Practica Tincion Gram

PRÁCTICA
“TINCIÓN GRAM”
OBJETIVOS:
1. Iniciación en las técnicas del estudio de microorganismos:

cultivo, tinción y morfología.
Material necesario:
Cultivo de bacterias, levaduras, vino agriado.

Antibióticos.
Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada). Lugol
(1 g de iodo en 2 g de ioduro potásico en 100 cc de agua destilada).
Fucsina básica (1 g de fucsina básica en 100 cc de agua destilada).
Aceite de inmersión.
Microscopio
Portaobjetos, asas de cultivo, mechero, cápsulas de Petri, tubos de
ensayo. Papel secante.
1.- INTRODUCCIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que

resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La
principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea. El modo más simple
de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las
células para la microscopía, son suficientes los
procedimientos que usan un solo colorante llamados
de tinción simple. Sin embargo, a menudo se utilizan
métodos que no tiñen de igual modo todas las
células, es el proceso denominado tinción diferencial.
Uno muy usado en microbiología es la tinción Gram.
Basándose en su reacción a la tinción Gram, las
bacterías pueden dividirse en dos grupos: grampositivas y
gramnegativas. Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía
bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias.
Mientras que las bacterias gramnegativas son constantes en su
reacción, los microorganismos grampositivos pueden presentar
respuestas variables en ciertas condiciones (son gramlábiles). Por
ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias grampositivas
pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en
consecuencia, se tiñen por la safranina apareciendo como
gramnegativas. Análogo efecto se produce en ocasiones por
cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones
en la ejecución de la técnica. Por este motivo, es preciso
atenerse, en la práctica, al procedimiento establecido.
Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han
propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de
las paredes celulares de los microorganismos.
Aquí puedes ver las diferencias estructurales y químicas de los

dos tipos de pared bacteriana:
Pared Gram +
 capa densa y uniforme de 200 a
800 A)
 ácidos teicoicos
 polisacáridos
 proteínas (pocas veces)
 glicopéptido (50% del peso seco)
Pared Gram -
 capa interna delgada de 20 a 30

A cubierta por capas externas de
densidad menor)
 lipopolisacáridos
 lipoproteínas
 proteínas
 glicopéptido (10% del peso seco)
El mecanismo de la tinción Gram es la reseñado en el siguiente

esquema:
Productos
que se
Reacción y coloración de las bacterias
utilizan
GRAM + GRAM -
1) Cristal Células color violeta Células color violeta
violeta
2) Lugol Se forma el complejo CV-I. Se forma el complejo CV-I.
solución Las células continúan teñidas Las células continúan teñidas
iodada de color violeta. de color violeta.
3) Alcohol Se deshidratan las paredes Eliminación por extracción de
celulares. Se contraen los grasas de las paredes
poros. Disminuye la celulares. Aumenta la
permeabilidad. El complejo porosidad. El complejo CV-I
CV-I no sale de las células se separa de la célula.
que continúan teñidas de
color violeta.
4) Safranina Células no decoloradas; Células decoloradas; se tiñen
quedan teñidas de color de color rosado.
violeta.
2. TINCIÓN DE GRAM
2.1 Método
2.1.1 Extensión: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de
filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la que.
con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se
lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su
caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se
fija la extensión por el calor, calentando suavemente a la llama
del mechero hasta que se seque.
2.1.2 Coloración:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota
muy pequeña de aceite de cedro y observar al microscopio con el
objetivo de inmersión.
2.2. Observación
Debe utilizarse el objetivo de
inmersión.
Se coloca una gota de aceite de
cedro sobre la preparación. Se
enfoca, preferentemente, con el
micrométrico.
Después de utilizar el objetivo de
inmersión debe limpiarse con
xilol

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1. Iniciación en las técnicas del estudio de microorganismos:

Cultivo de bacterias, levaduras, vino agriado.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que

Aquí puedes ver las diferencias estructurales y químicas de los

 proteínas (pocas veces)

 glicopéptido (50% del peso seco)

 capa interna delgada de 20 a 30

 glicopéptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tinción Gram es la reseñado en el siguiente

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