PRACTICA N 04

DEMOSTRACIN DE LA DISTROBUCIN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS

DE XIDO-REDUCCIN

I. REACTIVOS A UTILIZAR
-

Buffer fosfato de sodio 0.1M pH: 7.4

2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %

Succinato 0.1M

pfenilendiamina 1%

Homogenizado total de hgado de rata en sucrosa 0.25 M

Fraccin nuclear del homogenizado.

Fraccin mitocondrial del homogenizado.

Fraccin microsomal soluble del homogenizado.

KCl 0.154 M
Armar el siguiente sistema, USANDO 2,6 - diclorofenollindofenol
COMPONENTES
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
2 6 diclorofenolindofenol
Succinato de sodio 0.1M
Fraccin nuclear
Fraccin mitocondrial
Fraccin microsomal -soluble
Homogenizado total

I
1.0
1.0
0.2
-

II
0.5
1.0
0.2
0.5
-

III
0.5
1.0
0.2
0.5
-

IV
0.5
1.0
0.2
0.5
-

V
0.5
1.0
0.2
0.5

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los
resultados.
Armar otro sistema, usando p fenilendilamina
COMPONENTES
Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4
P fenilendiamina 1%
(sustrato + indicador)
Fraccin nuclear
Fraccin mitocondrial

1
2
3
4
5
1.5 1.0 1.0 1.0 1.0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
- 0.5 - 0.5 -

Fraccin microsomal soluble

Homogenizado total

0.5 - 0.5

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.

Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los
resultados.

II. DESARROLLO Y RESULTADOS:

SISTEMA 01
Las enzimas de oxido-reduccin presentes en este sistema tienen una distribucin caracterstica
intracelularmente, encontrndose en una estructura en una subestructura celular, en donde la
energa derivada de las oxidaciones es capturada en la forma de ATP.
Al sistema 01 se le aade el indicador 2,6 diclorofenolindofenol.
Tubo I: No hay enzimas y por lo tanto no hay reaccin, se mantiene el color azul.
Tubo II: No hay enzimas y por lo tanto no hay reaccin, solo hay fraccin nuclear donde solo se
encuentran ncleos y clulas ntegras. Se mantiene el color azul
Tubo III: En la fraccin mitocrondrial encontramos mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, aqu
hay enzimas y por lo tanto hay reaccin. El tubo se torna de color celeste blanquecino con
sobrenadante azul.
Tubo IV: En la fraccin microsomal se encuentra RER, REL y ribosomas, aqu no hay enzimas.
Y por lo tanto no hay reaccin. Se mantiene el color azul.
Tubo V: En el homogeneizado se encuentran todas las fracciones, si hay enzimas y por lo tanto
hay reaccin, hay cambio de color a celeste blanquecino.

Sistema 01, enumeracin de izquierda a derecha: tubo I, tubo II, tubo III, tubo IV y tubo V.

SISTEMA 02
Al sistema 02 se le aade el indicador p fenilendiomina.
Tubo I: No hay enzimas y por lo tanto no hay reaccin. Se mantiene el color marrn claro.
Tubo II: No hay enzimas y por lo tanto no hay reaccin, solo hay fraccin nuclear donde solo se
encuentran ncleos y clulas ntegras. Se mantiene el color marrn claro.
Tubo III: En la fraccin mitocrondrial encontramos mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, aqu
hay enzimas y por lo tanto hay reaccin. El tubo se torna de color marrn oscuro.
Tubo IV: En la fraccin microsomal se encuentra RER, REL y ribosomas, aqu no hay enzimas. Y
por lo tanto no hay reaccin. Se mantiene el color marrn claro.
Tubo V: En el homogeneizado se encuentran todas las fracciones, si hay enzimas y por lo tanto hay
reaccin, hay cambio de color a marrn oscuro.

Sistema 02, enumeracin de izquierda a derecha: tubo I, tubo II, tubo III, tubo IV y tubo V.

RESOLUCIN DEL CUESTIONARIO

1. Qu es el 2,6-diclorofenolindofenol y cmo acta en la cadena respiratoria?
El 2,6-diclorofenolindofenol es un derivado clorado del fenol con la frmula qumica C 6H4Cl2O el
cul acta como un indicador, cuyo estado normal es oxidado a un color azul, y cuando se reduce
ocurre un cambio a blanquecino.
En la cadena respiratoria, este compuesto acta en el complejo I, entre el FMN y la ubiquinona
(coenzima Q)
2. Qu es el p-fenilendiamina y cmo acta en la cadena respiratoria?
El p-fenilendiamina es un indicador redox, cuyo estado normal es reducido a un color marrn claro,
y cuando se oxida ocurre un cambio a color marrn oscuro.
En la cadena respiratoria, este compuesto acta cediendo electrones al citocromo C.

3. Grafique usted en una cadena de xido reduccin biolgica la accin de los indicadores
redox 2,6 diclorofenolindofenol y pfenilendiamina.

Succinato

Fumarato

Complejo
II
(FAD
Fe-S)
O2 + 2H+
NADH H+
Complejo
I
(Fe-S
FMN)

Complejo
III
(Cit b FeS Cit C)

Cit C

Complejo
IV
(Cit aa3
Cu)

NAD

O2

2,6-diclorofenolindofenol

p-fenilendiamina

4. Qu es un homogenizado de hgado y cmo se obtienen las fracciones celulares por

centrifugacin diferencial?
El homogeneizado de hgado se obtiene al homogenizar 10 gr de hgado cortados en fragmentos
pequeos. Se coloca en el homogenizador Potter y se le agrega 0.154 M de KCl. Se hace presin
manualmente con el mbolo girando hacia el fondo, trabajndose entre 0 y 4C.
El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocndolo en tubos de
polietileno, previa calibracin en la balanza, se emplea una centrfuga refrigerada. El sobrenadante
es separado en un beaker de 500ml. El sedimento constituye la fraccin nuclear y se coloca en un
beaker de 100ml.
El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrfuga
refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fraccin microsomal con el
citosol. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fraccin mitocondrial.

5. En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de xido reduccin?

Las fracciones celulares en que encontramos enzimas de xido-reduccin son:
- Fraccin mitocondrial: mitocondrias, lisosomas y peroxisomas.
- Homogeneizado total.
6. Haga un esquema de la centrifugacin diferencial
Homogeneizado de hgado

100 rev / 10 min

1500 rev / 15 min

Centrfuga

Centrfuga

CONCLUSIONES:
- En el homogeneizado se encuentran todas las fracciones, tanto nuclear, microsomal y
mitocondrial.
- La cadena respiratoria es un claro ejemplo de reacciones de oxidoreduccin, indispensable en la
transferencia de electrones.

PRACTICA N 05
EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE XIDO-REDUCCIN
I. REACTIVOS A UTILIZAR
-

Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4

2,6-diclorofenolindofenol 0.02 %

p-fenilendiamina 1%

Malato de sodio 0.1M

Rotenona 0.1M

Barbiturato de sodio 0.1M

Azida de sodio

Fraccin mitocondrial 10% (hgado de rata)

Armar el siguiente sistema:
TUBOS
COMPONENTES (en ml.)
Buffer fosfato 0.1M pH 7.4
2, 6-diclorofenol indofenol 0.02

I
II III IV V
1.2 1.5 1.0 0.5 0.5
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

VI
0.5
1.0

%
Malato 0.1M
Rotenona 0.1M
Barbiturato de sodio
Azida de sodio
Homogenizado mitocondrial

- 0.2 0.2 0.2 0.2

- 0.5 - 0.5
0.5 - 0.5 0.5 0.5

0.2
0.5
0.5

10%

Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.

Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).
En el sistema

pfenilendiamina + cadena rdox mitocondrial, verificar el efecto de los

inhibidores rotenona, barbital sdico y azida de sodio.

TUBOS
COMPONENTES (en ml.)
Buffer fosfato de sodio 0.1M

I
II III IV V
2.0 1.5 1.0 1.0 1.0

pH 7.4
Azida de sodio
Barbiturato de sodio 0.1M
Rotenona 0.1M
Pfenilendiamina 1%
Homogenizado de mitocondrias

- 0.5 - 0.5 - 0.5

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
- 0.5 0.5 0.5 0.5

10%

Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.

Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).
II. DESARROLLO Y RESULTADOS:
SISTEMA 01
En este sistema, el 2,6 diclorofenolindofenol acta como un aceptor de electrones entre la FMN y
la CoQ.
Si la mezcla queda azul, el inhibidor impide que el indicador se reduzca, es decir, que el inhibidor
actuar en una parte anterior a la FMN o que simplemente no hay enzimas.
Si la mezcla cambia de color a blanquecino, el inhibidor ataca en un lugar posterior a FMN o a la
CoQ o simplemente no hay inhibidor.

Tubo I: No hay sustrato pero si hay enzimas, por lo tanto no hay reaccin. Se mantiene el color
azul.
Tubo II: Si hay sustrato pero no hay enzimas, por lo tanto no hay reaccin. Se mantiene el color
azul
Tubo III: Si hay sustrato y enzimas pero no hay inhibidor, por lo tanto si hay reaccin. Cambia de
color azul a blanquecino.
Tubo IV: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (rotenona). La rotenona acta a nivel del complejo
I, no permite la reduccin del 2,6 diclorofenolindofenol. Se mantiene el color azul.
Tubo V: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (barbiturato de sodio). El barbiturato de sodio acta a
nivel del complejo I inhibiendo el paso de electrones al bloquear la transferencia desde Fe-S hacia
Q, pero el 2,6 diclorofenolindofenol acta primero en el FMN, pasando electrones a Fe-S, lo
cual permite un cambio parcial en cuanto al color. El color ser de un verde azulado.
Tubo VI: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (azida de sodio). La azida de sodio acta a nivel del
complejo IV, inhibiendo el paso de electrones de Cit c a Hem a + a 3, pero hay reaccin debido a
que el 2,6 diclorofenolindofenol acta a nivel del complejo I. El color cambia de azul a
blanquecino.

Sistema 01, enumeracin de izquierda a derecha: tubo I, tubo II, tubo III, tubo IV, tubo V y tubo VI.

SISTEMA 02

En este sistema, el pfenilendiamina acta cediendo electrones al citocromo C.

Si la mezcla queda marrn claro, el inhibidor impide que el indicador se oxide, es decir, que el
inhibidor actuar impidiendo que el indicador ceda electrones.
Si la mezcla cambia de color a marrn oscuro, el inhibidor ataca en un lugar anterior al cit C.
Tubo I: Si hay sustrato pero no hay enzimas, por lo tanto no hay reaccin. Se mantiene el color
marrn claro.
Tubo II: Si hay sustrato y enzimas pero no hay inhibidor, por lo tanto si hay reaccin. Cambia de
color a marrn oscuro.
Tubo III: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (azida de sodio). La azida de sodio acta a nivel del
complejo IV, inhibiendo el paso de electrones de Cit c a Hem a + a 3, y el p-fenilendioamina acta
a ese nivel, por lo tanto no hay reaccin. Se mantiene el color marrn claro.
Tubo IV: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (barbiturato de sodio). El barbiturato de sodio acta
a nivel del complejo I inhibiendo el paso de electrones al bloquear la transferencia desde Fe-S
hacia Q, pero el p-fenilendioamina acta en el cit C, por lo que se deduce que si hay reaccin.
Cambia de color a marrn oscuro.
Tubo V: Si hay sustrato, enzimas e inhibidor (rotenona). La rotenona acta a nivel del complejo I,
pero el p-fenilendioamina acta en el cit C, por lo que se deduce que si hay reaccin. Cambia de
color a marrn oscuro.

Sistema 02, enumeracin de izquierda a derecha: tubo I, tubo II, tubo III, tubo IV y tubo V.

RESOLUCIN DEL CUESTIONARIO

1. Qu inhibidores de la cadena de xido reduccin conoce y a qu nivel actan?
Inhibidores:
- Rotenona: inhibe al complejo I (inhibe el paso de electrones de Fe-S a CoQ)
- Barbiturato de Sodio: inhibe al complejo I
- Azida de Sodio: inhibe al complejo IV
- Antimicina A y dimercaprol: inhiben el complejo III
- Malonato: inhibe el complejo II
2. Si utiliza el indicador rdox 2,6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena
respiratoria, que cambios observara con la rotenona, barbiturato de sodio y azida de sodio?
- Rotenona: no permite que el indicador se reduzca. El indicador queda de color azul.
- Barbiturato de sodio: permite que el indicador se reduzca pero no se completa la reaccin,
habiendo reaccin parcial. El indicador queda de un color verde azulado.
- Azida de sodio: Permite que el indicador se reduzca. La azida de sodio acta a nivel del complejo
IV, inhibiendo el paso de electrones de Cit c a Hem a + a3, pero hay reaccin debido a que el 2,6
diclorofenolindofenol acta a nivel del complejo I. El color cambia de azul a blanquecino.
3. Si utiliza el indicador pfenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria, que
cambios observara con la rotenona, barbiturato de sodio y azida de sodio?
- Rotenona: Si hay reaccin puesto que la rotenona acta a nivel del complejo I. El indicador se
oxida. Queda de color marrn oscuro.
- Barbiturato de sodio: Si hay reaccin debudo a que el barbiturato de sodio acta a nivel del
complejo I. El barbiturato de sodio acta a nivel del complejo I inhibiendo el paso de electrones al
bloquear la transferencia desde Fe-S hacia Q, pero el p-fenilendioamina acta en el cit C, por lo que
se deduce que si hay reaccin. Cambia de color a marrn oscuro.

- Azida de sodio: La azida de sodio acta a nivel del complejo IV, inhibiendo el paso de electrones
de Cit c a Hem a + a3, y el p-fenilendioamina acta a ese nivel, por lo tanto no hay reaccin. Se
mantiene el color marrn claro.
4. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la
prctica.
SISTEMA 01

SISTEMA 02

SUSTRATO

Malato

p-fenilendioamina

ENZIMAS

Complejos I, III y IV

Complejos I, III y IV

5. Grafique usted en una cadena de xido reduccin biolgica, la accin de los inhibidores e
indicadores utilizados en el experimento.

Succinato

- Rotenona
- Barbiturato
de sodio

Fumarato

Complejo
II
(FAD
Fe-S)

- Azida de

O2 + 2H+

NADH H+
Complejo
I
(Fe-S
FMN)

Complejo
III
(Cit b FeS Cit C)

Cit C

NAD

Complejo
IV
(Cit aa3
Cu)
O2

2,6-diclorofenolindofenol

CONCLUSIONES

p-fenilendiamina

Los inhibidores de la cadena respiratoria pueden actuar en diferentes complejos o sitios

impidiendo el paso de electrones.

- El 2,6 diclorofenolindofenol y el p-fenilendiamina acta como indicadores de inhibicin de la
cadena respiratoria.

PRACTICA N 06
DETERMINACION DE AMILASA SERICA
I. REACTIVOS A UTILIZAR:

Sustrato de almidn Bufferado, pH 7.0 :

Solucin Stock de iodo :

Solucin iodada de trabajo:

Armar el siguiente sistema:
(Utilizar dos frascos volumtricos Erlenmeyer de 50 ml.)

II

PROBLE

BLANCO

MA
Sustrato de almidn Bufferado
5.0 ml.
5.0 ml.
Incubar a 37C durante cinco minutos ambos frascos
Retirar los frascos y agregar suero
0.1 ml.
Mezclar e incubar a 37C durante 7.5 minutos exactamente
Retirar los frascos y agregar suero
0.1 ml.
Agua destilada
35 ml.
35 ml.
Solucin iodada de trabajo.
5.0 ml.
5.0 ml.
Mezclar bien.

Leer en espectrofotmetro a 660 nm.

CLCULO
Absorbancia del
blanco

Absorbancia del
problema

_______________________________________

800

= Unidades de amilasa

por 100 ml
Absorbancia del blanco
(Se requiere un blanco por cada muestra de suero, debido a que las protenas sricas
disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo almidn y este podra
ser diferente).
II. DESARROLLO Y RESULTADOS:
Se prepararon 2 tubos de ensayo como sigue:
-

Tubo 1: control

Tubo 2: Analizador de la muestra

En ambos tubos se coloc 1 ml del sustrato 1 (solucin de almidn 500 mg/l tamponado a pH 7 con
buffer fosfato 0.1 mol/l en ClNa 0.15mol/l). Luego se dej unos minutos en bao Mara a 37 C.
Posteriormente se agreg la muestra, consistente de orina del paciente. Luego se adicion al
segundo tubo 20 l de la muestra (consistente de orina del paciente para este caso). Se mantiene la
incubacin a 37 C y a los 7 minutos y medio exactos se agreg en ambos tubos el reactivo de iodo
2 (solucin 0.01 eq/l de iodo en cido clorhdrico 0.02 mol/l). Se mezcla por agitacin suave y se
retiran los tubos del bao. Se agrega como ltimo aditivo 8 ml de agua destilada a cada tubo.
Finalmente se lee con un espectrofotmetro alrededor de 640 nm, llevando a 0 el aparato con agua
destilada.
Se obtuvo como resultado un valor de absorbancia para cada tubo de:
-

Tubo 1: 0.510

Tubo 2: 0.062
Posteriormente se procedi a realizar el clculo de la amilasa segn la frmula:
Amilasa (UA/dl) = C Dx 1000
C
Amilasa (UA/dl) = 0.510 0.062 x 1000

0.510

Utilizando la siguiente tabla de valores de referencia concluimos en el diagnstico del paciente:

Condicin clnica
Normal
Pancreatitis aguda
Pancreatitis crnica
Parotiditis
Parotiditis c/ complicacin
pancretica
Procesos abdominales
agudos (sin pancreatitis)

Suero (UA/dl)
< 120
300 12000
Hasta 200
200 350

Orina (UA/dl)
<260
ms de 900
ms de 300
350 750

ms de 350

ms de 750

normal

normal

El paciente presenta parotiditis con complicacin pancretica.

RESOLUCIN DEL CUESTIONARIO
1. De qu manera se activa el ion cloruro?
El ion cloruro acta como un cofactor de la enzima amilasa.
2. Qu semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada,
en funcin de la actividad enzimtica?
Usualmente la amilasa permanecen por ms tiempo en la orina que en el suero, de manera que las
concentraciones pueden ser variables. An as ambos tipos de enzima son funcionales, es decir
pueden ser detectados por pruebas como las de la prctica realizada.
3. Cmo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa heptica y pancretica
sometida a electroforesis?
Al ser dos isozimas, cabe esperar un comportamiento diferencial a la electroforesis. La razn
subyace al peso molecular diferente (debido a la secuencia de aminocidos diferente) y a la carga
total de la protena.
4. Por qu la concentracin de amilasa srica es menor durante los primeros meses de vida
lactante?
La actividad amilasa es nula al nacimiento y va aumentando hasta los tres aos, esto debido a que la
alimentacin al nacer se basa en la leche (lactosa) y no en alimentos que necesiten de una enzima

como la amilasa srica; sin embargo, es inducible por el sustrato, es decir dependen de la
alimentacin, al recibir el lactante formulas altas en almidn induciran niveles ms altos de
amilasa.
CONCLUSIONES:
- La presencia de un color ms claro en uno de los tubos nos indica la actividad de la amilasa en
este tubo.
- En la clnica, la determinacin de la amilasa srica sirve para medir la cantidad de amilasa en la
sangre y se usa como ayuda diagnstica para algunas enfermedades.