Enf303 Microbiología PDF
Enf303 Microbiología PDF
Enf303 Microbiología PDF
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
ESCUELA DE ENFERMERIA
PERIODO 2014-2015
SEGUNDO SEMESTRE 201520
ANA GABRIELA CARDENAS
PRACTICA No. 1
OBJETIVOS:
Conocer que es un laboratorio de microbiología médica, como actuar, trabajar y utilizar los implementos
suministrados.
1. INTRODUCCION:
La microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos, seres vivos muy pequeños que
están por debajo del poder resolutivo del ojo humano.
Las bacterias representan más del 90% de todo el material vivo de la Tierra.
2. NORMAS DE BIOSEGURIDAD:
Leer manual anexo.
Establecer normas internas y consensos generales.
3. MATERIALES DE LABORATORIO:
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
5. BIBLIOGRAFIA:
Organización mundial de la salud, Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, Ginebra, OMS,
2005.
Universidad de Alicante, Facultad de Ciencias, Manual de Supervivencia en el Laboratorio
(monografía en línea), España, 1999, disponible enlinea:
http://www.ua.es/centros/ciencias/seguridad/hab_seg_lab_biol.htm
SESIONES
1.- OBJETIVO
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Cinco vasos de precipitación.
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Papel flitro
Mecheros de bunsen
Incubadoras.
Pipetas pasteur
12 pares de guantes.
Microscopios
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
ácidos teicoicos
Polisacáridos
proteínas (pocas veces)
glicopéptido (50% del peso seco)
Pared Gram -
capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta
por capas externas de densidad menor)
Lipopolisacáridos
Lipoproteínas
Proteínas
glicopéptido (10% del peso seco)
GRAM + GRAM -
1) Cristal Células color violeta Células color violeta
violeta
1. COLORACION:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña
de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
2. OBSERVACION:
3. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
CUESTIONARIO
1. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
2. ¿Qué forma tienen las bacterias observadas?
SESIONES
1.- OBJETIVO
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de medios de cultivo, métodos de
siembra y técnicas anexas para identificación microbiana. Que obtenga la información
básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.
MATERIALES:
Muestras de orina, secreción faríngea y nasal.
-Cultivos de bacterias en agar.
-Agares solidos ( Mac Conkey, Sangre, Chocolate, Saboroud).
-Agares líquidos(BHI, Tioglicolato).
-Asas calibradas y no calibradas(plástico y vidrio).
-Incubadora.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
PROCEDIMIENTO:
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
CUESTIONARIO
1. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
2. Describa los resultados obtenidos.
3. Como son aplicables estos conocimientos en su profesión?
4. Señale 8 medios de cultivos sólidos y 3 líquidos, sus aplicaciones y su composición.
5. Describa las formas de incubación, que son ambientes aerofilicos y anaerofilicos, según
las temperaturas en que se pueden clasificar los microorganismos.
6. Que es una siembra en profundidad, como se realiza.
7. Anotar bibliografía.
ASIGNATURA: SIGLA: ENF 303 PARALELO: 1 PERIODO:
MICROBIOLOGIA
2015-1
SESIONES
1.- OBJETIVO
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Cinco vasos de precipitación.
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Papel flitro
Mecheros de bunsen
Incubadoras.
Pipetas pasteur
12 pares de guantes.
Microscopios
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
ácidos teicoicos
Polisacáridos
proteínas (pocas veces)
glicopéptido (50% del peso seco)
Pared Gram -
capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta
por capas externas de densidad menor)
Lipopolisacáridos
Lipoproteínas
Proteínas
glicopéptido (10% del peso seco)
GRAM + GRAM -
1) Cristal Células color violeta Células color violeta
violeta
4. COLORACION:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña
de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
5. OBSERVACION:
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
CUESTIONARIO
6. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
7. ¿Qué forma tienen las bacterias observadas?
SESIONES
1.- OBJETIVO
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de medios de cultivo, métodos de
siembra y técnicas anexas para identificación microbiana. Que obtenga la información
básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.
MATERIALES:
Muestras de orina, secreción faríngea y nasal.
-Cultivos de bacterias en agar.
-Agares solidos ( Mac Conkey, Sangre, Chocolate, Saboroud).
-Agares líquidos(BHI, Tioglicolato).
-Asas calibradas y no calibradas(plástico y vidrio).
-Incubadora.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
PROCEDIMIENTO:
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:
CUESTIONARIO
8. Describa con sus propias palabras el procedimiento de las técnicas realizadas en esta
práctica, los materiales y equipos utilizados.
9. Describa los resultados obtenidos.
10. Como son aplicables estos conocimientos en su profesión?
11. Señale 8 medios de cultivos sólidos y 3 líquidos, sus aplicaciones y su composición.
12. Describa las formas de incubación, que son ambientes aerofilicos y anaerofilicos, según
las temperaturas en que se pueden clasificar los microorganismos.
13. Que es una siembra en profundidad, como se realiza.
14. Anotar bibliografía.
ASIGNATURA: SIGLA: ENF 303 PARALELO: 1 PERIODO:
MICROBIOLOGIA
2014-1
SESIONES
Fecha:
2014/09/29 PRÁCTICA No: 4 1 TEMA: TINCIONES SIMPLES Y DIFERENCIALES
1.- OBJETIVO
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y tinción más
utilizadas en el estudio microscópico de cultivos microbianos. Que obtenga la
información básica para hacer la descripción inicial de los microorganismos.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Cinco vasos de precipitación.
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Papel flitro
Mecheros de bunsen
Incubadoras.
Pipetas pasteur
12 pares de guantes.
REACTIVOS:
Azul de metileno
Verde de malaquita
Safranina
Acido fosfomolíbdico
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
INTRODUCCIÓN
PARED CELULAR
Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas mucosas y
externas a la membrana citoplasmática está la pared celular que es una estructura muy rígida y
que da forma a la célula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo
algunas paredes celulares son considerablemente más gruesas.
Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la división. Todas
las bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a la célula de explotar en medios
de baja presión osmótica.
Propiedades y Funciones:
La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos
citoplasmáticos se pueden hidrolizar diferencialmente con ácido fosfomolíbdico, dejando la
pared sin afectar. Después de teñir se puede observar la pared celular con citoplasma como
ahuecado.
ESPORAS
Son elementos de reproducción y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas
bacterias, especialmente del género bacilar. Su forma, tamaño y ubicación varía según la
especie. Estos cuerpos son producidos en el último estadío del crecimiento celular, que bajo
condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de célula en crecimiento o
vegetativa.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
Preparación de frotis.
A. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos.
B. Encender el mechero y esterilizar el asa en la flama hasta que se ponga al rojo vivo. Dejar
enfriar el asa para evitar la quema y destrucción de los microorganismos. Si los frotis son de
cultivos sólidos, se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada.
C. Acercar la caja de Petri con el cultivo o el tubo, quitar el tapón del tubo, flamear la boca e
introducir el asa para tomar la muestra.
D. Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en área circular de
más o menos 2 cm de diámetro y esterilizar el asa. Dejar secar el frotis al aire.
D. En el caso de cultivos líquidos, se toma la muestra del tubo: de manera directa y se realiza
el mismo procedimiento antes descrito.
E. fijar por calor
4.- Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar totalmente el ácido
fosfomolíbdico
5.-Agrega el azul de metilo directamente sobre el frotis húmedo y déjalo reaccionar 5 minutos.
6.- Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se
desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lava bien,
hasta que el agua ya no arrastre colorante.
8.- Si se tiñó correctamente, las paredes celulares aparecerán de verde oscuro o azul, mientras
que el citoplasma se verá de un verde claro o incoloro.
B) TINCION SIMPLE
1. Cubrir el frotis de Candida albicans y de la muestra problema con 1 gota de azul de metileno
durante 60 segundos.
2. Eliminar el exceso de colorante con la piceta de agua destilada y dejar secar al aire.
CUESTIONARIO
1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacte rias.
3. ¿Qué característica y que color tiñeron las paredes celulares de las bacterias que lograste
observar?
4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas
5.- Describe dos diferencias para distinguir a una endospora de una exospora
6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las distintas muestras
microbiológicas?
SESIONES
1.- OBJETIVO
Que el alumno observe micro y macroscópicamente la movilidad de bacterias (Proteus)
así como la influencia de antibióticos en su movilidad.
Determinar el metabolismo bacteriano mediante el uso de agares específicos y
descriptivos como es el TSI.
MATERIALES:
Cultivo liquido de Proteus mirabilis
Placas porta y cubre objetos
Hisopos estériles
Agar Sangre
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
15 discos de Azitromicina
15 discos de Eritromicina
Caldos BHI
Mecheros de bunsen
Incubadoras
Pipetas pasteur
Guantes
Tubos con agar TSI.
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
MOVIMIENTO BACTERIANO
Algunas bacterias son inmóviles y otras limitan su movimiento a cambios de profundidad. Por
ejemplo, cianobacterias y bacterias verdes del azufre contienen vesículas de gas con las que
pueden controlar su flotabilidad y así conseguir un óptimo de luz y alimento.94 Las bacterias
móviles pueden desplazarse por deslizamiento, mediante contracciones o más comúnmente
usando flagelos. Algunas bacterias pueden deslizarse por superficies sólidas segregando una
sustancia viscosa, pero el mecanismo que actúa como propulsor es todavía desconocido. En el
movimiento mediante contracciones, la bacteria usa su pilus de tipo IV como gancho de ataque,
primero lo extiende, anclándolo y después lo contrae con una fuerza notable.
METABOLISMO BACTERIANO:
El metabolismo microbiano es el conjunto de procesos por los cuales un microorganismo obtiene
la energía y los nutrientes (carbono, por ejemplo) que necesita para vivir y reproducirse. Los
microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias metabólicas distintas y las especies
pueden a menudo distinguirse en función de estas estrategias. Las características metabólicas
específicas de un microorganismo constituyen el principal criterio para determinar su papel
ecológico, su responsabilidad en los ciclos biogeoquímicos y su utilidad en los procesos
industriales.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
Con una pipeta Pasteur o una micropipeta se añaden unas gotas de cultivo bacteriano
en un portaobjetos y se coloca un portaobjetos.
Observar directamente al microscopio con lente de 40x.
Cultivo bacteriano:
Control de Inhibición:
METABOLISMO BACTERIANO:
Observaciones:
SESIONES
F
PRÁCTICA No:6 1 TEMA: FLORA NORMAL HUMANA
1.- OBJETIVO
Determinar cuáles son los microorganismos presentes en flora de secreción nasal,
secreción faríngea, piel, secreción vaginal, orina y heces.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Pinzas microbiológicas.
Agar base de sangre
Agar EMB
Agar nutriente
Agar Salmonella-Shigella
Agar Saboroud
Caldo tioglicolato
Solución salina
Microscopio
incubadora
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
Algunos de estos organismos son beneficiosos para el huésped, y su importancia para la salud
se puede desvelar en forma bastante espectacular bajo terapia antibiótica: los antibióticos
causan una reducción drástica de la flora normal y como consecuencia el huésped puede,
quizás, ser infectado por patógenos nuevos o por crecimiento excesivo de organismos
presentes normalmente en número pequeño. Por ejemplo: la proliferación del Clostridium
difficile que sobreviene al tratamiento antibiótico con clindamicina, y que ocasiona colitis
pseudomembranosa.
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de
forma continua durante el crecimiento. Refleja la edad, la nutrición y medio ambiente del
individuo. Por ejemplo, los lactantes alimentados al pecho tienen estreptococos y lactobacilos
en su tracto gastrointestinal, mientras que los alimentados con biberón muestran una variedad
mucho mayor de organismos.
Los organismos se encuentran en las partes del cuerpo expuestas al medio ambiente o que
comunican con él (piel, nariz y boca, intestino y tracto urogenital). Los órganos y tejidos
internos son normalmente estériles.
FUNCIONES DE LA FLORA NORMAL
Las bacterias intestinales liberan también ciertos factores que pueden tener algún valor
metabólico para el huésped; además producen vitaminas B y K en cantidades suficientes para
complementar una dieta deficiente. Además se cree que la estimulación antigénica
proporcionada por la flora tiene importancia para asegurar el desarrollo normal del sistema
inmunitario.
Existe un riesgo potencial de diseminación hacia zonas normalmente estériles del cuerpo, lo
cual puede suceder bajo diversas circunstancias, por ejemplo, cuando se perfora el intestino o
se produce una herida cutánea, durante la extracción de un diente (los Streptococos viridans
pueden entrar al torrente sanguíneo) o cuando las Escherichia coli provenientes de la piel
perianal, ascienden por la uretra y causan infección del tracto urinario.
FLORA DE LA PIEL
Staphilococcus (estafilococos):
epidermidis (90 % del total de gérmenes aerobios de la piel).
aureus: presente en cara y manos de “portadores nasales” de dicho germen.
Streptococcus (estreptococos).
Difteroides (corinebacterias), en folículos pilosos, glándulas sebáceas y sudoríparas.
Propionibacterium ácnes.
Micrococcus.
Candida: sobre todo en personal sanitario.
Las distintas zonas de la piel soportan floras distintas, lo que gran parte está determinado por el
grado de humedad disponible. A mayor humedad, mayor flora, ya que ésta se relaciona con las
glándulas sudoríparas.
El olor axilar se produce como resultado de la actividad de la flora bacteriana sobre las
secreciones de las glándulas sudoríparas apocrinas La secreción de estas glándulas tomada
de forma aséptica es inodora.
ZONAS DE LA PIEL CON MAYOR FLORA
FLORA DE LA NARIZ
Staphilococcus (Estafilococos).
aureus (20 % de la población).
epidermidis.
Micrococcus.
Streptococcus (Estreptococos).
Difteroides.
FLORA DE LA CONJUNTIVA
Staphilococcus:
epidermidis.
aureus.
Streptococcus.
Propionibacterium acnes.
Haemophillus sp.
Neisserias sp.
FLORA DE LA BOCA
La cavidad oral es uno de los hábitats microbianos más complejos y heterogéneos del cuerpo.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias
anaerobias.
La placa es una película de células bacterianas, que se anclan en una matriz de polisacáridos
secretada por los microorganismos.
Cuando los dientes no se limpian con regularidad, la placa se puede acumular rápidamente y la
actividad de ciertas bacterias, especialmente el Streptococcus mutans, puede dar lugar a la
destrucción dental (caries). La prevalencia de caries guarda relación con la dieta.
FLORA FARINGEA
Streptococcus:
grupo viridans
S. pyogenes (Beta Hemolítico del grupo A)
S. pneumoniae (neumococo)
Staphylococcus:
epidermidis.
aureus.
Especies de Neisseria.
A veces: Neisseria meningitidis.
Haemophilus influenzae.
Algunos de los componentes de la flora en individuos sanos son potencialmente patógenos (ej:
neumococo, S. pyogenes, Haemophilus).
Staphylococcus epidermidis.
Estreptococos, sobre todo alfa hemoliticos.
Enterococcus feacalis.
En ocasiones:
Corinebacterias y bacilos gramnegativos.
En los pacientes con sondas Foley permanentes puede aparecer Cándida en la orina.
FLORA DE LA VAGINA
El estómago, por su acidez, puede considerarse una barrera contra la penetración de bacterias
extrañas al tracto intestinal. La cantidad de bacterias presentes en el estómago es
generalmente baja y, en sus paredes, podemos encontrar:
Lactobacilos.
Streptococcus (Estreptococos) acidotolerantes.
Estas bacterias aparecen poco después del nacimiento, estando bien establecidas a la semana
de vida.
Lactobacilos.
Estreptococos.
Enterobacterias.
Especies de bacteroides.
Candida.
En primera parte del intestino delgado, adyacente al estomago, es muy acida y se parece al
estomago en su flora normal. A medida que el pH se hace alcalino aumenta el número de
bacterias.
Especies de Bacteroides.
Especies de Fusobacterium.
Enterococos faecalis.
Enterobacterias.
Escherichia coli.
Especies de Klebsiella.
Salmonellas.
Pseudomonas.
Eubacterias.
Bifidobacterias.
Lactobacillus.
Especies de Clostridium.
Staphilococcus aureus
Estreptococos.
Candida.
GERMENES PRESENTES EN LA MATERIA FECAL
Especies de Bacteroides.
Bifidobacterias.
Eubacterias.
Coliformes.
Enterococo feacalis.
Candida.
En el intestino existen varios protozoos inócuos que pueden ser considerados parte de la flora
normal a pesar de ser animales ej: Entamoeba coli.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
MUESTRA FARINGEA:
MUESTRA NASAL:
MUESTRA DE PIEL:
MUESTRA DE ORINA:
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Conocer que son los antibióticos, para que sirven, cuáles son sus mecanismos de
acción y como se realiza un antibiograma.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar Mueller-Hinton
Caldo BHI
Discos de antibióticos
Incubadora
REACTIVOS:
Azul de metileno
Safranina
Iodo Gram
Cristal violeta
Alcohol cetona
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
LOS ANTIBIOTICOS
Se denomina Antibiótico (del griego, anti, 'contra'; bios, 'vida'), a cualquier compuesto químico
utilizado para eliminar o inhibir el crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad común
a todos los antibióticos es la toxicidad selectiva: la toxicidad hacia los organismos invasores es
superior a la toxicidad frente a los animales o seres humanos. La penicilina es el antibiótico
más conocido, y ha sido empleado para tratar múltiples enfermedades infecciosas, como
la sífilis, la gonorrea, el tétanos o la escarlatina. En un principio, el término antibiótico sólo se
empleaba para referirse a los compuestos orgánicos producidos por bacterias u hongos que
resultaban tóxicos para otros microorganismos. En la actualidad también se emplea para
denominar también compuestos sintéticos o semisintéticos. La principal categoría de
antibióticos son los antibacterianos, pero se incluyen los fármacos antipalúdicos, antivirales y
antiprotozoos.
Los agentes antimicrobianos pueden interferir diferentes funciones que lleva a cabo la bacteria,
tales como la síntesis de sus ácidos nucleicos, de proteínas, o para el procesamiento de
aminoácidos o azúcares del medio, necesarios para la biosíntesis de sus paredes o
membranas celulares. Las drogas antibacterianas pueden actuar en una o más áreas del
funcionamiento del microorganismo y producir dos principales efectos: la muerte de la bacteria,
designándose entonces como agentes bactericidas o sólo inhibir el desarrollo y reproducción
del germen, llamándose entonces agentes bacteriostáticos.
Las pruebas de sensibilidad bacteriana se llevan a cabo mediante el antibiograma que sirve
para medir la sensibilidad de una cepa bacteriana a uno o varios antibióticos. El estudio de la
sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento
antibiótico. También es importante para realizar estudios sobre la evolución de las resistencias
bacterianas que permite revisar los protocolos de la antibioticoterapia empírica.
Conceptos:
Existen diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de forma rutinaria, y de
manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o
semiautomatizados). Se puede realizar mediante:
Métodos
En un primer momento, el método estándar utilizado para las pruebas in vitro fue el de dilución
en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo. Actualmente existen varios métodos que
se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad a los antibióticos y todos ellos se
realizan bajo condiciones entandarizadas por organismos internacionales.
Dilución en caldo
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Después de
un periodo de incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos que indica el desarrollo
bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los que no contengan
suficiente antibiótico que sea capaz de inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que
presente ausencia de crecimiento es la Concentración Mínima Inhibitoria.
Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo
sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.
A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de
caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el número de colonias que crece en estos
subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del
cultivo original. La mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a
menos de 0,1 % del inóculo original se denomina concentración bactericida mínima (CBM).
Difusión en agar
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
INOCULO:
A partir de un cultivo puro o axénico tomar una colonia con un hisopo estéril.
Colocarlo en el caldo BHI y homogenizar por completo.
Comparar con el estándar McFarland 0.5.
ANTIBIOGRAMA EN AGAR:
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los cocos Gram positivos aerobias de importancia clínica,
cuáles son sus reacciones bioquímicas y su perfil de susceptibilidad bacteriana
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar Mueller-Hinton
Caldo BHI
Agar manitol salado
Agar sangre de cordero
Discos de antibióticos
Incubadora
REACTIVOS:
Plasma normal
Taxo A
Taxo P
Antibioticos.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Los cocos Gram positivos excluyendo las enterobacterias, son los microorganismos más
frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como agentes
importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el año 1836.
Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora microbiana
normal de la piel y las mucosas del hombre y de animales. Las infecciones en el hombre se
producen por contacto directo con individuos infectados o portadores sanos, o por penetración
a través de piel y mucosas mediante objetos corto punzantes por heridas, trauma o
procedimientos quirúrgicos o por la acción detoxinas producidas por cepas de algunas
especies.
Staphylococcus
Los estafilococos son células esféricas Gram positivas dispuestas en grupos semejantes a
racimos de uvas en medios sólidos o en pares, cadenas o tétradas, en medios líquidos. Crecen
bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen diferentes pigmentos: blanco,
amarillo y dorado y algunas de ellas producen beta hemólisis. Son catalasa positiva, inmóviles,
no esporulados, con raras excepciones, no encapsulados y son aerobios o anaerobios
facultativos.
Las colonias de estafilococo son fáciles de reconocer, relativamente son grandes tienen de 2 a
3 mm o más, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias son circulares, convexas, de
superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas o amarillas o doradas. Para iniciar la
identificación además de las características de crecimiento tanto en medio líquido como sólido
y la coloración de Gram, se utiliza la prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del
género estreptococo, el cual carece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan
diferentes pruebas dentro de las cuales están las siguientes.
Streptococcus
Los estreptococos son células esféricas u ovaladas Gram positivas dispuestas en pares o
cadenas cortas o largas. Son más exigentes que los estafilococos, no crecen en medios
simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados.
Producen diferentes tipos de hemólisis, característica que permite clasificarlos en beta
hemolíticos, alfa hemolíticos o no hemolíticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa,
inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios y anaerobios
facultativos.
Enterococcus
Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, son células
esféricas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que los estreptococos,
requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus derivados. Son capaces de
desarrollarse en medios que contienen altas concentraciones de NaCl (6.5%) y de bilis (40%).
Pueden producir hemólisis de tipo alfa, beta o ser no hemolíticos. No forman pigmentos, son
catalasa negativa, inmóviles, no esporulados, con formación de cápsula variable. Son aerobios
y anaerobios facultativos.
Descripción de la actividad:
Pruebas Bioquímicas
CATALASA
Principio
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en
agua y oxígeno según la siguiente reacción:
2H2O2 →2H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba catalasa se usa con frecuencia, para diferenciar miembros de la familia
Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.
Materiales
- Colonia aislada (Medio de cultivo sembrado e incubado)
- Peróxido de hidrógeno al 3%
Procedimiento
1. Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de
un portaobjetos.
2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de
efervescencia o burbujas.
Resultados
- Positiva: Una prueba positiva esta dada por la aparición rápida y sostenida de
burbujas o efervescencia.
- Negativa: Unas pocas burbujas pequeñas después de 20 a 30 segundos se
considera un resultado negativo.- Falsas Positivas: Los eritrocitos poseen catalasa, por
lo cual debe tenerse cuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el
material de la colonia.
COAGULASA
Principio
La coagulasa es una proteína de composición química desconocida, que tiene actividad
similar a la protombina, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, lo que da como
resultado la formación de un coágulo visible en los sistemas apropiados. Se utiliza para
identificar Staphylococcus aureus de otras especies. La coagulasa se presenta en dos
formas, ligada y libre y para determinarlas se utiliza dos procedimientos: en lámina y en
tubo; si la prueba en lámina da positiva, no hay necesidad de hacer la prueba en tubo.
Prueba en lámina (Coagulasa ligada)
Materiales
- Cepa en estudio
- Lámina
- Plasma de conejo
Procedimiento
- Colocar 1 gota de plasma sobre la lámina
- Agregar la colonia en estudio
- Mezclar
Resultados
- Positivo: La presencia de aglutinación o formación de grumos
- Negativo: No se observa aglutinación, permanece emulsionada la colonia
Prueba en tubo (Coagulasa libre)
Materiales
- Cepa en estudio
- Tubo de ensayo con 0.5 ml de plasma de conejo
Procedimiento
- Agregar la colonia en estudio al tubo de ensayo
- Incubar a 35ºC por 4 horas; si no se ha formado el coágulo, reincubar por 24
horas a temperatura ambiente
Resultados
- Positivo: La formación de un coágulo
- Negativo: No se observa formación de coagulo, permanece líquido el plasma.
MANITOL
Principio
Al utilizar el microorganismo al manitol como sustrato e incorporarlo al sistema
Embden-Meyerhoff-Parnas, que tiene como productos finales ácidos que provocan la
disminución del pH en el medio de cultivo, que se detecta mediante el viraje del
indicador rojo de fenol a amarillo.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar de Manitol
Procedimiento
- Sembrar la colonia en el caldo
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Positivo: cuando el indicador del medio vira a amarillo
- Negativo: cuando conserva su color rojo
NOVOBIOCINA
Principio
Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensiblesy
resistentes a la novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es de las especies
resistentes, la más frecuente en humanos, causante de infecciones de el tracto urinario.
Por lo tanto esta prueba proporciona una identificación presuntiva confiable de esta
especie.
Materiales
- Cepa en estudio
- Disco de novobiocina de 5ug
- Agar sangre de carnero
Procedimiento
- Preparar una suspensión (equivalente al estándar 0.5 de McFarland) del
microorganismo en agua destilada.
- Sembrar con escobillón en forma masiva sobre la placa de Mueller Hinton
- Colocar con la pinza un disco de novobiocina en el centro
- Incubar a 35ºC durante por 24 horas.
Resultados
- Sensible: Halo de inhibición mayor a 16 mm
- Resistente: Halo de inhibición menor a los 12 mm
BACITRACINA
Principio
Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones (0.04U) de Bacitracina.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar sangre
- Discos de Bacitracina
Procedimiento:
- Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar sangre
- Colocar un disco de Bacitracina y presionar suavemente
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Sensible: La aparición de cualquier halo de inhibición alrededor del disco
- Resistente: Crecimiento alrededor del disco
CAMP
Principio
Se basa en que Streptococcus agalactiae produce un factor llamado CAMP (factor de
monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por
algunas cepas de Staphylococcus aureus productoras de ß lisina.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar sangre
- Cepa de Staphylococcus aureus ß lisina positivo
Procedimiento:
- Sembrar sobre la palca de agar una estría de estafilococo ß lisina positivo
- Perpendicular al estafilococo, hacer una estría con la colonia en estudio
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Positivo: Presencia de una zona de hemólisis en forma de flecha
- Negativo: Ausencia de la hemólisis en flecha.
OPTOQUINA
Principio
El clorhidrato de etildihidrocupreína (optoquina) a muy bajas concentraciones, inhibe en
forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae. La optoquina puede
inhibir a otros estreptococos del grupo viridans, pero solo a concentraciones más altas.
Materiales
- Cepa en estudio- Agar sangre
- Discos de Optoquina 5 ug.
Procedimiento:
- Sembrar la colonia masivamente en cuadrícula sobre una placa de agar sangre
- Colocar un disco de Optoquina y presionar suavemente
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
- Sensible: La aparición de un halo de inhibición mayor a 16 mm de diámetro
- Resistente: Crecimiento alrededor del disco o halos menores a 16 mm.
Enterococcus spp.
Materiales:
-Cepa en estudio-Agar sangre
Agar Bilis esculina-BHI+6.5%NaCl
Procedimiento:
-Sembrar la colonia por profundidad en el agar inc;linado de Bilis esculina.
-Sembrar la colonia en el caldo BHI
- Incubar a 35ºC por 24 horas
Resultados
Positivo: crecimiento en la bilis con pigmentación negra y turbidez del caldo BHI
Negativo: crecimiento en la bilis, ausencia de pigmento y turbidez del caldo BHI.
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los cocos Gram negativos aerobios de importancia clínica,
cuáles son sus reacciones bioquímicas y su perfil de susceptibilidad bacteriana
Estableceremos cuales son los cocos Gram positivos su perfil bioquímico y su susceptibilidad
antimicrobiana.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar Chocolate
Caldo BHI
Agar Sangre de Cordero
Discos de antibióticos
Incubadora
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Peróxido de Hidrogeno
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Los unicos coco gram- de la cavidad oral son los cocos Veillonella: V..parvula, V. atypica, V.
dispar.
Hay otras especies de Gram negativos pero que están en la cavidad oral de animales.
Caracteristicas generales:
Se agrupan en cadenas cortas o en parejas.
No metabolizan los hidratos de carbono.
Mediante la fermentacion del ac lactico produce energia., ac acetico, CO2, y ac propionico
Se encuentra en la placa dental, en el dorso de la lengua, saliva y intestino.
Tiene actividad proteolitica, es decir, produce ciertas enzimas que degradan proteinas se
liberan compuestos volatiles, que dan lugar a la halitosis.
Descripción de la actividad:
COLORACION DE GRAM
Realizar la coloración de Gram como la hemos realizado hasta el momento.
PRUEBA DE SUPEROXOL
Esta es una prueba muy útil para diferencia N. gonorrhoeae.
Colocar en un porta objetos un poco de colonia y anadir una gota de peróxido de
hidrogeno al 30%.
Si fuese positivo produce burbujeo inmediatamente.
THAYER MARTIN
Seleccionar la colonia deseada y sembrarla por agotameinto en este medio de
cultivo.
METODOS ESTANDARIZADOS:
GONOCHECK
BACTICARD NEISSERIA
RIM NEISSERIA
INMUNOFLUORESCENCIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES
PRUEBA DE CLOAGLUTINACION\GONOGEN
PCR PARA NEISERRIA MENINGITIDIS
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los bacilos Gram aerobios de importancia clínica, cuáles son
sus reacciones bioquímicas y su perfil de susceptibilidad bacteriana
Estableceremos cuales son los bacilos Gram negativos de importancia clínica su perfil
bioquímico y su susceptibilidad antimicrobiana.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar McConkey
Discos de antibióticos
Incubadora
Pruebas bioquímicas(Citrato, TSI, Urea, MR, VP, SIM)
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Placas Petri con Agar Mc. Conkey y sembrado con enterobacterias.
Placas Petri con Agar SS sembrado con enterobacterias.
Tubos con TSI, LIA, CITRATO inoculados con especie a estudiar.
Cepas a estudiar: Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella typhi y Shiguella.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Las enterobacterias (orden Enterobacteriales) son bacterias Gram negativas que contiene
más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología de bacilos o cocos.
Los miembros de este grupo forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y
de otros órganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir
en tierra, en plantas o en animales acuáticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes
comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de enterobacterias en la
bio-industria: para comprobar la sanidad de la fermentación de quesos y productos lácteos,
alcoholes y en tratamientos médicos, como la producción de toxinas en el uso de cosméticos y
fabricación de agentes antivirales de la industria farmacéutica, etc.
CARACTERISTICAS:
En la definición clásica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios básicos, adicional a la
aparición de nuevos métodos taxonómicos para incluir a ciertos géneros que no cumplen con
todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia:
Son bacterias Gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos.
No son exigentes, son de fácil cultivo.
Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de
la enzima citocromo oxidasa.1
Son capaces de reducir nitrato en nitrito.
Son anaeróbicos facultativos.
Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción
de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en
condiciones aeróbicas.2
Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no
son móviles.
Adicional a ello, las enterobacterias no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser
encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimioheterótrofos, y necesitan para
su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrógeno, generalmente sólo con D-glucosa,
aunque algunas requieren aminoácidos y vitaminas. La temperatura óptima de crecimiento es
de entre 22 °C y 37 °C.
Las diferencias entre los nombres de los diversos géneros provienen de criterios más precisos,
como la fermentación de los diferentes azúcares, la producción o no de azufre, la presencia
de enzimas metabólicas (β-galactosidasa,desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de
importancia médica y sanitaria pueden distinguirse entre sí por la presencia o ausencia
de antígenos en su constitución celular, tales como en el lipopolisacárido (antígeno O), el
antígeno flagelar (antígeno H) o el antígeno capsular (antígeno K).
ECOLOGIA:
La mayoría de las especies pueden aislarse del intestino del hombre y de otros animales, de
allí su nombre "enterobacteria" (del griego entéron, intestino. Pueden ser flora o ser transitorias
en la cavidad bucal, en las regiones húmedas de la piel, en especial el perineo, las fosas
nasales y las vías genitales femeninas. Son abundantes en la naturaleza, en particular en
medios húmedos y, por ser expulsadas por las heces, funcionan como medidores
epidemiológicos de salubridad e higiene poblacional.
En el intestino, representan una fracción importante de la flora aeróbica, se encuentran en
grandes números en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a
la degradación de residuos alimenticios y a la producción de gas intestinal como parte de
la fermentación.
La especie Escherichia coli juega una función importante en el control de otras especies
intestinales, constituyendo cerca del 80 por ciento de la flora aeróbica intestinal en una
concentración aproximada de 108 en la materia fecal. Otras especies
de Enterobacteriaceae con una presencia numerosa intestinal son Proteus y Klebsiella,
mientras que otras especies, como Citrobacter, Hafnia, Providencia y Enterobacter están
presentes de manera irregular.
En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patogénicos
como oportunistas en infecciones urinarias, pulmonía, septicemia o sobreinfecciones, en
especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibióticos,desnutrición, etc.
PATOGENIA:
La presencia de enterobacterias dentro del organismo es normal, pero puede determinar la
aparición de infecciones, cuya gravedad depende principalmente de la capacidad patológica o
de la virulencia de la especie en cuestión y de las características del hospedador. Introducidas
por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de
la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratación. Ciertas especies
provocan patologías específicas:
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
Observar el desarrollo bacteriano en las placas de Agar Mc. Conkey, colonias rojas que
corresponden a bacterias que han metabolizado la lactosa debido al indicador de pH ácido (rojo
neutro). Las colonias incoloras son bacterias que no han metabolizado la lactosa, se
consideran como sospechosas de ser patógenas (Salmonella-Shiguella).
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA:
El reconocimiento de las diversas especies de Enterobacterias se realiza observando las
reacciones metabólicas, por los cambios del color del medio sobre los sustratos contenidos en
dichos medios diferenciales.
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Identificar correctamente los bacilos Gram negativos aerobios no fermentadores de
importancia clínica, cuáles son sus reacciones bioquímicas y su perfil de
susceptibilidad bacteriana.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Agar McConkey
Discos de antibióticos
Incubadora
GALERIAS API 20NE
Agua destilada
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Placas Petri con Agar Mc. Conkey y sembrado con Pseudomonas aeuruginosa.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Las infecciones por bacilos gram-negativos no fermentadores han cobrado notoria importancia
por su incidencia en las infecciones hospitalarias. Actualmente, se destaca el hallazgo de
especies como la Pseudomonas aeruginosa y el Acinetobacter spp.; de este último,
el Acinetobacter baumannii es la especie que con mayor frecuencia se asocia a infecciones
graves y a la muerte. El aislamiento de estos patógenos se asocia a un incremento de la
mortalidad y están entre los agentes que más frecuentemente causan infecciones en las
Unidades de Terapia Intensiva, de ahí que constituyan desafíos terapéuticos. En el presente
artículo, se realiza una revisión actualizada de la literatura y se hace énfasis en la problemática
de la resistencia bacteriana y la terapéutica antibiótica.
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
REALIZACION DEL API 20NE
Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y resuspenderla homogéneamente en
5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril.
Siembra de la galería API
Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (parte aerobia).
Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula, de todos los pocillos.
Llenar la cúpula de los pocillos CIT , VP, GEL con la suspensión de bacterias.
Tapar con parafina líquida
Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para obtener
anaerobiosis.
Poner la galería en su propia cámara húmeda de incubación
Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación.
Previamente poner agua en los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda
durante la incubación.
Incubar a 37 °C durante 18-24 h.
La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los
de las tablas de lectura.
Y anotando el resultado como positivo o negativo.
Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios:
Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que añadir reactivos.
Cuando ésto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE, API OF, el API M o el API 10S
para ver determinados metabolismos especiales.
Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos:
Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos
están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test
número 21 corresponde al test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4.
Si la reacción es negativa se pone 0.
Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es
el tercero.
Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras.
Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Identificar Mycobacterias, cuál es su método diagnóstico, que tipo de afecciones causan y
cómo manejarlos hospitalariamente.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Placas coloreadas con zhiel nielsen de bacilos tubercolosos
Agar Lowenstein Jensen positivos.
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Placas Petri con Agar Mc. Conkey y sembrado con Pseudomonas aeuruginosa.
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3 a 5µm de longitud o curvos
en forma de maza, inmóviles, no esporulados, con abundantes gránulos citoplasmáticos, que
poseen una resistencia mayor a la tinción por los colorantes comunes, pero una vez teñidos
son resistentes a la decoloración con una mezcla de alcohol ácido. Desde el punto de vista de
los requerimientos atmosféricos algunos son aerobios y otros microaerófilos. En cuanto a la
velocidad de crecimiento algunas especies son de crecimiento rápido y otras lento. Se destaca
en su estructura una gran riqueza en lípidos (20-60%). El contenido de bases de guanina más
citosina en la molécula de ADN es de 62 a 70 moles %.
El género comprende 50 especies, entre ellas patógenos primarios, oportunistas y saprofitas.
La especie tipo es Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), la cual vamos a utilizar como
modelo al referirnos a las principales características del género.
Importancia
Las mycobacterias son agentes de enfermedades infecciosas que han acompañado al hombre
a lo largo de su historia.
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae son los agentes etiológicos más
frecuentes de las dos enfermedades más conocidas de este género. Poco tiempo después que
Roberto Koch descubriera M. tuberculosis en 1882, fueron identificadas otras mycobacterias,
constituyendo el grupo de las mycobacterias atípicas. El hallazgo de estas últimas estuvo
vinculado por años a colonización transitoria o contaminación de la muestra clínica, pero es a
partir de 1950 que se les ha asignado un rol en determinadas patologías; por ejemplo,
actualmente M. Avium Complex y enfermedad pulmonar y diseminada en pacientes con SIDA.
Desde un punto de vista histórico evolutivo, existen evidencias de tuberculosis (TBC) espinal
desde el neolítico, pero es a partir de la revolución industrial donde la enfermedad adquiere
carácter endémico, debido a una mayor aglomeración de la población en las urbes, lo cual
facilitó su diseminación.
Desde 1945, con el descubrimiento de las drogas antituberculosas, la utilización del examen
radiológico de tórax y la implementación de programas estrictos de control de diagnóstico y
tratamiento, se logró una disminución de la incidencia de tuberculosis, lo que hizo pensar a
principios de la década de 1980, en una posible erradicación de la enfermedad para el año
2010 (Center for Disease Control, Estados Unidos). Pero, a partir de 1985, comienza a emerger
la TBC en tasas que no se veían desde hacía 20 años en los países desarrollados. Los factores
postulados para explicar esta reemergencia de la enfermedad son varios:
• el compromiso del sistema inmune en los individuos infectados por el VIH, que permite tanto
una reactivación de una antigua infección, como un aumento de la susceptibilidad a una nueva
infección.
• cambios sociales: aumento del índice de pobreza, hacinamiento;
• falla en los sistemas de control de la salud pública;
• emergencia de bacilos tuberculosos multirresistentes a las drogas;
• escasa asignación de recursos para la investigación de nuevas drogas, nuevos métodos
diagnósticos y vacunas.
Clasificación y nomenclatura
En 1950, Timpe y Runyon propusieron una clasificación útil de Mycobacterium en cuatro
grupos, que se basaba en la velocidad de crecimiento (rápido o lento, según sea superior o
inferior a una semana), producción de pigmento en presencia o ausencia de luz (fotocromó-
geno, escotocromógeno y no cromógeno) y características coloniales. En la tabla 1 se presenta
una clasificación modificada de la original de Runyon, que incluye los miembros del género
Mycobacterium de importancia humana actualmente
Descripción de la actividad:
PROCEDIMIENTO:
DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS
Bioseguridad en la bacteriología de la tuberculosis
Existen estrictas normas de bioseguridad para el manejo de las muestras clínicas en el
laboratorio.
Como ya fue visto en los aspectos teóricos del tema, la vía de transmisión principal es la
inhalatoria, por la aspiración de partículas aerosolizadas; éstas pueden provenir del paciente o
ser diseminadas al manipular las muestras en el laboratorio (apertura de frascos, flameo del
asa, etc.). Evitar el desprendimiento de estas partículas, trabajar en ambientes amplios y
ventilados de circulación restringida, y recordar las normas de no fumar, beber, comer, o
aplicarse cosméticos en el laboratorio, son algunos de los puntos a tener en cuenta.
El estudiante que se dedicará fundamentalmente a la observación de frotis y cultivos ya
procesados y no al manejo de muestras clínicas, deberá cumplir con las habituales normas de
bioseguridad y buenas prácticas en el laboratorio.
Obtención de la muestra
Las muestras pueden provenir de zonas naturalmente estériles, zonas naturalmente
contaminadas o de zonas estériles pero en las que al efectuar la toma, se pasa por un área
contaminada.
La expectoración es la muestra de más frecuente manejo, ya que como dijimos, la pulmonar es
la presentación más habitual. La expectoración debe ser representativa de las secreciones del
tracto respiratorio inferior; para ello se debe recoger a primera hora de la mañana, previa
higiene bucal, y con el esfuerzo de la tos, en frasco estéril. La toma debe repetirse tres veces
en días consecutivos, ya que la eliminación de bacilos no es constante. Mujeres y niños pueden
tener dificultades por no poder, o no saber, expectorar, pudiendo entonces hacer
nebulizaciones con NaCl hipertónico. En pacientes hospitalizados graves puede recurrirse a
FBA o lavado gástrico.
Transporte y conservación
La rapidez es una condición fundamental en el transporte pues los bacilos se debilitan con el
tiempo y prolifera, en caso de ser una muestra contaminada, la flora acompañante, por ej.:
proliferación de la flora del tracto respiratorio superior en la expectoración. La conservación
puede hacerse a 4 ºC hasta 7 días.
Procesamiento
El trabajo con las muestras clínicas en el laboratorio se realiza en cabina de seguridad, con las
debidas protecciones para el personal.
Metodos directos
Microscopía - baciloscopía
El examen microscópico directo o baciloscopía es la técnica fundamental para la investigación
bacteriológica de la tuberculosis pulmonar, tanto para el diagnóstico como para el control
detratamiento, resultando también útil para muestras provenientes de otros orígenes.
TÉCNICA DE ZIEHL-NEELSEN
Se trata de una coloración diferencial basada en la capacidad de las mycobacterias de
incorporar colorantes y luego retenerlos ante la acción de una mezcla de alcohol y ácido, lo que
es conocido como ácido-alcohol resistencia. Las particulares características de la pared de las
mycobacterias parece ser responsable de esta propiedad, pudiendo formar complejos ácido
estables, cuando se exponen a colorantes aniónicos, con los lípidos de la pared, especialmente
los ácidos micólicos, o también constituyendo complejos fucsina-ARN.Con un frotis seco y
fijado se recorren los siguientes pasos:
La baciloscopía por la técnica de Ziehl-Neelsen es una técnica sencilla de bajo costo, cuya
utilidad ya hemos destacado. Aplicado a la expectoración se estima que se necesitan 10.000
para que la probabilidad sea del 95-100
TÉCNICA DE FLUORESCENCIA AURAMINA RODAMINA
Basada igual que el Ziehl-Neelsen en la ácido-alcohol resistencia de la mycobacterias, aquí se
colorean con un fluorocromo y no se decoloran con la mezcla de alcohol-ácido. La técnica no
necesita del agregado de calor y permite una visualización más rápida ya que los bacilos se
ven luminosos sobre un fondo oscuro. La observación se hace con objetivo en seco y se
requiere un microscopio de fluorescencia, lo que hace esta técnica más cara con respecto al
Ziehl-Neelsen.
Se utiliza en laboratorios que manejan un número importante de muestras por día.
Respecto al valor de la microscopía y a las técnicas de coloración mencionadas, nos parece
oportuno señalar:
• Si se tiene una baciloscopía positiva y una clínica sugestiva, casi siempre se tratará, en
nuestro país, de una tuberculosis, pero es necesario tener presente que puede tratarse de otras
especies del género Mycobacterium.
• La microscopía no sustituye el cultivo.
• Referente a las técnicas de coloración, recordar la importancia de las mismas, y que la técnica
de Gram, muy difundida en el diagnóstico de otras bacterias, no es útil para las mycobacterias.
Cultivo
El cultivo es complemento de la microscopía; permite diagnosticar como positivos casos
negativos en el examen microscópico. Las muestras contaminadas se someten a una
descontaminación que destruye la flora asociada y mantiene viables a las mycobacterias.
Después se siembra en los medios adecuados. Las muestras no contaminadas se siembran
directamente (previa centrifugación para concentrar).
La incubación se realiza a 35-37 ºC en aerobiosis. Se observan los medios periódicamente y, al
cabo de 3-5 semanas, crecen colonias rugosas, secas, amarillentas. Deben esperarse
hastaocho semanas para informar un cultivo como negativo.
El medio empleado es el de Lowenstein-Jensen, compuesto por hierro, aminoácidos, sales,
glicerina, fécula de papa, huevo, y verde de malaquita (este último inhibe la flora asociada).
La inoculación en animales se ha dejado de usar por ser poco práctica y no definitiva en
algunas situaciones.
M. tuberculosis crece lentamente, es no cromógeno, productor de niacina, reduce nitratos,
produce una catalasa sensible al calor, es generalmente sensible a la isoniacida, etc.
Estudio de sensibilidad
La sensibilidad de las mycobacterias se estudia como para otros gérmenes, poniendo en
contacto el bacilo con el antibiótico a probar; pero existen algunas diferencias con el
antibiograma utilizado de rutina en los laboratorios, por ejemplo, no se utiliza el medio de
Mueller Hinton, ni el método de difusión en agar (Kirby-Bauer). En su lugar se emplea
Lowenstein-Jensen y distintas técnicas para el antibiograma. Mencionaremos solamente una, la
cual consiste en inocular un medio control y simultáneamente medios que contienen en
solución el antibiótico a probar en diferentes concentraciones. El inóculo bacteriano debe ser de
concentración conocida. La resistencia o sensibilidad se determina por comparación entre el
control y los otros medios.
El PPD positivo (más de 10 mm) permite separar una población infectada de otra que no lo
está, siendo un buen estudio de masas. De todos modos, debe considerarse el contexto del
paciente, su sintomatología y signología, así como estudios radiográficos y datos
epidemiológicos.
Concepto de viraje. Si se realizan dos pruebas tuberculínicas con un intervalo de dos meses en
un año, y la primera es negativa y la segunda positiva con una diferencia de 6 mm o más, se
habla de viraje e indica una infección actual. Puede o no acompañarse de hallazgos clínicos o
radiológicos.
CRITERIO DIAGNÓSTICO
• Paciente con sospecha clínica y epidemiológica de tuberculosis.
• Paciente con tuberculosis extratorácica en la que hay dificultades para aislar el germen.
CRITERIO EPIDEMIOLÓGICO
• Contacto con enfermos de tuberculosis.
• Tuberculosis confirmada (para registro).
Si la reacción tuberculínica es positiva:
1. El paciente está infectado.
2. El paciente recibió BCG.
Si la reacción tuberculínica es negativa:
1. El paciente no está infectado.
2. El paciente está en período prealérgico (período que va desde la infección hasta la aparición
de la hipersensibilidad retardada). Si dos meses más tarde se repite la prueba se puede ver el
viraje de la reacción.
Puede haber falsos negativos por aspectos técnicos o en tuberculosis avanzadas en las que el
50% no reacciona por tener elevadas concentraciones de antígenos en sus tejidos; se revierte
al recuperarse el paciente.
Otros falsos negativos:
• fisiológicos-embarazo;
• infecciones-sarampión;
• desnutrición;
• neoplasias-linfomas;
• medicamentos-corticoides.
El 3-5% de la población es inmunocompetente y no reacciona nunca frente a las pruebas
cutáneas.
Prueba tuberculínica en el paciente VIH positivo: en el paciente VIH positivo la reactividad
disminuye a medida que los CD4 disminuyen. Un diámetro de induración de 5 mm es aceptado
como positivo en un paciente VIH positivo para realizar inmunoprofilaxis (CDC, Center for
Desease Control, Estados Unidos).
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Identificar bacterias anaerobias, cuál es su método diagnóstico, que tipo de afecciones causan
y cómo manejarlos hospitalariamente.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Muestras de tierra.
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Solución salina
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción
Anaerobios son aquellos gérmenes que sólo pueden desarrollarse en ausencia de cantidades
significativas de oxígeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox, por tanto son estrictos
en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son
expuestos al oxígeno molecular libre en la atmósfera, aunque el grado de resistencia bajo
estas condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados por
tratarse de formas biológicas metabólicamente inertes y con muy escasa proporción de agua
en su composición. Si bien se considera bacteria anaerobias aquel germen que puede crecer
sólo en ausencia de oxígeno, la sensibilidad frente al oxígeno varía ampliamente de una
especie a otra. Así, distinguimos bacterias microaerófilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos
u obligados. Las bacterias microaerófilas resultan dañadas por niveles altos de oxígeno como
el atmosférico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%.
MÉTODOS DE CULTIVO
Cultivo
Los medios de cultivo primarios para la siembra de una muestra de anaerobios son varios, pero
en general incluyen un medio no selectivo como el agar sangre y algún medio selectivo.
Además otra placa de agar sangre, una de agar chocolate y una de agar MacConkey son
inoculadas e incubadas en aerobiosis, ya que la mayoría de las infecciones por anaerobios son
polimicrobianas e incluyen bacterias aerobias y facultativas. Un medio de cultivo líquido
habitualmente caldo tioglicolato se utiliza como medio de enriquecimiento cuando la muestra
proviene de un sitio estéril.
Se trata de frascos de 100 ml, al vacío, con el agregado de CO2, una base nutritiva (digerido
tríptico de soja o peptonas) y un agente reductor (tiol o tioglicolato). El porcentaje de sangre a
inocular es del 5 al 10 % v/v. Los frascos se examinan diariamente buscando turbidez,
hemólisis o gas; se consideran negativos definitivamente a los 10 días de incubación previo
subcultivo final.
Jarras de anaerobiosis
Es el sistema más utilizado para generar una atmósfera anaeróbica. Consiste en una jarra de
plástico con una tapa que cierra herméticamente. La atmósfera anaerobia puede lograrse por
dos métodos diferentes. El más sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrógeno y
CO2 que es activado, ya sea mediante la adición de agua o por la humedad de las placas de
agar. El H2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta
reacción es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran
depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra.
Bolsas de anaerobiosis
Tinción de Gram
Identificación
La morfología colonial así como la presencia de hemólisis, olor, etc. son algunas características
a tener en cuenta como primera aproximación a la identificación. Todas los morfotipos
coloniales de la placa de agar sangre incubada en anaerobiosis deben ser examinados con una
tinción de Gram y subcultivadas para determinar su aerotolerancia. Para ello cada colonia debe
ser subcultivada en una nueva placa de agar sangre en anaerobiosis y en una placa de agar
chocolate en CO2.
En la placa de agar sangre se colocan los siguientes discos de antibióticos para una
identificación preliminar de los anaerobios y no con fines de probar la susceptibilidad
antibiótica: kanamicina, colistina, vancomicina.
.
5.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CUESTIONARIO
SESIONES
1.- OBJETIVO
Identificar parásitos de interés clínico en muestras de heces y sangre periférica, , cuál es su
método diagnóstico, que tipo de afecciones causan y cómo manejarlos hospitalariamente.
MATERIALES:
Placas porta y cubre objetos.
Hisopos estériles
Asas microbiológicas
Muestras de heces
Preservados de parásitos intestinales.
REACTIVOS:
Coloración de Gram
Solución salina
Lugol parasitologico
4. ACTIVIDAD FORMATIVA
Introducción:
¿Qué es Parasitología?
Parasitología: rama del conocimiento que estudia los organismos parásitos y los efectos que estos
organismos producen en los organismos hospedadores.
TERMINOLOGÍA
- Huésped definitivo: aquel que posee el parásito en su estado adulto o en el cual se reproduce
sexualmente.
- Huésped intermediario: aquel que posee las formas larvarias en desarrollo o en el cual se produce de
manera asexual.
- Huésped paraténico o transportador: es el que tiene formas larvarias que no se desarrollan en él.
Ciclos de vida: en parasitología, ciclo vital donde el hospedador esta directamente involucrado. Puede
ser:
- INDIRECTO (Heteroxenos): se requieren por lo menos dos hospederos de especies diferentes para
completar el ciclo
Formas evolutivas: formas de desarrollo por las cuáles pasan los parásitos a lo largo del ciclo de vida.
En algunas especies pueden ser muy diversas.
Vector: artrópodos que sirven como transportadores de organismos patógenos. Dos tipos importantes:
- Mecánicos: se da la diseminación del patógeno por medio de la superficie corporal, apéndices, aparato
bucal, entre otros. (moscas)
- Biológicos: hospederos invertebrados que forman parte del ciclo del parásito que hacen ciclos de vida
indirectos.
Zoonosis parasitaria: cuando los parásitos de animales vertebrados se transmiten al hombre. Cuando
la parasitosis afectan igualmente al hombre y a los animales.
Especificidad Parasitaria:
Tipos de parasitismo:
- ACCIDENTAL: parásito infecta hospedador anormal, pero este es permisivo para el desarrollo del
parásito. Ciclo no se completa
- ESPÚREO (Pseudoparasitismo): ingesta de microorganismos de vida libre, que son eliminados por las
heces luego de un tránsito por el tubo digestivo, sin infectar al hospedero.
AMEBAS COMENSALES: No causan una enfermedad imporantante, sin embargo como su vía de
infección es fecal-oral, sirven como medida indirecta del Indice de fecalismo (consumo de agua o
alimentos contaminados con materia fecal). Presentan un ciclo de vida directo.
Son organismos relativamente simples, que presentan un solo núcleo, que puede ser de dos tipos
dependiendo la especie:
- Vesiculosos
•Entamoeba: membrana nuclear con cromatina en placas adosadas a membrana interna, con cariosoma
central
•Limax: membrana nuclear sin cromatina adosada, esta y el cariosoma están en una sola masa dentro
del núcleo
- Compactos
Se adquiere por el contacto de aguas contaminadas (bañistas), a través del sistema respiratorio. Se han
hallado en muestras de heces, garganta, vías nasales. En autopsias en el tejido cerebral se han
encontrado trofozoitos.
Síntomas: cefalea, anorexia, náuseas, vómito, fiebre, rigidez cuello, coma, muerte.
- Balamuthia mandrillaris: afecta pulmón y SNC. Produce GAE: Encefalitis amibiana granulomatosa
(Autopsia: quistes y trofozoitos en cerebro)
- Acantamoeba sp.: producen queratitis ocular (cuadro crónico)
Se da la presencia de síntomas intestinales principalmente: Disentería (diarrea con moso y sangre). Sin
embargo puede evolucionar a Colitis fulminante (penetración pared intestinal) y además si no se ha un
tratamiento oportuno, se pueden producir ciertas complicaciones: Apendicicitis, peritonitis, fistulaciones,
absceso hepático y compromiso de otros tejidos como pulmón, cerebro, bazo y riñón.
GIARDIASIS: Producida por Giardia intestinalis/Lamblia intestinalis. En el ser humano se ubican en:
intestino delgado, duodeno y yeyuno. En estos lugares se la la colonización por adhesión utilizando sus
discos suctorios.
La infección es fecal-oral (transmisión por agua y alimentos contaminados) y el ciclo de vida es directo:
trofozoitos y quistes.
LEISHMANIASIS:
Causada por protozoarios del género Leishmania sp (existen 32 especies distintas, 20 producen la
enfermedad). Es considerada una zoonosis y se da principalmente en regiones tropicales y subtropicales
del mundo.
El parásito tiene un ciclo de vida indirecto, con dos formas evolutivas evidentes:
•Amastigotos (Mamífero): formas intracelulares (macrófagos)
•Promastigotos (Vector): formas extracelulares en el sistema digestivo del vector (infectantes)
En muchos casos existen reservorios de la enfermedad (perros)
VECTOR:
Nombres comunes: aliblanco, papalomoyo. Activo en las noches (a partir de las 5 de la tarde). Hay
diferencias con respecto a la preferencia de especie de Leishmania según vector (Alta especificidad)
Ciclos transmisión:
- Selvático
- Peridomiciliar
- Zoonosis urbana
- Antroponosis (persona-persona: ciclo artificial)
Diagnóstico:
- Amastigotos
- Epimastigotos
- Tripomastigotos
Vector: Triatominos
- Triatoma dimidiata
- Triatoma infestans
- Rhodniux prolixus
- Panstrongylus megistus
La enfermedad se encuentra estrechamente ligada a la pobreza. Los ciclos de Transmisión:
Vías de transmisión:
- Congénita
- Sangre
Fases enfermedad:
- Aguda
- Indeterminada
- Crónica
Diagnóstico:
- Examen microscópico de sangre fresca
- Concentraciones de sangre por centrifugación
- Cultivos
- Xenodiagnóstico
- Serología
TOXOPLASMOSIS: Causado por el parásito Toxoplasma gondii, parásito eurixeno de ciclo de vida
indirecto:
Vías de transmisión:
- Por contaminación
- Fetal (Congénita)*
•Frotis
•Gota Gruesa
PROCEDIMIENTOS:
1. Colocar una gota de NaCl 0.85%, y una de lugol en un porta objetos limpio.
2. Con un palillo obtener una cantidad pequeña y representativa de materia fecal,
(aproximadamente 2mcg) y mezclar en la gota de solución salina.
3. Con el mismo pallillo pasar a la solución de lugol y mezclar hasta obtener una
suspensión uniforme.
4. Colocar un cubreobjetos en cada una de las mezclas (salina y lugol) .
5. Observar y realizar la búsqueda con el objetivo de 10X y diagnostico con 40X.
CUESTIONARIO