NORMA CHILENA OFICIAL

NCh2730.Of2002

Productos hidrobiolgicos - Determinacin de anaerobios

sulfito-reductores - Tcnica de recuento en placa

Prembulo
El Instituto Nacional de Normalizacin, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y
preparacin de las normas tcnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL
ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE
NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos.
La norma NCh2730 ha sido preparada por la Divisin de Normas del Instituto Nacional de
Normalizacin, y en su estudio participaron los organismos y las personas naturales
siguientes:
ANALAB Chile Ltda.
Centro de Estudios, Medicin y Certificacin
de Calidad, CESMEC Ltda.
Corthorn Quality Chile S.A.
Inspectorate Griffith Chile S.A.
Instituto de Investigaciones y Control, IDIC
Instituto Nacional de Normalizacin, INN
Servicio Nacional de Pesca, SERNAPESCA
SILOB Chile Laboratorio
TECNOLAB S.A.
Universidad Austral de Chile, ICYTAL
Universidad Catlica de Valparaso, Laboratorio de
Asistencia Tcnica
Universidad Catlica de la Santsima Concepcin, Laboratorio
de Control de Calidad, BIOTECMAR Servicios
Universidad de Antofagasta, Laboratorio de
Microbiologa Marina
Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Qumicas
y Farmacuticas

Vernica Manzano M.
Paula Mndez M.
Olga Ureta B.
Patricia Bravo O.
Axidalia Contreras A.
Carolina Moreno
Alejandro Canales U.
Luis Lpez V.
Sandra Corts A.
Guillermina Rodrguez P.
Csar Ramrez
Renate Schbit T.
Jeannette Jofr R.
Maribel Ruminot C.
Alejandro Rojas F.
Sonia Avendao V.

NCh2730
Esta norma se estudi dentro del marco del Proyecto FDI Optimizacin de la Certificacin
de Productos Pesqueros de Exportacin, para establecer un mtodo para la determinacin
de anaerobios sulfito-reductores en productos hidrobiolgicos.
Por no existir Norma Internacional, en la elaboracin de esta norma se ha tomado en
consideracin la norma AFNOR XP V 08-061: 1996 Microbiologie des aliments Dnombrement en anarobiose des bactries sulfito-rductrices par comptage des
colonies, siendo no equivalente a la misma al tener desviaciones mayores consistentes en:
-

la modificacin del ttulo;

aumentar a dos el nmero de placas a inocular; y

no considerar el mtodo de recuento en tubos.

El Anexo A forma parte del cuerpo de la norma.

El Anexo B no forma parte del cuerpo de la norma, se inserta slo a ttulo informativo.
Esta norma ha sido aprobada por el Consejo del Instituto Nacional de Normalizacin, en
sesin efectuada el 31 de Mayo de 2002.
Esta norma ha sido declarada Oficial de la Repblica de Chile por Resolucin Exenta N268,
de fecha 19 de Julio de 2002, del Ministerio de Economa, Fomento y Reconstruccin,
publicada en el Diario Oficial del 27 de Julio de 2002.

II

NORMA CHILENA OFICIAL

NCh2730.Of2002

Productos hidrobiolgicos - Determinacin de anaerobios

sulfito-reductores - Tcnica de recuento en placa

1 Alcance y campo de aplicacin

1.1 Esta norma establece el mtodo para la determinacin de anaerobios sulfito-reductores en
productos hidrobiolgicos.
1.2 Esta norma se puede aplicar a todos los alimentos de consumo humano o animal, a
menos que exista una norma especfica para el producto a ser analizado.

2 Referencias normativas
Los documentos normativos siguientes contienen disposiciones que, a travs de
referencias en el texto de la norma constituyen requisitos de la norma.
A la fecha de publicacin de esta norma estaba vigente la edicin que se indica a
continuacin.
Todas las normas estn sujetas a revisin y a las partes que deben tomar acuerdos,
basados en esta norma, se les recomienda investigar la posibilidad de aplicar las
ediciones ms recientes de las normas que se incluyen a continuacin.
NOTA - El Instituto Nacional de Normalizacin mantiene un registro de las normas nacionales e
internacionales vigentes.

NCh2047.Of1999
ISO 6887-1: 1999 (E)1)

1)

Microbiologa de los alimentos de consumo humano y animal Condiciones generales para los exmenes microbiolgicos.
Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of
test samples, initial suspension and decimal dilutions for
microbiological examination - Part 1: General rules for the
preparation of initial suspension and decimal dilutions.

Mientras no exista la norma chilena correspondiente, se debe usar esta norma.

NCh2730

3 Trminos y definiciones
Para los propsitos de esta norma, se aplican los trminos y definiciones siguientes:
3.1 anaerobios sulfito-reductores: bacterias que en condiciones de anaerobiosis, reducen
el sulfito a cido sulfhdrico, el cual precipita como sulfuro ferroso en presencia de sales
de hierro, formando colonias caractersticas negras
3.2 determinacin de anaerobios sulfito-reductores: determinacin del nmero de
bacterias sulfito-reductoras viables por gramo de muestra de ensayo
3.3 lote: conjunto homogneo de envases o unidades primarias, de peso, tipo y clase
similares, procesadas bajo condiciones semejantes, en una jornada de trabajo, las que se
identifican con una clave de produccin
3.4 muestra: conjunto de unidades representativas de un lote obtenidas mediante la
aplicacin de un plan de muestreo con el fin de realizar pruebas y anlisis microbiolgicos
3.5 productos hidrobiolgicos: productos de las diversas especies marinas o de aguas
interiores, frescos o procesados

4 Aparatos y materiales
Los aparatos y materiales deben cumplir con las condiciones establecidas en NCh2047,
corresponden a los usados en general en un laboratorio microbiolgico y, en particular, el
siguiente:
4.1 Estufa de incubacin, a 35C 1C o a 46C 1C (ver 7.5).
4.2 Bao termorregulado, a 46C 1C.
4.3 Homogeneizadores: Stomacher y/o licuadora con vasos esterilizables.
4.4 Bolsas estriles para Stomacher.
4.5 Cuenta colonias de campo oscuro.
4.6 Pipetas bacteriolgicas graduadas, de 1 ml, 5 ml y 10 ml.
4.7 Propipetas.
4.8 Placas Petri.
4.9 Medidor de pH, de 0,1 unidad de pH a 25C.
4.10 Balanza, de 0,1 g de resolucin.

NCh2730
4.11 Agitador mecnico.
4.12 Tubos, botellas o matraces de vidrio borosilicato, con tapas hermticas, para
dilucin.
4.13 Gabinete microbiolgico.
4.14 Termmetros de inmersin total con graduacin, de 0,1C.
4.15 Termmetros de inmersin parcial con graduacin, de 0,1C a 0,5C.
4.16 Equipo de filtracin por membranas.
4.17 Jarra de anaerobiosis u otro recipiente apropiado para el cultivo en anaerobiosis,
indicador de anaerobiosis y sistema generador de hidrgeno.

5 Medios de cultivo y reactivos

Se deben emplear los medios de cultivo deshidratados disponibles en el mercado, para su
preparacin se deben seguir las instrucciones del fabricante y cumplir con lo sealado en
NCh2047. En los casos excepcionales, en que fuese necesario preparar el medio de
cultivo en el laboratorio, se debe cumplir con lo sealado en Anexo A y con lo establecido
en NCh2047.
5.1 Diluyente: agua peptonada 0,1%.
5.2 Agar triptosa-sulfito-cicloserina (TSC), exento de yema de huevo.

6 Preparacin de la muestra de ensayo

6.1 Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el anlisis lo ms pronto
posible.
6.2 En caso de ser necesario postergar el anlisis, segn el tipo de muestra, sta se debe
mantener:
6.2.1 A temperatura -18C si la muestra es un producto congelado.
6.2.2 Entre 0C y 4C si la muestra corresponde a un alimento perecible no congelado, no
debiendo superar ms de 36 h en esta condicin.
6.2.3 A temperatura ambiente si la muestra corresponde a un alimento no perecible como
conserva o alimento con baja humedad.

NCh2730
6.3 Si la muestra est congelada, se debe descongelar en su envase original, o en el
recipiente en que lleg al laboratorio, durante un perodo mximo de 18 h si es en
refrigeracin con temperaturas entre 2C y 5C o durante un perodo no superior a 4 h si
es a temperatura ambiente.

7 Procedimiento para el anlisis

7.1 Requisitos generales
Se debe cumplir con las condiciones y precauciones establecidas en NCh2047.

7.2 Homogeneizacin de la muestra

El mtodo utilizado para la determinacin de anaerobios sulfito-reductores requiere
tratamiento previo de la muestra de ensayo, para liberar en el medio fluido
microorganismos que pueden estar aprisionados en el interior o adheridos en
superficies secas o gelatinosas del alimento. El procedimiento a utilizar es
homogeneizacin de la muestra.

del
los
las
la

7.2.1 Pesar en un vaso de licuadora o Stomacher las siguientes cantidades como muestra
de ensayo:
-

10 g si la muestra es homognea en especies y estado fsico;

25 g si la muestra es medianamente homognea; y

50 g si la muestra es heterognea, teniendo precaucin de tomar muestra para ensayo

de todos los componentes y tamaos.

7.2.2 Aadir a lo anterior las cantidades de diluyente que se indican:

-

90 ml si la muestra de ensayo corresponde a 10 g;

225 ml si la muestra de ensayo corresponde a 25 g;

450 ml si la muestra de ensayo corresponde a 50 g; o

250 ml a 50 g de muestra, para mejorar el lmite de deteccin (ver 8.3.2).

7.2.3 Homogeneizar la muestra de ensayo controlando cuidadosamente el tiempo. Si se

utiliza licuadora a una velocidad entre 15 000 r.p.m. y 20 000 r.p.m., el proceso no debe
superar los 2 min. Si se utiliza Stomacher el proceso no debe superar 1 min. Este
homogeneizado constituye la dilucin 10-1.

NCh2730
7.3 Dilucin de la muestra de ensayo
7.3.1 La dilucin 10-2 se obtiene al traspasar con una pipeta 1 ml del homogeneizado a un
tubo que contiene 9 ml del diluyente u otros volmenes, manteniendo la proporcin 1:9
entre homogeneizado y diluyente. Asegurar la homogeneidad de la mezcla.
7.3.2 Tomar 1 ml de la dilucin 10-2 y verter en un tubo que contiene 9 ml del diluyente u
otros volmenes, manteniendo la proporcin 1:9 entre homogeneizado y diluyente. De
este modo se obtiene la dilucin 10-3 y las diluciones decimales consecutivas que sean
necesarias (10-4, 10-5 o ms). La preparacin de cada nueva dilucin requiere del uso de
una pipeta nueva estril.

7.4 Inoculacin
El tiempo transcurrido entre homogeneizacin de la muestra de ensayo y la siembra, no
debe ser superior a los 15 min.
Antes de usar cada dilucin, se debe agitar bien a fin de asegurar su homogeneizacin.
7.4.1 Recuento en placas
7.4.1.1 A partir de la dilucin inicial 10-1, transferir a placas Petri, 1 ml en duplicado.
Repetir el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estril
para cada dilucin decimal (10-2, 10-3).
7.4.1.2 Verter en cada placa Petri aproximadamente 15 ml de agar TSC que ha sido
mantenido a 46C 1C en el bao termorregulado.
Mezclar de inmediato el agar fundido y el inculo para distribuir en forma homognea los
microorganismos. Dejar solidificar.
7.4.1.3 Despus de la solidificacin completa de la mezcla, verter, sobre la superficie del
medio inoculado, 10 ml a 15 ml de agar TSC a 46C 1C. Dejar solidificar.
7.4.1.4 Invertir las placas preparadas e introducirlas a la jarra de anaerobiosis.

7.5 Incubacin
Incubar a la temperatura acordada entre las partes, la que puede ser 35C 1C o a 46C
1C durante 20 h 2 h en la estufa de incubacin.
NOTAS
1)

Es recomendable observar frecuentemente los cultivos y si es necesario, efectuar recuentos durante y al

final del tiempo de incubacin. Si el recuento es realizado antes del tiempo de incubacin recomendado,
dejar constancia en el informe de ensayo.

2)

Una incubacin por un tiempo superior, puede traer como consecuencia un exceso de ennegrecimiento del
medio.

NCh2730
7.6 Recuento de colonias
Seleccionar las placas que contengan no ms de 150 colonias.
Contar las colonias negras caractersticas.

8 Expresin de resultados
8.1 Caso general
8.1.1 Calcular el nmero N de anaerobios sulfito-reductores presentes en la muestra de
ensayo, como la media ponderada de dos diluciones sucesivas, usando la ecuacin
siguiente:

N=

(1)

V (n1 + 0,1 n2 ) d

en que:

= suma de colonias
seleccionadas;

= volumen del inculo agregado a cada placa, en ml;

n1

= nmero de placas seleccionadas en la primera dilucin;

n2

= nmero de placas seleccionadas en la segunda dilucin;

= factor de dilucin correspondiente a la primera dilucin seleccionada.

caractersticas

contadas

en

todas

las

placas

Aproximar el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto, si la ltima cifra
est por debajo de cinco, no se modifica la cifra precedente; si la ltima cifra es cinco o
ms, aumentar la cifra precedente en una unidad. Proceder gradualmente hasta obtener
dos cifras significativas.
8.1.2 Tomar como resultado el nmero de anaerobios sulfito-reductores por gramo de
muestra expresado como un nmero entre 1,0 y 9,9 x 10x ufc (donde x es la
correspondiente potencia de 10 para x > y diferente de 0.
Recuento de anaerobios sulfito-reductores = N ufc anaerobios sulfito-reductores/g.
En Anexo B se muestra un ejemplo de clculo.

NCh2730
8.2 Caso en el cual las placas contienen menos de 15 colonias caractersticas
(recuentos estimados)
8.2.1 Si las dos placas, al nivel de la suspensin inicial contienen menos de 15 colonias
caractersticas, calcular el promedio de colonias contadas en ambas placas.
8.2.2 Tomar como resultado el nmero estimado N E = m d i1
en que:

= nmero promedio de colonias de anaerobiosis sulfito-reductores; y

di

= factor de dilucin de la suspensin inicial.

Recuento de anaerobios sulfito-reductores = N E ufc de anaerobios sulfito-reductores/g.

8.3 Colonias no caractersticas

8.3.1 Si las dos placas, correspondientes a la suspensin inicial, no contienen colonias
caractersticas, informar el resultado como se indica a continuacin:
<1 1/ d i ufc por gramo de muestra
en que:

di

= factor de dilucin de la suspensin inicial.

8.3.2 Si no se tiene desarrollo de colonias caractersticas, en la siembra en duplicado de la

dilucin inicial de 50 g de muestra en 250 ml de diluyente, el resultado se expresa
como < 6.

9 Informe
El informe de resultados debe incluir, a lo menos, los antecedentes siguientes:
9.1 Identificacin nica del informe.
9.2 Nombre y direccin del laboratorio donde se efectuaron los ensayos.
9.3 Nombre y direccin del solicitante.
9.4 Identificacin de la muestra.
9.5 Fecha de muestreo.

NCh2730
9.6 Fecha de recepcin de la muestra.
9.7 Fecha de ensayo de la muestra.
9.8 Identificacin del mtodo utilizado incluyendo la temperatura de incubacin.

9.9 Resultados
Recuento de anaerobios sulfito-reductores = N ufc de anaerobios sulfito-reductores/g.
9.10 Nombre y firma del responsable.
9.11 Acreditacin para esta tcnica, si existe (por ejemplo, ISO 17025).

NCh2730

Anexo A
(Normativo)

Composicin de medios de cultivo usados

A.1 Agua peptonada 0,1%
Composicin
Componente

Cantidad

Peptona

1g

Agua destilada

1L

Preparacin
Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.
Ajustar el pH, si es necesario, para que despus de la esterilizacin sea 7,0 0,2.
Dispensar en envases adecuados las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 min.

A.2 Agar triptosa-sulfito-cicloserina (TSC) exento de yema de huevo

A.2.1 Composicin del medio base
Componente
Peptona de carne1)

Cantidad
15 g

Peptona de soja

5g

Extracto de levadura

5g

Bisulfito sdico anhidro (Na2S2O5)

1g

Citrato de hierro (III) amoniacal2)

1g

Agar

3)

Agua destilada

9 g a 18 g
1L

1)

U otra peptona de calidad equivalente.

2)

Este reactivo debe contener por lo menos 15% (fraccin de masa) de hierro.

3)

De acuerdo al poder gelificante del agar.

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Preparacin
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua destilada a
ebullicin.
Ajustar el pH, si es necesario, para que despus de la esterilizacin sea 7,6 0,2 a 25C.
Dispensar en envases adecuados las cantidades requeridas.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 min.
El medio se puede almacenar a 3C 2C.

A.2.2 Solucin de cicloserina

Composicin
Componente
D-cicloserina (utilizar slo el polvo blanco cristalino)
Agua destilada

Cantidad
4g
100 ml

Preparacin
Disolver la D-cicloserina en el agua destilada y esterilizar la solucin por filtracin.
Conservar refrigerada a 3C 2C.
No utilizar la solucin despus de cuatro semanas de haber sido preparada.

A.2.3 Medio completo

Agregar 1 ml de la solucin esterilizada de D-cicloserina por cada 100 ml de medio base
estril, fundido y enfriar a 46C.

10

NCh2730

Anexo B
(Informativo)

Ejemplo de clculo
Ejemplo - Caso general
Un recuento de anaerobios sulfito-reductores dio los resultados siguientes:
-

en la primera dilucin seleccionada (10-1): 66 y 97 colonias caractersticas;

en la segunda dilucin seleccionada (102): 5 y 8 colonias caractersticas.

Reemplazando en ecuacin (1):

N=

V (n1 + 0,1 n2 ) d

= 66 + 97 + 5 + 81
1(2 + 0,1 2) 10
= 176 / 0,22 = 8 00
Aproximando el resultado como se especifica en 8.1.2 se obtiene:
800 = 8,0 102 ufc anaerobios sulfito-reductores por gramo de producto.

11

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INSTITUTO

NACIONAL

DE

NCh

NORMALIZACION

2730.Of2002

INN-CHILE

Productos hidrobiolgicos - Determinacin de anaerobios

sulfito-reductores - Tcnica de recuento en placa
Fish and marine products - Determination of sulphite-reducers anaerobes - Plate count
technique

Primera edicin : 2002

Descriptores:

productos hidrobiolgicos, anlisis microbiolgico, mtodos de conteo

(microbiologa), mtodos de conteo de bacterias, bacterias anaerbicas

CIN 67.120.30
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