Electroforesis de ADN

Francisco Fierro Fierro1

Introduccin
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologas
ms utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con cidos nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN
y ARN en funcin de su tamao, visualizarlos mediante una sencilla tincin, y de
esta forma determinar el contenido de cidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimacin de su concentracin y grado de entereza. Podemos adems
extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de inters, para posteriormente
utilizarlos en diferentes aplicaciones.
La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia
primordial en el desarrollo de las tcnicas del ADN recombinante o ingeniera
gentica. La idea de utilizar la tcnica de electroforesis a travs de una matriz
para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un bioqumico del
Instituto de Virologa de Glasgow, quien a mediados de los aos 60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que se

Departamento de Biotecnologa, Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud, Universidad Autnoma Metropolitana-Unidad Iztapalapa, Av. San Rafael Atlixco #186, Colonia
Vicentina. Delegacin Iztapalapa. CP 09340 Mxico D.F. fierrof@xanum.uam.mx.

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obtenan de partculas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que

una combinacin de fuerzas elctricas y de friccin permitira el desplazamiento y separacin en funcin del tamao o topologa de diferentes molculas de
ADN . ste es exactamente el principio en que se basa la electroforesis de cidos

nucleicos. Sometidos a un campo elctrico, la carga neta negativa del ADN y el

ARN har que estos se muevan en direccin al nodo (Figura 1A). Si se fuerza a

los cidos nucleicos a moverse a travs de un gel formado por una malla tridimensional de un polmero como la agarosa, la friccin har que las molculas de
mayor tamao migren con ms lentitud, mientras las de menor tamao avanzan
ms en el gel, permitiendo que las diferentes molculas se separen en funcin de
su tamao. Del mismo modo, molculas de ADN o ARN con topologas o estructuras tridimensionales diferentes tambin se comportarn de forma diferente
ante la friccin con la malla del polmero, permitiendo su separacin.
Mediante la electroforesis en gel de agarosa, Thorne logr separar y visualizar tres formas topolgicas diferentes del ADN del polyomavirus: superenrrollada, relajada y lineal, tras haber marcado el ADN con [3H] timidina (Thorne
1966, 1967). El trabajo de Thorne recibi poca atencin hasta principios de
los aos 70, cuando el empleo de enzimas de restriccin permiti el anlisis
de molculas de ADN mucho ms grandes que los genomas virales. Tambin
result de gran importancia el desarrollo de mtodos no radiactivos de tincin
del ADN con suficiente sensibilidad para detectar cantidades de ADN del orden
de nanogramos e inferiores. La utilizacin de bromuro de etidio para la deteccin de ADN en geles se desarroll independientemente por dos grupos (Aaij y
Borst 1972, Sharp et al. 1973), cuyos mtodos siguen utilizndose hasta hoy
sin apenas variaciones.
La electroforesis de ADN puede realizarse en geles de agarosa o de poliacrilamida. Ambos tienen caractersticas diferentes en cuanto a sus propiedades y
modo de preparacin, por lo que se utilizar uno u otro en funcin de la aplicacin
y objetivos que persigamos. La electroforesis en geles de agarosa es el mtodo
estndar para separar y purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un
alto poder de resolucin. Por su parte, la electroforesis en geles de poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitacin en cuanto al tamao de los fragmentos
que podemos separar (5-600 pb), posee un poder de resolucin mucho mayor,
permitiendo la separacin de molculas que difieren en un slo par de bases. Los
geles de poliacrilamida se corren de forma vertical y tienen la desventaja de ser
ms complicados en su elaboracin y manipulacin.
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Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Los geles de agarosa tienen un poder de resolucin mucho menor que

los de poliacrilamida, porque no permiten separar molculas de ADN que
difieren en tamao menos de unas 50 pb. Sin embargo, el rango de tamaos
que pueden separarse es mucho mayor en un gel de agarosa (molculas
desde 50 pb hasta unas 40 kb) dependiendo de la concentracin del mismo
(0.3-2% p/v); cuanto ms baja es la concentracin de agarosa mayor es
el tamao de las molculas que pueden separarse, y viceversa. Este rango
de tamaos hace a los geles de agarosa ideales para analizar el producto
de digestiones con enzimas de restriccin, lo que puede combinarse con
otras tcnicas como el Southern blot, as como para analizar los productos
de una reaccin de PCR . Los geles de agarosa convencionales se corren en
una cmara de electroforesis horizontal, con un campo elctrico uniforme
y constante.
La electroforesis en gel de agarosa tiene un lmite superior de unas 40-50
kb en el tamao de las molculas de ADN que puede separar. Por lo tanto, no es
posible separar el producto de digestiones con enzimas de restriccin de corte
infrecuente, como NotI o SfiI, y menos an separar cromosomas enteros (los
cromosomas de eucariotas inferiores tienen tamaos de entre 0.2 y 12 Mb).
Reducir la concentracin de agarosa hasta un 0.1 o 0.2% puede incrementar el
lmite de separacin hasta los 750 pb, sin embargo estos geles son extremadamente frgiles y muy difciles de manipular.
Esta limitacin de tamaos se super con el desarrollo de una tcnica denominada electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE: Pulsed Field
Gel Electrophoresis) (Figura 1B). Esta tcnica fue descrita inicialmente por
Schwartz y Cantor (1984), quienes construyeron un aparato de electroforesis ortogonal en el cual dos campos elctricos en ngulo sobre el gel funcionaban de forma alterna. El fundamento de esta tcnica es la reorientacin de las molculas cuando cambia la direccin del campo elctrico; en la
electroforesis convencional las molculas de ADN de gran tamao quedan
atrapadas en la malla que forma la agarosa en su avance a travs del gel,
pero la aplicacin de dos campos elctricos alternantes en ngulo permite
una reorientacin de las molculas que de esta forma avanzarn un tramo
ms, antes de quedar de nuevo atrapadas. Cuanto ms grandes son las molculas mayor debe ser la duracin de los campos elctricos alternos para
permitir la reorientacin y en ltima instancia la separacin de las mismas.
Adems de la duracin del tiempo de los pulsos, otros parmetros como la
Electroforesis de ADN

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Etapas de la tcnica
a) Obtencin de las muestras
de ADN

b) Preparacin del gel

de agarosa

c) Preparacin de las muestras

con el buffer de carga

d) Carga de las muestras

e) Corrida del gel

f) Teido del gel*

g) Visualizacin del gel con

luz ultravioleta y anlisis de
resultados
* Slo en caso de no utilizarse bromuro de etidio en el gel.

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Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Figura 1. A) Esquema del sistema de electroforesis convencional en gel de agarosa. El

rectngulo representa la cmara de electroforesis con los electrodos positivo y negativo, y en el centro en gris ms claro el gel de agarosa con sus pocillos. La flecha indica
la direccin de migracin del ADN. B) Esquema del fundamento del sistema de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE: Pulsed Field Gel Electrophoresis), en este
sistema dos campos elctricos en ngulo sobre el gel funcionan de forma alternante.
C) Esquema de uno de los sistemas de electroforesis en gel de campo pulsado ms
utilizados, el CHEF (Contour-Clamped Homogeneous Electric Field). Las lneas formando un hexgono representan los electrodos. La distribucin de cargas permite que el
campo elctrico sea homogneo en todo el gel y de esta forma evitar distorsiones en
la migracin del ADN en los diferentes carriles.

Electroforesis de ADN

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intensidad y el ngulo que forman los campos elctricos determinan el rango

de tamaos que pueden separarse. Desde la invencin del primer aparato
de PFGE, la tcnica se ha mejorado y se ha aumentado el lmite superior de
tamaos (Fierro et al. 2001), desarrollndose otros sistemas como el CHEF
(Contour-Clamped Homogeneous Electric Field) (Figura 1C), que han permitido la resolucin de cromosomas de eucariotas inferiores como los de los
hongos Neurospora crassa (Orbach et al. 1988) y Penicillium chrysogenum
(Fierro et al. 1993) con tamaos de hasta 10-12 Mb.

Protocolo

Electroforesis de ADN en gel de agarosa

La agarosa es un polmero lineal compuesto de residuos alternantes de
D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glucosdicos (13)
y (14). Las cadenas del polmero de agarosa forman fibras helicoidales, que
al solidificar forma una malla tridimensional de canales con dimetros entre
50 y >200 nm (Kirkpatrick 1990). Existen diferentes tipos de agarosa que se
clasifican en funcin de la temperatura a la que se disuelven y solidifican. Las
agarosas estndar se disuelven en el buffer a una temperatura de 90-95C y
solidifican a 35-45C. Las agarosas de bajo punto de fusin se disuelven a unos
65C y solidifican a 30-35C. Existen adems otros tipos, como las agarosas
de alta fuerza de gel o las de baja viscosidad, que permiten respectivamente
una mejor separacin y un rango inferior del tamao de las molculas a separar. La concentracin (p/v) de la agarosa es un parmetro de gran importancia
pues determina el rango de tamaos en los que obtendremos una buena separacin de los fragmentos de ADN. En la Tabla 1 se muestran las concentraciones de agarosa que es recomendable utilizar en funcin del rango de tamao
que pretendamos separar.

Equipo
Cmara horizontal de electroforesis con los accesorios correspondientes (molde para hacer el gel, peine, cables para conectar a la fuente de
alimentacin)
Fuente de alimentacin o de poder
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Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

 Transiluminador (fuente de luz ultravioleta)

Equipo fotogrfico que permita tomar fotos del gel
Estos dos ltimos aparatos es preferible sustituirlos por un equipo de anlisis
de geles, el cual incluye la fuente de luz ultravioleta, el equipo fotogrfico para
la toma y digitalizacin de imgenes, y un equipo de cmputo con Software
que permite distintos tipos de anlisis, como el densitomtrico. Ejemplos de
este tipo de equipos son el Molecular Imager ChemiDoc XRS System de Biorad,
o el ImageQuant 300 de GE Healthcare.
Adems se requerir de un potencimetro, una balanza y una autoclave
para preparar y esterilizar las soluciones necesarias.
Tabla 1. Rango de separacin de tamaos de ADN en funcin de la concentracin y el
tipo de agarosa utilizados.
Agarosa
(%)

Estndar

Alta fuerza de
gel (High gel
strength)

Gel de baja
temperatura de fusin
(Low gelling/
melting
temperature)

0.3

1 kb 40 kb

0.5

700 pb 25 kb

0.8

500 pb 15 kb

800 pb 10 kb

800 pb 10 kb

1.0

250 pb 12 kb

400 pb 8 kb

400 pb 8 kb

1.2

150 pb 6 kb

300 pb 7 kb

300 pb 7 kb

1.5

80 pb 4 kb

200 pb 4 kb

200 pb 4 kb

2.0

60 pb 2.5 kb

100 pb 3 kb

100 pb 3 kb

3.0

50 pb 1 kb

Gel de baja temperatura de fusin

y baja viscosidad
(Low gelling/melting temperature,
low viscosity)

50 pb 1 kb

4.0

100 pb 500 pb

6.0

10 pb 100 kb

Material
Micropipetas
Puntas para micropipeta
Tubos tipo eppendorf
Electroforesis de ADN

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 Un matraz, probetas y vasos de precipitados para la preparacin de

soluciones
Esptulas
Guantes impermeables para el manejo del bromuro de etidio

Reactivos
Agarosa (CAS N 9012-36-6)
Tris base (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol, CAS N 77-86-1)
cido actico glacial (CAS N 64-19-7)
EDTA (cido etilendiaminotetraactico, CAS N 60-00-4)
cido brico (CAS N 10043-35-3)
NaOH (hidrxido de sodio, CAS N 1310-73-2)
Sacarosa (CAS N 57-50-1)
Glicerol (CAS N 56-81-5)
Azul de bromofenol (CAS N 115-39-9)
Xileno cianol (CAS N 2650-17-1)
Bromuro de etidio (CAS N 1239-45-8)

Soluciones y buffers
Como buffer de electroforesis y para la preparacin del gel puede utilizarse
opcionalmente TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El TAE tiene
una menor capacidad de amortiguacin que el TBE, y puede resultar en una
acidificacin del medio si la electroforesis se desarrolla durante un periodo muy
prolongado, pero funciona muy bien con tiempos normales de electroforesis,
adems tiene una mayor capacidad de resolucin que el TBE para tamaos
grandes de ADN. Ambos suelen prepararse como soluciones concentradas, que
pueden almacenarse a temperatura ambiente (previa esterilizacin en autoclave), stas se diluyen con agua antes de cada electroforesis para lograr la
concentracin de uso: 1x para el TAE y 0.5x para el TBE.
Buffer TAE (50x) 1 L
Tris base, 242 g; cido actico glacial, 57.1 ml; 0.5 M EDTA pH 8, 100 ml.
Ajustar hasta 1 litro con agua destilada o desionizada.
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Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Buffer TBE (5x) 1 L

Tris base, 54 g; cido brico, 27.5 g; 0.5 M EDTA pH 8, 20 ml. Ajustar hasta 1
litro con agua destilada o desionizada.
El EDTA debe estar preparado previamente: Se aade al agua destilada o
desionizada (un volumen 20% inferior al volumen final deseado) la cantidad
adecuada de EDTA para obtener una concentracin final de 0.5 M. Se ajusta el
pH con NaOH hasta que el EDTA se disuelva y llegue la solucin a un pH de 8. Se
ajusta el volumen, se esteriliza y se conserva a temperatura ambiente.
Buffer de carga
El buffer de carga debe tener una alta densidad que permita que la muestra se
introduzca en el pocillo del gel, adems de colorantes que nos indiquen cuando
debe detenerse la electroforesis. Existen varios tipos de buffers de carga, a
continuacin se detallan los dos ms utilizados (la inclusin de xileno cianol es
opcional)
Buffer de carga tipo I (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol;
40% sacarosa, en agua. Almacenar a 4C.
Buffer de carga tipo II (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol;
30% glicerol, en agua. Almacenar a 4C.
Solucin de bromuro de etidio
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre las bases nitrogenadas) que se usa como colorante fluorescente para la visualizacin
de cidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida. El BrEt absorbe luz
ultravioleta de 300 nm, y emite una luz anaranjada de 590 nm, mediante
la cual podemos observar la posicin y cantidad relativa del ADN en el gel tras
la electroforesis.
La solucin stock de BrEt se prepara a una concentracin de 10 mg/ml en
agua, y se conserva a temperatura ambiente o a 4C en un tubo envuelto en
papel de aluminio. Existen dos formas diferentes de realizar el teido del ADN:

Electroforesis de ADN

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1. Preparar el gel con BrEt incorporado.

2. Teir el gel una vez finalizada la electroforesis con una solucin de BrEt.
En ambos casos, la concentracin final del BrEt en el gel o en la solucin de

teido debe ser de 0.5 g/ml.

Existen alternativas a la tincin con BrEt. El SYBR Gold (nombre comercial) es un colorante muy sensible con una elevada afinidad por el ADN, que
puede detectar cantidades de tan slo 20 pg de ADN. Se utiliza en una dilucin 1/10 000 en agua para el teido del gel tras la electroforesis. Su
elevado precio hace que slo sea recomendable su uso para la deteccin de
cantidades muy pequeas de ADN que no sean detectables mediante tincin
con BrEt. Otros colorantes disponibles actualmente son el SYBR Green, tambin de alta sensibilidad, y el SYBR Safe, con una sensibilidad similar al BrEt
pero menor capacidad mutagnica. Existen adems toda una nueva gama
de colorantes con diferentes propiedades para la tincin del ADN; compaas
como Invitrogen han desarrollado un buen nmero de estos colorantes, con
diferentes niveles de sensibilidad y destinados a diferentes aplicaciones (ver
referencia en http://www.invitrogene.com).

Antes de empezar
Para realizar la tcnica de electroforesis de ADN en gel de agarosa debe estar preparado el siguiente material antes de comenzar: muestras de ADN, marcador de tamao
o peso molecular, buffer de electroforesis (TAE o TBE), buffer de carga, solucin de
teido de bromuro de etidio, adems de todo el equipo de laboratorio y material que
se indican en las secciones correspondientes.
Marcador de tamaos. La utilizacin de un marcador de tamao es fundamental
para tener una referencia de los tamaos del ADN en las muestras. Algunos de los
ms utilizados son: Lambda 1 kb ladder (fermentas), GeneRuler 50 bp DNA Ladder
(Fermentas), y ADN del fago lambda digerido con la enzima de restriccin HindIII.

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Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Mtodo
1. Preparacin del gel de agarosa
1.1. Pesar la cantidad de agarosa necesaria para obtener la concentracin
deseada (ver Tabla 1) en funcin del volumen de gel.
1.2. Aadir la agarosa al buffer (TAE 1x o TBE 0.5x) en un matraz.
1.3. Calentar la mezcla en un horno de microondas hasta que se observe
que toda la agarosa se ha fundido.
1.4. Dejar enfriar la solucin de agarosa hasta una temperatura de unos
50 C (Nota: si se opta por aadir el BrEt al gel debe realizarse en este momento, a una concentracin final de 0.5 g/ml).
1.5. Mientras la solucin de agarosa se enfra, preparar el molde en el que se
va a hacer el gel sellando los bordes con cinta masking, o colocndolo en el
dispositivo previsto para ello, y colocando el peine en la posicin deseada.
1.6. Verter cuidadosamente la solucin de agarosa sobre el molde nivelado y dejar que solidifique durante al menos 30 min.
2. Preparacin de las muestras
2.1. Mezclar tanto las muestras de ADN como el marcador de tamao con
0.2 volmenes del buffer de carga 6x. El volumen total estar determinado
por el tamao de los pocillos, habitualmente 15-30 l.
3. Carga de las muestras y corrida del gel
3.1. Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y colocar el molde con el gel en la cmara de electroforesis.
3.2. Aadir buffer de electroforesis (TAE 1x o TBE 0.5x) hasta que cubra el
gel unos 3-5 mm.
3.3. Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos
para las muestras.
3.4. Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon en el paso 7.
Nota: Dependiendo del tipo de muestra y del marcador, frecuentemente es
conveniente calentar a 65C las muestras durante 3-5 min y enfriarlas en
hielo antes de cargarlas.
3.5. Conectar los cables a la fuente alimentacin y aplicar un voltaje
de 20-150 V (1-5 V/cm de acuerdo a la distancia entre los electrodos).
El ajuste del voltaje es muy variable dependiendo de la cmara y de los
Electroforesis de ADN

37

tamaos que se pretenden separar, se recomienda voltajes no muy altos

para tamaos muy grandes del ADN.
Nota: Debe tenerse en cuenta que el ADN migra hacia el nodo, por lo que
debe disponerse correctamente la orientacin del gel y de los cables.
3.6. Correr el gel hasta que el colorante azul de bromofenol est a una
distancia del borde de aproximadamente un 25% de la longitud total del
gel. En ese momento debe detenerse la electroforesis.
4. Tincin del gel y visualizacin del ADN
4.1. Si no se aadi el BrEt al gel (paso 1.4), ste debe teirse una vez finalizada la electroforesis. Para ello se saca el gel de su molde y se sumerge
en una solucin de BrEt (0.5 g/ml) durante al menos 15 min.
Nota: Ambas formas de tincin rinden resultados similares, pero se recomienda la tincin una vez finalizada la electroforesis para mantener el molde, peine y cmara libres de BrEt.
4.2. Colocar el gel sobre un transiluminador y encender la lmpara de
luz ultravioleta ( 300 nm), el ADN se visualizar como bandas de color
anaranjado.
4.3. (Opcional) Si hay bandas de tamao pequeo que no se visualizan bien puede hacerse una etapa de desteido con H2O o 1 mM MgSO4 durante 20 min.
4.4. Fotografiar el gel con el sistema fotogrfico disponible.

Electroforesis en gel de campo pulsado

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE: Pulsed-Field Gel Electrophoresis)
permite la separacin de molculas de ADN de tamao muy elevado (ver introduccin). Las principales diferencias con la electroforesis convencional se
encuentran en la preparacin de las muestras, el equipo de electroforesis y la
eleccin de los parmetros (tiempo de pulsos, voltaje, etc.) en funcin del rango
de tamaos que se pretende separar. A continuacin se indica cmo afectan
diferentes parmetros al rango de separacin en la PFGE, tomando como referencia el sistema CHEF (Contour-Clamped Homogeneous Electric Field):
Tiempo de pulsos. Es el parmetro clave que determinar el rango de tamaos
que se puedan separar en una electroforesis PFGE. Cuanto mayor sea el tamao
a separar mayor debe ser el tiempo de pulsos. Las mejores resoluciones se obtienen realizando una rampa de tiempos, es decir, se comienza la electroforesis
38

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

con un tiempo de pulsos determinado (por ejemplo, 60 seg) y ste va subiendo

gradualmente hasta un valor final (por ejemplo, 150 seg) que se alcanza al finalizar la electroforesis. Los valores que se dan a continuacin son aproximados:
Tamao

Tiempo de pulsos

10 - 800 Kb

6-80 seg

100 Kb - 1 Mb

60-90 seg

0.2 Kb - 2 Mb

60-120 seg

1 - 3 Mb

5-20 min

3 - 6 Mb

20-75 min

5 - 11 Mb

75-220 min

Intensidad de campo (voltaje). Molculas de ADN de hasta 2 Mb de tamao

pueden separase con voltajes de 4-6 V/cm. Tamaos mayores requieren voltajes ms bajos para evitar la rotura del ADN; molculas de 2 a 5 Mb se separan
bien con 1.2 a 3.5 V/cm, mientras que molculas de muy elevado tamao (> 6
Mb) requieren voltajes de 1-1.5 V/cm.
Tiempo total de electroforesis. Este parmetro est muy relacionado con el
anterior. Cuanto ms grandes son los tamaos a separar se requieren voltajes
ms bajos, y como consecuencia tiempos ms largos. Tamaos hasta 2 Mb
pueden resolverse en 24-48 h. Tamaos entre 2 y 6 Mb necesitarn tiempos
de 3-7 das. Y tamaos superiores a 6 Mb necesitarn siempre tiempos no
inferiores a 6 das.
Concentracin de agarosa. Mientras que en la electroforesis convencional
este parmetro es crucial para separar distintos rangos de tamaos, en la PFGE
su importancia no es tan grande. Tamaos mayores de ADN requerirn concentraciones de agarosa ms bajas. Las concentraciones que se utilizan con ms
asiduidad son de 0.6-1.2% (p/v).
ngulo de separacin de los campos elctricos alternantes. Suele depender
del diseo del equipo de electroforesis, a veces puede ser ajustado y a veces no.
El ngulo oscila entre 96 y 165, y los que se usan con ms frecuencia son 110120. En general un ngulo mayor permite una mejor resolucin en tamaos pequeos (10-500 Kb).
Temperatura. El buffer de electroforesis tiene que estar refrigerado entre
4-15C, para lo cual los sistemas de PFGE comerciales disponen de un refrigerador. La temperatura baja permite una mejor definicin de las bandas en el gel.
Electroforesis de ADN

39

Equipo
Un equipo completo para electroforesis en gel de campo pulsado (sistemas
OFAGE, CHEF, RGE, etc.) (Fierro et al. 2001), con su fuente de alimentacin,

refrigerador del buffer, molde para preparacin de muestras, charola para

preparar el gel y peine.
Un transiluminador (fuente de luz ultravioleta) y equipo fotogrfico. O preferiblemente un equipo integrado de anlisis de geles (ChemiDoc system
de Biorad o similar).
Adems se requerir de un potencimetro, una balanza y una autoclave
para preparar y esterilizar las soluciones necesarias.

Material
El mismo que para la electroforesis convencional en gel de agarosa.
Reactivos
Agarosa (CAS N 9012-36-6) de alto grado de pureza (a veces denominada de grado cromosomal)
Agarosa de bajo punto de fusin
Tris base (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol, CAS N 77-86-1)
EDTA (cido etilendiaminotetraactico, CAS N 60-00-4)
cido brico (CAS N 10043-35-3)
NaOH (hidrxido de sodio, CAS N 1310-73-2)
Bromuro de etidio (CAS N 1239-45-8)
Soluciones y buffers
Como buffer de electroforesis y para la preparacin del gel se utiliza TBE 0.5x
(ver protocolo de la electroforesis convencional en gel de agarosa).
Solucin de agarosa de bajo punto de fusin al 1% en buffer TBE 0.5x.
Esterilizar y conservar a temperatura ambiente una vez que solidifique.
Solucin de bromuro de etidio (ver protocolo de la electroforesis convencional en gel de agarosa). El gel se tie siempre despus de la electroforesis, no
se aade el BrEt al gel durante su preparacin.
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Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Mtodo
1. Preparacin de las muestras
1.1. La obtencin de ADN cromosomal intacto o de muy alto peso molecular debe realizarse lisando clulas que estn previamente inmovilizadas
en bloques de agarosa de bajo punto de fusin. De esta forma se evitan
las roturas de las hebras de ADN que se produciran en una solucin lquida.
Las clulas son entonces sometidas a un tratamiento para provocar su lisis
y la liberacin del ADN, que quedar embebido en el bloque de agarosa,
cargndose ste directamente en el gel. Existen diferentes protocolos en
funcin del tipo de clulas: clulas animales (Sambrook y Russell 2000a),
levaduras y hongos (Sambrook y Russell 2000b). Cuando la PFGE se utiliza para separar los productos de digestin con enzimas de restriccin de
baja frecuencia de corte, el proceso de digestin se lleva a cabo con el ADN
dentro del bloque de agarosa, hacia el cual las enzimas difunden desde una
solucin acuosa (ver protocolo descrito por Sambrook y Russell 2000c).
2. Preparacin del gel de agarosa
2.1. El gel de agarosa se prepara de forma idntica a como se describi
para los geles de la electroforesis convencional, con TBE 0.5x
3. Carga de las muestras y corrida del gel
3.1. Una vez que el gel ha solidificado, retirar cuidadosamente el peine
para que queden libres los pocillos.
3.2. Con la ayuda de una esptula cargar los bloques de agarosa con la
muestra de ADN y el marcador de tamao en los pocillos.
3.3. Sellar los pocillos con una solucin de agarosa de bajo punto de fusin
al 1% en TBE 0.5x (previamente fundida), y dejarla durante al menos 15
min.
3.4. Retirar el sellado de los bordes y sacar gel del molde, para colocarlo en
la cmara de electroforesis.
3.5. Aadir buffer de electroforesis (TBE 0.5x) hasta que cubra el gel unos
3-5 mm.
3.6. Ajustar todos los parmetros de electroforesis (tiempo de pulsos,
tiempo total, voltaje, temperatura del buffer) en el mdulo de control.
Electroforesis de ADN

41

3.7. Cerrar la tapa de la cmara, conectando los cables a la fuente alimentacin, y comenzar el proceso de electroforesis.
3.8. En los geles de PFGE no tenemos un colorante del tipo de azul de
bromofenol como referencia que nos indique cuando debemos de finalizar la electroforesis. El tiempo de corrida debe establecerse de antemano, junto con el resto de parmetros, en funcin de los tamaos a
separar, el voltaje, lo publicado en la literatura y la propia experiencia. Si
se van a separar fragmentos de restriccin cuyo tamao oscilar aproximadamente entre 6 y 500 Kb s puede ser de utilidad cargar un pocillo
con una solucin de xileno cianol y finalizar la electroforesis despus de
que ste haya rebasado el borde del gel.
4. Tincin del gel y visualizacin del ADN
4.1. Sacar el gel de la cmara de electroforesis y sumergirlo en una solucin
de BrEt (0.5 g/ml) durante al menos 30 min. Nota: Con frecuencia es conveniente realizar una etapa de desteido con H2O o 1 mM MgSO4 durante 20
min.
4.2. Colocar el gel sobre un transiluminador y encender la lmpara de
luz ultravioleta ( 300 nm), el ADN se visualizar como bandas de color
anaranjado.
4.3. Fotografiar el gel con el sistema fotogrfico disponible.

Electroforesis de ADN en gel de poliacrilamida no desnaturalizante

La poliacrilamida es un polmero formado por largas cadenas del monmero
acrilamida que se unen transversalmente mediante N,N-metilenbisacrilamida.
La principal ventaja de los geles de acrilamida sobre los de agarosa es su mayor capacidad de resolucin, y adems, la posibilidad de cargar una mayor
cantidad de ADN, mientras que una de las desventajas es la limitacin en el
tamao del ADN a separar, alrededor de 500-600 pb. El rango de tamaos
que pueden separarse depende de la concentracin de acrilamida en el gel
(Tabla 2).
Los geles de poliacrilamida desnaturalizantes se usan para separar fragmentos de ADN monocatenario, y se utilizan en tcnicas como la secuenciacin, DGGE o extensin del primer, mientras que los no desnaturalizantes se
usan para separar ADN bicatenario. En este captulo describiremos nicamen42

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Tabla 2. Rango de separacin de tamaos de ADN (cadena doble) en funcin de la

concentracin de acrilamida y migracin de los colorantes en equivalencia con tamao del ADN.
Acrilamida (%)

Rango de
separacin (pb)

Xileno cianol

Azul de
bromofenol

3.5

1 000 2 000

460

100

80 500

260

65

60 400

160

45

12

40 200

70

20

15

25 150

60

15

20

6 100

45

12

te los geles de poliacrilamida no desnaturalizantes (para los desnaturalizantes vase captulo de DGGE).
Equipo
Se requiere el mismo equipo que para la electroforesis en gel de agarosa, a
excepcin de la cmara de electroforesis, la cual debe ser una cmara vertical
para geles de poliacrilamida, con todo su material adicional (cristales, separadores, pinzas, peines, etc.).
Material
Micropipetas
Puntas
Tubos tipo eppendorf
Tubos falcon o similares
Probetas y vasos de precipitados para la preparacin de soluciones
Guantes impermeables para el manejo del bromuro de etidio y la
acrilamida
Cubrebocas si se va a utilizar acrilamida en polvo

Electroforesis de ADN

43

Reactivos
Acrilamida (CAS N 79-06-1)
N,N-metilenbisacrilamida (CAS N 110-26-9)

TEMED (N,N,N,N-tetrametiletilendiamina, CAS N 110-18-9)

Persulfato de amonio (CAS N 7727-54-0)

Tris base (2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol, CAS N 77-86-1)
cido brico (CAS N 10043-35-3)
EDTA (cido etilendiaminotetraactico, CAS N 60-00-4)
NaOH (hidrxido de sodio, CAS N 1310-73-2)
Sacarosa (CAS N 57-50-1)
Glicerol (CAS N 56-81-5)
Azul de bromofenol (CAS N 115-39-9)
Xileno cianol (CAS N 2650-17-1)
Bromuro de etidio (CAS N 1239-45-8)
Soluciones y buffers
La solucin acrilamida/N,N-metilenbisacrilamida (29:1) suele adquirirse ya
preparada, de casas comerciales como Biorad. Si se va a preparar a partir de
acrilamida y N,N-metilenbisacrilamida slidas, se pesan ambas (dentro de una
campana extractora o usando un cubrebocas) y se disuelven en agua destilada
o desionizada a una concentracin final del 30% (peso/volumen) manteniendo
la proporcin 29:1. A continuacin se filtra la solucin a travs de un papel de
filtro y se guarda a 4C protegida de la luz.
Como buffer de electroforesis se utiliza TBE (Tris-Borato EDTA) en concentracin 1x o 0.5x (ver protocolo de la electroforesis convencional en gel de
agarosa).
Buffer de carga. Se utilizan los mismos que en la electroforesis convencional en gel de agarosa.
Solucin de bromuro de etidio (ver protocolo de la electroforesis convencional en gel de agarosa). El gel se tie siempre despus de la electroforesis,
no se aade el BrEt al gel durante su preparacin. El SYBR Gold o la tincin con
plata (vase captulo de DGGE) son una alternativa si se usan concentraciones
muy bajas de ADN.

44

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Mtodo
1. Preparacin del gel de poliacrilamida
1.1. Limpiar las superficies de los cristales con un detergente lquido y aclarar con abundante agua, haciendo un ltimo aclarado con agua destilada o desionizada. Aclararlos finalmente con etanol y dejarlos secar.
1.2. Mezclar en un tubo los componentes del gel de poliacrilamida proporcionalmente a las cantidades que se muestran en la Tabla 3, de
acuerdo al porcentaje de acrilamida que se vaya a utilizar y al volumen de gel requerido. Aadirlos en el siguiente orden: H2O, solucin
acrilamida/N,N-metilenbisacrilamida, TBE 5x, 10% persulfato de
amonio.
Tabla 3. Volumen de los componentes para geles de poliacrilamida de diferentes porcentajes, en base a un volumen total de 100 ml.
Acrilamida
(%)

Solucin
Acrilamida/N,NMetilenbisacrilamida (29:1) (ml)

H2O (ml)

TBE 5x (ml)

10%
Persulfato
de amonio
(ml)

3.5

11.6

67.7

20

0.7

16.6

62.7

20

0.7

26.6

52.7

20

0.7

12

40.0

39.3

20

0.7

20

66.6

12.7

20

0.7

1.3. Ensamblar cristales y separadores y sujetarlos fuertemente con

pinzas.
Nota: Algunos sistemas de electroforesis incluyen sistemas de ensamblaje que
previenen que el gel se filtre y se salga del receptculo de los cristales cuando
est an lquido. En caso contrario conviene hacer un sellado en la parte inferior
colocando los cristales ya ensamblados sobre un pequeo volumen de agarosa
1% fundida, de modo que sta ascienda por capilaridad unos milmetros dentro
del espacio entre los cristales. Una vez solidificada la agarosa impedir que haya
filtraciones del gel por la parte inferior.
1.4. A la solucin preparada en el punto 1.2, aadirle 50 l de TEMED por
cada 100 ml de solucin. Mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo.
Electroforesis de ADN

45

1.5. Aadir la solucin con una pipeta o punta de micropipeta en el espacio

entre ambos cristales, de manera que se vaya depositando en el fondo sin
formar burbujas, hasta llegar a la parte superior, casi hasta el borde.
1.6. Colocar el peine entre ambos cristales cuidando que no se formen
burbujas en el gel.
1.7. Dejar polimerizar el gel durante al menos 30 min a temperatura ambiente. Si el gel se retrae en la parte superior aadir ms solucin hasta el
borde de los cristales.
2. Preparacin de las muestras
2.1. Mezclar las muestras de ADN y el marcador de tamao con 0.2 volmenes del buffer de carga 6x. El volumen total vendr determinado por el
tamao de los pocillos, habitualmente 20-30 l.
3. Carga de las muestras y corrida del gel
3.1. Una vez que el gel ha polimerizado retirar el peine y montar los cristales con el gel en la cmara de electroforesis.
3.2. Aadir buffer de electroforesis (TBE 0.5x) en los receptculos inferior
y superior de la cmara.
3.3. Con una punta fina de micropipeta o una jeringa Hamilton limpiar el
espacio de los pocillos haciendo entrar con fuerza solucin TBE 0.5x.
3.4. Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon en el paso 2.1,
utilizando una punta fina de micropipeta o una jeringa Hamilton.

Nota: Dependiendo del tipo de muestra y del marcador, frecuentemente es conveniente calentar a 65C las muestras durante 3-5 min y
enfriarlas en hielo antes de cargarlas.

3.5. Conectar los cables a la fuente de alimentacin y aplicar el voltaje requerido por la cmara (polo positivo en el reservorio inferior de la cmara).
3.6. Correr el gel hasta que los colorantes estn a la distancia deseada (ver
Tabla 2). Apagar la fuente de alimentacin, desconectar los cables y
desmontar de la cmara los cristales con el gel.
4. Tincin del gel y visualizacin del ADN
4.1. Abrir los cristales con una esptula y cuidadosamente despegar el gel,
para sumergirlo en una solucin de BrEt (0.5 g/ml) durante al menos 30
min. (Alternativamente, si el gel es grande o de muy bajo porcentaje, puede
teirse sin despegarlo del cristal).
46

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

4.2. Colocar el gel sobre un transiluminador y encender la lmpara de luz

ultravioleta ( 300 nm), el ADN se visualizar como bandas de color anaranjado. Advertencia!: La piel y sobretodo los ojos deben estar debidamente protegidos de la luz UV por bata, guantes y una pantalla o cubreojos
de metacrilato.
4.3. Fotografiar el gel con el sistema fotogrfico disponible.

Mtodos de anlisis
El anlisis de los geles de agarosa y poliacrilamida se realiza preferiblemente en un aparato documentador de geles (por ejemplo el Molecular Imager
ChemiDoc XRS System de Biorad), los cuales tienen incorporado un software
que permite guardar fotografas del gel en formatos como TIFF, JPG, etc., adems de llevar a cabo anlisis densitomtricos cuando se necesite realizar una
cuantificacin precisa de la intensidad de las bandas en el gel. Esta cuantificacin puede tener distintas aplicaciones, por ejemplo la estimacin de la concentracin de ADN en una muestra mediante comparacin con otra muestra
de concentracin conocida, y la comparacin de las cantidades de ADNc en un
experimento de RT-PCR semicuantitativa. Adems los programas de anlisis
pueden realizar una estimacin del tamao de los fragmentos por comparacin con los marcadores de peso molecular utilizados.

Aplicaciones
La aplicacin bsica de las tcnicas de electroforesis de ADN es la separacin
de fragmentos de ADN en una muestra y su visualizacin, para comprobar
aspectos como el tamao de los fragmentos, la concentracin, la entereza y
otros. Los fragmentos que sean de inters pueden purificarse a partir del gel
mediante diferentes tcnicas de extraccin, y utilizarse para diferentes propsitos (clonacin, secuenciacin, mutagnesis, fusin con otros fragmentos,
utilizacin como sondas, etc.).
De forma particular, cada una de las tres tcnicas que se describen en este
captulo tiene aplicaciones especficas que se indican a continuacin:
La electroforesis en gel de agarosa es la ms utilizada, y se aplica en todos los procedimientos indicados en el prrafo anterior. Se utiliza adems muy
frecuentemente para la realizacin de mapas de restriccin, separndose los
Electroforesis de ADN

47

fragmentos que resultan de la digestin con diferentes enzimas de restriccin,

mediante digestiones individuales y dobles. Con frecuencia la electroforesis en
gel de agarosa se utiliza tambin para separar fragmentos que se transferirn
a una membrana (de nailon o nitrocelulosa) para llevar a cabo la tcnica de
Southern blot. Tambin permite la separacin de fragmentos de productos de
PCR y la asignacin de tamao de los mismos (ver por ejemplo captulo de
ISSRs).
La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) tiene como objetivo la
separacin de fragmentos de ADN de tamao elevado. Se utiliza para separar
fragmentos de restriccin y elaborar mapas de restriccin cuando se utilizan
enzimas de restriccin de baja frecuencia de corte, como NotI o SfiI (El-Osta et
al. 2005). Asimismo ha tenido una gran aplicacin en la separacin de cromosomas enteros de eucariotas inferiores, principalmente hongos, para elaborar
cariotipos (Fierro et al. 1993, 2001). Al igual que la electroforesis convencional,
la PFGE puede aplicarse como parte de la tcnica de Southern blot, para localizar sondas y genes especficos en un determinado cromosoma o fragmento de
restriccin de elevado tamao. Una aplicacin particular de la PFGE es el estudio de los polimorfismos en la longitud de los cromosomas (CLP: Chromosome
Length Polymorphims). Estos estudios tienen diferentes aplicaciones, como
son: 1) estudios de tipificacin de cepas, como en el caso de Candida spp.
en estudios epidemiolgicos, donde la comparacin del cariotipo electrofrico
result ser un buen marcador para la identificacin intra- e inter-especfica de
cepas de Candida (Pittet et al. 1991); 2) anlisis de reorganizaciones cromosmicas causadas por procesos de mutagnesis o transformacin gentica;
3) anlisis de la plasticidad y variabilidad genmica en poblaciones silvestres
y asignacin de cariotipos especficos a fenotipos particulares; 4) estudio de
la herencia de los polimorfismos cromosmicos; 5) estudio de cromosomas
supernumerarios o minicromosomas.
La electroforesis de ADN en gel de poliacrilamida no desnaturalizante persigue objetivos similares a la electroforesis en gel de agarosa, pero se utiliza
para la separacin de fragmentos ms pequeos y cuando se quiere obtener
una mayor resolucin. La purificacin de fragmentos de ADN a partir de geles
de poliacrilamida es un procedimiento sencillo y permite la obtencin de ADN
de alta pureza que puede utilizarse para aplicaciones que requieran un ADN
totalmente libre de impurezas. La electroforesis de ADN en gel de poliacrilamida no desnaturalizante no se utiliza para la tcnica de Southern blot. Otra
48

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

aplicacin frecuente de este tipo de electroforesis es la deteccin de complejos

ADN -protena en la tcnica denominada EMSA (Electrophoretic Mobility Shift

Assay), tambin denominada geles de retardo. Esta tcnica se basa en el retraso que provoca en la migracin de un fragmento de ADN la unin al mismo
de una protena que reconozca alguna secuencia del fragmento y se una a l de
forma especfica (Carey 1988, Cann 1989).

Ventajas y desventajas
Las tcnicas de electroforesis de ADN, en especial la electroforesis en gel de
agarosa, es una tcnica bsica e imprescindible en cualquier laboratorio que
utilice tcnicas moleculares con ADN incluso en el nivel ms bsico. A la hora
de montar un laboratorio de biologa molecular lo primero que debe plantearse
es la adquisicin de los equipos necesarios para la realizacin de electroforesis
en geles de agarosa. Resulta imprescindible una cmara de electroforesis con
sus accesorios y una fuente de alimentacin, as como un transiluminador y un
sistema de fotodocumentacin. Los costos de estos equipos son asequibles y
no requieren de grandes inversiones.
Algunos de los componentes utilizados en las tcnicas de electroforesis de
ADN son txicos y deben tomarse precauciones especiales en su manejo:

Bromuro de etidio. El bromuro de etidio es txico a elevadas concentraciones debido a su capacidad mutagnica. Se debe evitar la inhalacin del compuesto en estado slido (manipularlo en campana de extraccin), y se deben
manejar las soluciones siempre con guantes.
Las soluciones de teido de bromuro de etidio pueden descontaminarse de
la siguiente forma: agregar agua hasta que su concentracin est por debajo
de 0.5 g/ml, a esta solucin aadirle 0.2 volmenes de cido hipofosforoso
al 5% recin preparado y 0.2 volmenes de solucin fresca de nitrito de sodio
0.5 M, mezclar con cuidado y checar que el pH sea inferior a 3, dejar incubar la
mezcla a temperatura ambiente durante 24 h y agregar un volumen de bicarbonato de sodio 1 M. En este momento la solucin puede desecharse.
Acrilamida. La acrilamida en polvo y en solucin es txica, y tiene la capacidad
de penetrar a travs de la piel. Se debe evitar la inhalacin del compuesto en estado slido (manipularla en campana de extraccin), y se deben manejar las soluciones siempre con guantes. Una vez polimerizada los geles ya no resultan txicos, sin embargo se recomienda la utilizacin de guantes para su manipulacin.
Electroforesis de ADN

49

Luz ultravioleta. Los ojos y la piel deben protegerse adecuadamente mediante el uso de pantallas que filtren las longitudes de onda correspondientes a luz UV.

Perspectivas
Las tcnicas de electroforesis de ADN son hoy en da bsicas e insustituibles
para cualquier trabajo en biologa molecular con cidos nucleicos, por lo que
seguirn utilizndose previsiblemente durante mucho tiempo. A lo largo de los
aos se han ido desarrollando avances en este tipo de tcnicas, como la PFGE,
as como aplicaciones nuevas, como el EMSA . El continuo desarrollo de las tcnicas de biologa molecular hace prever que se encontrarn nuevas aplicaciones para los diferentes mtodos de electroforesis de cidos nucleicos en gel.

Bibliografa
Aaij C. y P. Borst. 1972. The gel electrophoresis of DNA. Biochimica and Biophysica
Acta 269: 192-200.
Cann J. R. 1989. Phenomenological theory of gel electrophoresis of protein-nucleic
acid complexes. Journal of Biological Chemistry 264: 17032-17040.
Carey J. 1988. Gel retardation at low pH resolves trp-repressorDNA complexes for
quantitative study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 85: 975-979.
El-Osta Y. G., A. J. Hillier y M. Dobos. 2005. Construction of a combined physical
and genetic map of the chromosome of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356
and characterization of the rRNA operons. Microbiology 151: 875-892.
Fierro F., S. Gutirrez, B. Dez y J. F. Martn. 1993. Resolution of four large chromosomes in penicillin producing filamentous fungi: The penicillin gene cluster is
located on chromosome II (9.6 Mb) in Penicillium notatum and chromosome I
(10.4 Mb) in Penicillium chrysogenum. Molecular and General Genetics 241:
573-578.
Fierro F., S. Gutirrez, J. Casqueiro y J. F. Martn. 2001. Karyotyping of fungi by Pulsed
Field Gel Electrophoresis. Pgs. 105-125 En: S.G. Pandalai (ed.), Recent Research
Developments in Genetics, vol. 1. Research Signpost, Trivandrum, India.
Kirkpatrick E. H. 1990. Overview of agarose gel properties. Current Communications in Cell Molecular Biology 1: 9-22.

50

Herramientas moleculares aplicadas en ecologa

Orbach M. J., D. Vollrath, R. W. Davis y C. Yanofsky. 1988. An electrophoretic karyotype of Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology 8:1469-1473.
Pittet D., M. Monod, I. Filthuth, E. Frenk, P. M. Suter y R. Auckenthaler. 1991. Contour-clamped homogeneous electric field gel electrophoresis as a powerful epidemiologic tool in yeast infections. American Journal of Medicine. 91: 256S
263S.
Sambrook J. y D. W. Russell. 2001a. Molecular cloning: a laboratory manual. Vol
1-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, EE.UU., pp. 5.61-5.64
Sambrook J. y D. W. Russell. 2001b. Molecular cloning: a laboratory manual. Vol
1-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, EE.UU., pp. 5.65-5.67
Sambrook J. y D. W. Russell. 2001c. Molecular cloning: a laboratory manual. Vol
1-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, EE.UU., pp. 5.68-5.70
Schwartz D. C. y C. R.Cantor. 1984. Separation of yeast chromosome-sized DNAs
by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37: 67-75.
Sharp E. A., B. Sugden y J. Sambrook. 1973. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry 12: 3055-3063.
Thorne H. Y. 1966. Electrophoretic separation of polyoma virus DNA from host cell
DNA. Virology 29: 234-239.
Thorne H. Y. 1967. Electrophoretic characterization and fractionation of polyoma
virus DNA. Journal of Molecular Biology 24: 203-211.

Electroforesis de ADN

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