarrollo de la misma. De igual manera tambin se ha consultado con
anterioridad las normas de laboratorio y bioseguridad.
Se espera que sea de agrado al lector y que el documento cumpla con las expectativas y
requisitos.
MARCO TEORICO

UREASA: Es una enzima que cataliza la hidrlisis de urea a dixido de carbono y

amonaco. Los organismos que producen ureasa tienden a ser patgenos del tracto
gastrointestinal o urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el cido presente en
estos medios acdicos.

PROCEDIMIENTO
Extraccin de la Ureasa
Pesar 5 g de muestra (en cada
caso ser una de las harinas de
leguminosas o de las tortas de
oleaginosas), pasarla a un

Agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar

mecnicamente durante 15
minutos y centrifugar la
suspensin a 2.50 rpm por 15
minutos; transferir el
sobrenadante a un baln aforado

Reunir los dos

sobrenadantes y
completar a 25 ml con
NaCI 1%. Este es el
extracto que contiene

Al residuo agregar de
nuevo otros 10 mI de
NaCI 1% y repetir
exactamente el
procedimiento anterior

Determinacin de la actividad a diferentes pH: pH ptimo de una enzima:

Preprese 2 series de 5 tubos: 5
servirn como blanco y 5 para
determinar el efecto de pH. (Tubos
p) rotulados claramente. Agregue
lo indicado en el cuadro,
incubndolos como se indica

Extracto enzimtico de material vegetal

Pese aproximadamente 5,0 g del
material vegetal a utilizar,
colquelo en un mortero y macere
con 20ml de NaCl 1% previamente
enfriado en un bao de hielo-agua
y realice la extraccin por 15
minutos; luego Centrifugue por

Terminada la incubacin transfiera

el contenido de cada tubo a un
erlenmeyer diferente, agregando a
cada uno 3 gotas de indicador de
tashiro; finalmente titule con HCI de
normalidad conocida.

Transfiera el sobrenadante a un baln

aforado de 50ml y el residuo
transfiralo nuevamente al mortero y
realice una segunda extraccin con
10ml de NaCl al 1% y fro, por 15 min.
Centrifugue a 250 rpm por 10 min y
coloque el sobrenadante en el baln
aforado y complete a volumen con
NaCl al 1%. Guarde el extracto