Tesis de Astaxantina PDF

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA

Y TECNOLOGÍA AVANZADA
ÁREA DE ALIMENTOS
EVALUACIÓN DE DEL CRECIMIENTO CELULAR Y DE LOS

PIGMENTOS
GMENTOS OBTENIDOS DE LA MICROAL
MICROALGA Haematococcus
pluvialis (CHLOROPHYTA:VOLVOC
(CHLOROPHYTA:VOLVOCALES)
ALES) CULTIVADA EN
DIFERENT
DIFERENTES MEDIOS
T ESI S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR
DOCTORA EN TECNOLOGÍA AVANZADA
PRESENTA:
Alumna: M. en C
C. Alicia Soledad Martínez Silva
Director de tesis: Dr. Eduardo San Martín Martínez
MEXICO, D. F. enero, 2010

Alicia Soledad Martínez Silva i
Alicia Soledad Martínez Silva ii
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología de
Microalgas, en el Laboratorio de Investigación de Química y Biología de la
Universidad del Mar Campus Puerto Ángel y en el Laboratorio de Apoyo
Analítico del Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología
Avanzada (CICATA) del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Legaria, bajo la
dirección de Doctor Eduardo San Martín Martínez.
Alicia Soledad Martínez Silva iii

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT), el apoyo económico otorgado durante el desarrollo de
la tesis; mediante la beca otorgada.
Alicia Soledad Martínez Silva iv

ÍNDICE
Página
INTRODUCCIÓN 1
CAPÍTULO. 1 ANTECEDENTES 3
1.1 Pigmentos 3
1.1.1. Definición 3
1.1.2. Clasificación 3
1.1.3. Pigmentos Naturales 3
1.2 Carotenoides 4
1.2.1. Estructura química de los carotenoides 7
1.2.2. Propiedades físicas y químicas de los carotenóides 8
1.2.3. Biosíntesis de carotenóides 10
1.2.4. Funciones de los carotenóides 11
1.2.5. Fuentes de carotenoides 12
1.3 Generalidades de la Asraxantina 14
1.4 Microalgas 17
1.4.1. Algunas características de las microalgas 18
1.4.2. Aspectos de crecimiento de las mmicroalgas 22
1.4.3. Producción de compuestos de interés 24
1.5 Haematococcus pluvialis 25
1.5.1. Descripción de la especie H. pluvialis 25
1.5.2. Morfología, estructura y fisiologia 26
1.5.3. Presencia y distribución 28
1.5.4. Composición química 29
1.5.5. Aplicaciones 32
1.5.6. Medios de cultivo 34
CAPÍTULO 2 JUSTIFICACIÓN 37
CAPÍTULO 3 OBJETIVOS 39
CAPÍTULO 4 MATERIALES Y MÉTODOS 40

4.1 Organismo 40
4.2 Pruebas preliminares 40
4.3 Condiciones de cultivo 40
4.4 Recuento celular
4.4.1 Densidad celular
4.4.2 Parámetros Poblacionales
4.5 Cosecha y secado de la biomasa
4.6 Análisis Químico Proximal
4.7 Extracción 46
4.7.1 Biomasa Humeda
4.7.2 Biomasa Seca
4.7.2.1. Método HCl 4N-Acetona
4.7.2.2. Método Acetona 100%
4.7.2.3. Método DMSO
4.8 Determinación de Pigmentos
4.9 Evaluación del almacenamiento y estabilidad de la biomasa seca
y extractos totales.
Alicia Soledad Martínez Silva v

4.10 Separación e identificación de los pigmentos 47
4.10.1 Cromatografía em capa fina 47
4.10.2 Cromatografía em columna 48
4.10.3 Cromatografía de alta resolución 48
4.11 Bioensayo Antimicrobiano 48
4.11.1 Prueba de Susceptibilidad 48
4.11.2 Categorias de Susceptibilidad 49
4.11.3 Medios de cultivo 50
4.11.4 Microorganismos de referencia 50
4.11.5 Reactivación, mantenimiento y conservación de las cepas 51
4.11.6 Viabilidad de las cepas 51
4.11.7 Preparación de los inóculos 52
4.11.7.1. Bacterias 52
4.11.7.2. Hongo levaduriforme 52
4.11.8 Selección del Antibiótico (Control Positivo) 53
4.11.9 Control negativo 53
4.11.10 Preparación de las concentraciones de los extractos 53
4.11.11 Determinación de la Actividad Antimicrobiana 53
4.11.12 Concentración mínima Bactericida (MBC) 54
CAPÍTULO 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 30
5.1 Características morfológicas de Haematococcus pluvialis 30
5.2 Análisis Químico Proximal 31
5.3 Condiciones de cultivo y parámetros poblacionales de 34
Haematococcus pluvialis. 34
5.3.1. Densidad celular 36
5.3.2. Comportamiento del pH y de la conductividad eléctrica con 38
relación al crecimiento de H. pluvialis. 45
5.3.3. Divisiones por dia
5.3.4. Tasa de crecimiento específico
5.3.5. Tiempo de generación
5.3.6. Producción diaria
5.4 Extracción y Determinación de pigmentos
5.5 Separación e identificación de los pigmentos
5.6 Bioensayo de Actividad Antimicrobiana
5.5.1. Controles positivos
5.5.2. Actividad Antimicrobiana de los extractos crudos
CONCLUSIONES 49
RECOMENDACIONES 50
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51
Alicia Soledad Martínez Silva vi

ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA Página
1 Estructura química de algunos Carotenoides: 6
Carotenos.
2 Estructura química de algunos Carotenoides: Xantofilas. 8
3 Ruta resumida de la biosíntesis de los Carotenoides. 10
4 Isómeros configuracionales de la astaxantina (3S,3’S), 15

astaxantina (3R,3’S) y de la (3R,3’R) astaxantina.
5 Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y 19

marinas.
6 Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo 21

abierto. (b) Bolsas. (c) Garrafones. (d) Estanques. (e)
Fotobioreatores. (f) Carboy.
7 Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Célula 28

vegetativa falgelada. b. Célula vegetativa sin flagelos.
c. Palmella. d. y f. Aplanóspora.
8 Haematococcus pluvialis. (a) Depósito de agua 29

estancada en los Montes Pirineos, España. (b) Pileta
con agua estancada.
9 Conservación de H. pluvialis. (a) en agar y (b) en medio 40

líquido.
10 Determinación de la actividad antimicrobiana por el 49

método de difusión en placa (Kirby-Bauer). El perfil de
acción se mide por la formación de halos de inhibición.
11 Diagrama de flujo de la curva de crecimiento 52

microbiano de los microrganismos de referencia.
12 Micrografía H. pluvialis (40X) en forma de quiste 27

tomada con un microscopio óptico.
13 Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo 33

f/2 y QF (fertilizante foliar).
14 Variación del pH de los medios de cultivo f/2 y QF 34

(fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días.
Alicia Soledad Martínez Silva vii

15 Conductividad eléctrica de los medios de cultivo f/2 y 35
QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30
días.
16 Divisiones por día de H. pluvialis en los medios f/2 y QF 36

(fertilizante foliar) en 30 días de cultivo.
17 Tasa de crecimiento específico (m) de los medios de 46

cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H.
pluvalis en 30 días.
18 Tiempo de generación de H. pluvialis en 30 días de 47

cultivo en los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante
foliar).
19 Producción diaria de la microalga H. pluvialis en los 48

diferentes medios de cultivo.
Alicia Soledad Martínez Silva viii

ÍNDICE DE TABLAS
No. Tabla Página

1. Fuentes naturales de Carotenoides. 13
2. Principales organismos productores de Astaxantina.
3. Clasificación Taxonómica de Haematococcus pluvialis. 25
4. Compuestos comúnmente presentes en H. pluvialis. 29
5. Perfil de aminoácidos en H. pluvialis. 29
6. Ácidos grasos encontrados en la microalga H. 31

pluvialis.
7. Parámetros para las diferentes condiciones

preliminares de los cultivos de la microalga.
8. Condiciones iniciales de los medios de cultivo de H.

pluvialis.
9. Composición química de diferentes medios de cultivo 41

utilizados en el crecimiento de H. pluvialis.
10. Microorganismos utilizados en el ensayo 51

antimicrobiano.
11. Antibióticos probados para definir los controles 63

positivos.
12. Halos de inibición de los controles positivos. 64
Alicia Soledad Martínez Silva ix

Resumen
La obtención de carotenoides de microalgas es un tema de gran importancia

científica y en la industria alimenticia y acuicultura. La microalga
Haematococcusp pluvialis representa una fuente natural de carotenoides como
la astaxantina. Este pigmento tiene una función de un poderoso antioxidante
biológico. Debido a su particular color, puede ser usado para pigmentar los
salmónidos y la trucha arco iris. El objetivo de este trabajo fue estudio
comparativo entre dos medios de cultivo para evaluar los cambios en el
crecimiento celular y el contenido de pigmento en esta microalga. Se utilizaron
células de H. pluvialis en forma de quiste y el f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un
fertilizante foliar (QF) como medios de cultivo. La irradiancia fluctuó entre
4541,03 y 3766,26 lux. La agitación fue manual y la temperatura fue de 28oC.
La densidad celular se estimó por células directo. El pH estuvo entre 8,37 a
8,42 y la conductividad eléctrica de 135,3 a 142,1 mV. Para la extracción de los
pigmentos húmedos en la biomasa húmeda se utilizó acetona 100% y para la
biomasa seca se utilizó DMSO, HCl 4N y acetona 100%. La clorofila a, b, la
astaxantina y los carotenoides totales se midieron mediante espectrofotómetro
UV-visible. Los experimentos se llevaron a cabo 5replicas. H. pluvialis se
adapto en menos tiempo en el medio QF que en el f/2. El contenido de clorofila
a y b en el f/2 fue inferior a la QF. Sin embargo, el contenido de astaxantina
obtenido fue mayor en el medio f/2 que en el medio QF. Los resultados que se
obtuvieron no están reportados en la literatura, pero algunos autores informan
que se puede obtener hasta el 7% de astaxantina en otros medios.
Alicia Soledad Martínez Silva x

Abstract
Obtaining carotenoids from microalgae is a subject of great scientific

importance and within the food industry and aquaculture. The microalgae
Haematococcus pluvialis represents a natural source of carotenoids such as
astaxanthin. This pigment acts as functions as a powerful biological antioxidant.
Due to its particular color, it can be used to pigment salmonids and the rainbow
trout. The objective of this work was a comparative study between two growth
mediums to assess changes in cell growth and the pigment content in this
microalgae. We used cells from H. pluvialis in cyst form for cultivation in the f/2
(Guillard and Ryther, 1962) medium and in Foliar Fertilizer (QF) medium. The
irradiance fluctuated between 4541.03 and 3766.26 lux. The agitation was
manual and the temperature was 28oC. The cell density was estimated by cell
counts direct. The pH was between 8.37 to 8.42 and the conductivity of 135.3 to
142.1 mV. For the extraction of wet pigments we used 100% acetone and for
dry biomass we used DMSO, HCl 4N and 100% acetone. Chlorophyll a, b,
astaxanthin and total carotenoids were measured using UV-Visible
spectrophotometer. Experiments were carried repeated replicated five times. H.
pluvialis adapted in less time in the QF medium than in the f/2. The content of
chlorophyll a and b in the f/2 was lower than QF. However, the content of
astaxanthin obtained was greater for the f/2 media than for the QF medium. The
results using these culture media are not reported in the literature but some
authors reported up to 7% of astaxanthin in other mediums.
Alicia Soledad Martínez Silva xi

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
En la actualidad, uno de los principales intereses en Ciencia y

Tecnología de Alimentos es la extracción y caracterización de nuevos
ingredientes funcionales de origen natural. Estos ingredientes biológicamente
activos pueden ser utilizados no sólo como conservadores naturales contra la
degradación de los alimentos, sino también se pueden añadir a los alimentos
como ingredientes capaces de promover nuestra salud (Guarner y Azpiroz,
2005)
Entre los compuestos activos se encuentran algunos pigmentos
naturales como los carotenoides que son los responsables de los colores
naturales de color amarillo, naranja y rojo, utilizado en la industria alimentaria,
farmacéutica, cosmética y dietética. Más allá de su uso extensivo como
colorante y el enriquecimiento de los alimentos, también se utilizan debido a su
actividad pro- vitamínica A, y sus propiedades que se traducen en posibles
funciones biológicas benéficas para la salud, tales como el fortalecimiento del
sistema inmunológico y disminución del riesgo de enfermedades degenerativas
(ciertos tipos de cáncer, las enfermedades cardiovasculares, degeneración
macular y las cataratas) (Niizu, 2003).
Una de las fuentes naturales de pigmentos carotenoides más apreciadas
en las últimas décadas por su diversidad y propiedades terapéuticas son las
microalgas. Estos organismos son una fuente natural muy interesante de
nuevos compuestos (Plaza et al., 2008).
Varias especies de microalgas se cultivan comercialmente en algunos
países y la biomasa producida ha sido utilizada como una fuente de productos
para su aplicación en la industria alimentaria. Según Pulz y Gross (2004), el
mercado de alimentos funcionales, utiliza microalgas en pastas, pan, yogur,
bebidas y muestra un rápido desarrollo en los países como Francia, Estados
Unidos, China y Tailandia. Las principales microalgas que se cultivan
comercialmente son de los géneros Chlorella Beyerinck (Chlorophyceae) y
Arthrospira Stizenberger, (Cyanophyceae); para alimentos naturales ("Health
food"); Dunaliella salina Teodoresco, (Chlorophyceae) para la obtención de
Alicia Soledad Martínez Silva 1

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA INTRODUCCIÓN
betacaroteno y Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la

obtención del pigmento astaxantina (Becker, 2004).
Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) es una microalga verde
unicelular de agua dulce que ya ha sido estudiado por su capacidad para
acumular el pigmento astaxantina bajo condiciones de estrés. La astaxantina
es un carotenoide rojo-naranja con fuertes propiedades antioxidantes (Yuan y
Chen, 1998). Además, como ya ha sido demostrado en otros organismos y en
algunas microalgas (Borowitzka, 1999; Mendes et al., 2003; Cohen, 1999;
Molina Grima et al., 2003), que junto con la astaxantina, existen diferentes
compuestos con propiedades antibacterianas, antivirales y/o actividad
antifúngica que se pueden esperar que se encuentren también en esta
microalga. Por lo tanto, H. pluvialis puede ser considerada como una fuente
natural potencial de pigmentos naturales que podrían utilizarse como
ingredientes para la preparación de alimentos funcionales.
Sin embargo esta microalga no es de fácil cultivo y presenta ciertas
dificultades al obtener los pigmentos en unas cantidades apreciables lo que
debilita sus posibilidades de uso como fuente natural dichos compuestos.
Actualmente se están desarrollando medios de cultivo óptimos para su
crecimiento así como una adecuada tecnología de cultivo que incrementara la
producción de biomasa hasta niveles relevantes para la producción de estos
compuestos.
No obstante, el uso de los medios de cultivo sintéticos ha incrementado
sustancialmente el valor económico para la producción de la biomasa de este
microorganismo (González et al., 1999). Por lo que recientemente se ha
ensayado el uso de sustratos alternativos y no convencionales (González et al.,
1999, Romero et al., 2001, Vigna et al., 2002 y Vera et al., 2002). Se destaca
que a partir de estos medios innovadores se han obtenido resultados
comparables y superiores a los correspondientes a los medios sintéticos.
En este trabajo se presenta un estudio comparativo entre dos medios de
cultivo para evaluar los cambios en el crecimiento, el contenido pigmentos
fotosintéticos y la actividad antimicrobiana de Haematococcus pluviales
cultivada en medio f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un Fertilizante foliar.

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA ANTECEDENTES
CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES
1.1. Pigmentos
Los pigmentos son generalmente colores que se pueden observar

durante toda la vida. Están presentes en todos los organismos del mundo,
siendo las plantas los principales productores. Los pigmentos naturales o
sintéticos son utilizados en medicamentos, alimentos, ropa, cosméticos,
decoración y en varios otros sectores.
1.1.1. Definición
Los pigmentos son compuestos químicos que absorben luz en el
intervalo de longitud de onda de la región visible. La producción del color se
debe a la estructura específica del compuesto (cromóforo), esta estructura
capta la energía y la excitación que es producida por un electrón de una órbita
exterior a una órbita mayor, la energía no absorbida es refleja y/o refractada
para ser capturada por el ojo, y los impulsos neuronales generados serán
transmitidos al cerebro, donde puede ser interpretados como color (Delgado-
Vargas, et al, 2000).
1.1.2. Clasificación
Los pigmentos pueden ser clasificados tomando en cuenta algunas de
las características como origen (naturales, sintéticos o inorgánicos), estructura
del cromóforo (pueden tener sistemas conjugados como los carotenoides, las
antocianidas y las betalaínas), estructura de los pigmentos naturales (como los
derivados del tetrapirrol, derivados de los isoprenoides, etc.) y como aditivos
alimentarios (pueden ser certificados y no certificados, según la FDA).
1.1.3. Pigmentos Naturales

Hoy en día, las ventajas de los pigmentos naturales sobre los sintéticos
han aumentado debido a las propiedades biológicas de los pigmentos naturales
que se han ido descubierto. Además, algunos productos tienen un gran valor
en el mercado sólo la utilización de tintes naturales. Sin embargo, es necesario

señalar que las ventajas de los colorantes sintéticos son muy conocidas como
el alto poder de pigmentación, la estabilidad, el almacenamiento, la facilidad del
proceso de obtención y, además, son más baratos y están disponibles en
cantidades ilimitadas (Wissgot y Bortlik, 1996).
Los pigmentos naturales presentan otra función además de embellecer
el medio ambiente. Es a través de ellos, que produce el proceso de
fotosíntesis, lo cual sería imposible sin la presencia de la clorofila y de los
carotenoides. Asimismo, se ha reportado en la literatura, la acción antioxidante,
la fotoprotección (Teramura y Middleton, 1993), los mecanismos de defensa de
plantas (Snyder y Nicholson, 1990), y la participación en los procesos sexuales
de las plantas y los animales. Actualmente se sabe que además de pigmento,
el color y tienen diferentes funciones en el cuerpo donde estos compuestos se
encuentran, estos compuestos pueden tener efectos farmacológicos
beneficiosos para el consumo.
Cuatro grupos principales de pigmentos son responsables de la
coloración en mamíferos, aves, peces e invertebrados de importancia
económica. Estos son las porfirinas, piridinas, melaninas y carotenoides
(Hudon, 1994). Las porfirinas son de importancia primordial en la coloración de
la cáscara de huevos de especies aviares (Lang et al., 1987). Las piridinas son
responsables por muchos de los amarillos y rojos brillantes en peces, anfibios y
reptiles (Nixon, 1985); estos pigmentos son solubles en agua y son de
producción endógena (Hudon, 1994). Las melaninas dan lugar a los negros,
grises y marrones de vertebrados y muchos invertebrados, así como también
de sus rojos y amarillos. Las melaninas son polímeros heterogéneos
compuestos de metabolitos de tirosina (Hudon, 1994). Los pigmentos
carotenoides, obtenidos por los animales de sus dietas, confieren la mayoría de
los brillantes colores rojo, amarillo y naranja, muy apreciados no sólo en
acuicultura, sino también en la industria avícola (Toyomizu et al., 2001).
1.2. Carotenoides
Los carotenoides son pigmentos naturales responsables de los colores

amarillo, naranja y rojo en muchos alimentos tales como frutas, verduras, yema
de huevo, algunos pescados como el salmón, la trucha y los mariscos

(Maldonade et al., 2007).

En las industrias de alimentos, los carotenoides se utilizan
principalmente como colorantes, con el objetivo de restablecer el color perdido
durante el procesamiento y almacenamiento así como estandarizar el color de
algunos productos alimenticios. Recientemente, con el creciente interés en la
salud, los carotenoides también se han añadido a los alimentos por presentar
actividades biológicas que enriquecen los productos alimenticios. También son
importantes precursores de muchos compuestos químicos responsables del
aroma de algunos alimentos, de algunos olores florales (Sánchez-Contreras et
al., 2000), de color específico y fotoprotección (Marasco y Schmidt-Dannert,
2003).
Además de color, los carotenoides tienen importantes actividades
biológicas como la inhibición de las enfermedades que ocasionan los radicales
libres presentes, tales como la arteriosclerosis, cataratas, degeneración
muscular, la esclerosis múltiple, el cáncer, las enfermedades degenerativas y
cardiovasculares (Maldonade et al.,2007; Bhosale, 2004; Aksu y Eren, 2007).
Industrialmente los carotenoides como el b-caroteno y la astaxantina son
utilizados como colorantes naturales para alimentos o adicionados en las dietas
en acuicultura (Aksu y Eren, 2007). La astaxantina es un pigmento encontrado
en los animales acuáticos, tales como la langosta, el cangrejo y el camarón.
Este pigmento protege contra los radicales libres, la peroxidación lipídica, el
daño oxidativo del colesterol LDL, la oxidación de ácidos grasos esenciales
poliinsaturados y la protección contra los efectos de la luz ultravioleta, las
membranas celulares, las células y los tejidos (Hu et al., 2006).
Debido a la alta tasa de insaturación, factores tales como el calor, la luz
y los ácidos ocasionan isomerización de los carotenoides trans, que es la forma
más estable en la naturaleza, a forma cis, promoviendo una ligera pérdida del
color y de la actividad pro-vitaminíca. Los carotenoides son también
susceptibles a las oxidaciones enzimáticas o no enzimáticas, que dependen de
la estructura de los carotenoides, la disponibilidad de oxígeno, la presencia de
enzimas, metales, pro-oxidantes y antioxidantes, la alta temperatura y la
exposición a la luz (Schroeder y Johnson, 1995).
Los pigmentos pueden absorber la luz sobre todo en la región
ultravioleta (UV) y del espectro visible, el resto es transmitido o reflejado, y

representa el color. La estructura responsable de la absorción de la luz es el

grupo cromóforo, por la que los carotenoides se caracterizan por dobles
enlaces conjugados. Cada carotenoide es caracterizado por un espectro de
absorción electrónica. Por lo tanto, la espectroscopia de absorción es una
técnica importante en el análisis de los carotenoides (Gross, 1991).
La producción comercial de los carotenoides a partir de microorganismos
compite principalmente con la producción sintética por procedimientos
químicos. Actualmente, los carotenoides utilizados industrialmente se obtienen
por vía química o por extracción de plantas y/o las microalgas. Sin embargo,
debido a la preocupación por el uso de aditivos químicos en los alimento, existe
un creciente interés por los carotenoides obtenidos naturalmente por procesos
biotecnológicos.
Comercialmente, los carotenoides son utilizados como colorantes
alimentarios y como suplementos nutricionales, con un mercado mundial
estimado en US$ 935 millones/año, siendo que solamente la astaxantina
representa cerca de unos US$ 150 millones en el año 2000 y, con un valor de
US$ 2000/kg (Fraser y Bramley, 2004).
Según Silva (2004), la producción biotecnológica de carotenoides ha
aumentado debido a factores tales como la posibilidad de utilizar sustratos de
bajo costo para la bioproducción; la denominación de sustancias naturales;
pequeño espacio de producción, no está sujeta a las condiciones ambientales
como el clima, la temporada o la composición de los suelos, y el control de las
condiciones de cultivo.
1.2.1. Estructura química de los carotenoides

Los carotenoides son en su mayoría compuestos tetraterpenoides
formados por ocho unidades isoprenoides, siendo el esqueleto de la molécula
un largo sistema central de enlaces dobles alternados (Britton, 1995). Los
hidrocarburos correspondientes a la fórmula empírica C40H56 son conocidos
como carotenos (Figura 1) y los derivados conteniendo una o más funciones
oxigenadas (aldehido, ácido caboxílico, epoxi, hidroxi, ceto, metoxi) se conocen
como xantofilas, como se muestra en la Figura 2 (Schmidt et al., 1994).
Los carotenoides pueden también ser acíclicos o poseer un anillo de seis
miembros (ocasionalmente de cinco miembros), a uno o ambos extremos del

esqueleto molecular (Schmidt et al., 1994). Pueden también estar presentes en

forma libre, así como en forma de ésteres, glicósidos, sulfatos y caroteno-
proteínas (Matsuno y Hirao, 1989).
Figura 1. Estructura química de algunos Carotenoides: Carotenos.
1.2.3. Propiedades físicas y químicas de los carotenoides

Las propiedades físicas y químicas de los carotenoides son
consecuencia de su estructura química. El sistema de dobles enlaces
conjugados, su más notable característica, es el cromóforo absorbente de luz
que confiere a estos pigmentos su atractivo color. La mayoría de los
carotenoides absorbe luz en el intervalo de 400-500 nm, exhibiendo su máximo
a tres longitudes de onda que resultan en un espectro de tres bandas. A mayor
número de dobles enlaces conjugados, mayor el valor de l máxima. Sin
embargo, la ciclación de la molécula resulta en cambio hipsocrómico
(desplazamiento del l máxima hacia una más baja longitud de onda), efecto

hipocrómico (descenso en absorbancia) y pérdida de estructura fina (espectro

con picos menos definidos).
Figura 2. Estructura química de algunos Carotenoides: Xantofilas.
El licopeno (Fig. 1), un carotenoide acíclico insaturado, es rojo y

presenta l máxima a 444, 470 y 502 nm; el b-caroteno bicíclico, si bien
contiene el mismo número de dobles enlaces conjugados como el licopeno, es
amarillo-naranja y tiene un l máxima a 450 y 477 nm y una mera inflexión a
425 nm. El g-caroteno monocíclico es rojo anaranjado y exhibe un l máxima y
espectro intermedio entre los del licopeno y b-caroteno. Otros carotenoides, en

lugar de exhibir un espectro de tres picos, presentan un espectro que consiste

en una banda única, ancha y simétrica. Este es el caso de los ceto-
carotenoides, tales como la astaxantina, cantaxantina y equinona. Tanto, la
longitud de onda de máxima absorción (l max) y la forma del espectro
(estructura espectral fina) son características del cromóforo de la molécula que
proveen valiosa información para identificar carotenoides (Britton, 1995) Aparte
de sus propiedades de absorción de luz, la cadena polieno también confiere a
los carotenoides su distintiva reactividad química, de ser muy susceptible a la
oxidación e isomerización. Un gran número de isómeros geométricos pueden
existir; sin embargo, los carotenoides son naturalmente de la forma trans (E), si
bien la presencia de isómeros cis (Z), usualmente en pequeñas cantidades,
deberá ser siempre considerada (Schmidt et al., 1994). La inestabilidad de los
carotenoides respecto a la oxidación, es una característica importante de la
molécula en relación a la química de los radicales libres (Britton, 1995)
En lo que respecta a su solubilidad, los carotenoides son como otros
compuestos isopropenoides superiores, siendo los carotenos típicos
hidrocarburos no polares y las xantofilas más polares, pero insolubles en agua
(Schmidt et al., 1994). Su comportamiento lipofílico hace de ellos propensos a
acumularse en compartimientos lipofílicos como las membranas o
lipoproteínas. La tendencia lipofílica de estos compuestos influencia también en
su absorción, transporte y excreción en el organismo (Stahl et al., 1993). Sólo
combinados con proteínas (caroteno-proteínas), los carotenoides son solubles
en una fase acuosa. La presencia de caroteno-proteínas se observa en
crustáceos tales como langosta, cangrejo y langostino (Shahidi et al., 1998).
Es de gran importancia entender las propiedades físicas y químicas de
los carotenoides, tales como su tamaño, forma, polaridad, siendo estas
determinantes para su habilidad de encajar correctamente en su
medioambiente molecular y permitirles su óptimo funcionamiento (Britton,
1995).
1.2.4. Biosíntesis de carotenoides

La biosínteis de carotenoides se produce a través de la ruta de los
isoprenoides o terpenoides. El primer paso importante en la biosíntesis de
carotenoides (Figura 3) es un acoplamiento cabeza con cabeza de dos

moléculas del C20 geranil-geranil difosfato (GGPP) que da lugar al incoloro

fitoeno. En los siguientes pasos, la introducción de dobles enlaces crea las
propiedades absorbentes de luz, que determinan el color de los carotenoides.
Finalmente, ocurren diversas variaciones estructurales, que según Britton,
(1998) resultan en los cientos de carotenoides.
Figura 3. Ruta resumida de la biosíntesis de los carotenoides.
1.2.5. Funciones de los carotenoides

Las funciones de los carotenoides pueden ser divididas en dos grupos:
(1) fenológicas y (2) fisiológicas (Latscha, 1991). En la naturaleza, el rol más
evidente de los carotenoides es el de conferir la diversidad de colores
observados en plantas, frutos, flores y en el reino animal.
En plantas superiores, los carotenoides no sólo confieren coloración,
sino también características de sabor y fragancia (tabaco, flores y frutas), a
través de metabolitos de carotenoides (Enzell, 1985). Las funciones fisiológicas

de los carotenoides en plantas se relacionan con su rol en el proceso

fotosintético.
En la fotoprotección, los carotenoides disipan la energía lumínica usada
en la fotosíntesis e inhiben la formación de especies de oxígeno reactivo
(ROS), siendo ambos mecanismos de defensa contra la excesiva energía solar.
Además los carotenoides participan en la colección de luz y la transferencia de
energía a la clorofila, para la función de fotosíntesis (Deming-Adams et al.,
1996).
En animales, una de las más importantes funciones de los carotenoides
es como precursores de vitamina A (Krinsky et al., 1993). Este campo ha sido
extensamente estudiado debido a la importancia fisiológica de la vitamina A en
el crecimiento, la visión y la reproducción. No todos los carotenoides son
precursores de vitamina A; sólo 60 han sido mencionados como precursores de
retinoides (Pfander, 1987). Los más importantes precursores son: a-caroteno,
g-caroteno, b-criptoxantina, equinona, b-apo-12’-carotenal y por supuesto b-
caroteno. Desde el punto de vista estructural, los precursores de retinoides
deberán tener por lo menos un anillo b no sustituído Sin embargo, se ha
encontrado que ciertas xantofilas, tales como cantaxantina, astaxantina,
zeaxantina, luteína y tunaxantina, son también precursores de retinoides en
peces y ratas (Matsuno, 1991).
Los carotenoides participan en los mecanismos de protección contra la
oxidación, atrapando dos de las moléculas ROS (Sies, 1986; Halliwell, 1996):
(1O2) un estado excitado de una forma parcialmente reducida de oxígeno,
inestable y altamente reactiva, y radicales peroxil, generados en el proceso de
oxidación de lípidos (Stahl y Sie, 2003). En general, los carotenoides son
considerados antioxidantes, previniendo enfermedades causadas por estrés
oxidativo (Chew y Park, 2004).
Los carotenoides también participan en la mejora del crecimiento (Inborr
y Lignell, 1997), en la función inmune y resistencia a enfermedades en
animales superiores y el hombre (Jyounchi et al., 1993; Chew y Park, 2004), en
la función reproductiva, además de participar en señales sexuales, se ha
observado la mejora del desempeño reproductivo de vacunos alimentados con
dietas suplementadas con b-caroteno.

1.2.6. Fuentes de carotenoides

Entre el grupo de carotenoides sintéticos, la astaxantina es el principal
pigmento usado en acuicultura a nivel mundial (Higuera-Ciapara et al., 2006),
siendo la cantaxantina la fuente predominante en salmónidos (Torrissen, 1986;
Choubert et al., 1994; Metusalach et al., 1996). Sin embargo, ya que la
astaxantina es el carotenoide presente naturalmente en el músculo de los
salmónidos, la astaxantina sintética es el pigmento preferido ya que produce el
verdadero color observado en estas especies. En cuanto a la cantaxantina,
esta le confiere al filete una coloración más amarillo-anaranjada (Johnson,
1992).
El alto costo de los carotenoides sintéticos y la creciente demanda por
una pigmentación natural, ha estimulado el uso de fuentes naturales de
carotenoides (Tabla 1) con potencial de industrialización. Sin embargo, estos
productos participan a la fecha de sólo una pequeña fracción del mercado,
debido a su limitada producción (McCoy, 1999). Es este el caso de algunos
microorganismos tales como microalgas, bacterias y levaduras que se ha
informado sintetizan astaxantina (Johnson y Schroeder, 1995; Amstrong, 1997)
y otros carotenoides de interés.
La microalga de agua dulce Hematococcus pluvialis tiene la habilidad de
acumular grandes cantidades de astaxantina, a nivel de 1.5 a 5.0% w/w en
base seca (Johnson y Schroeder, 1995; Krishna y Mohanty, 1998). Otra
microalga que también ha dado resultados positivos en pigmentación de peces
es Chlorella vulgaris (Gouveia et al., 1996; 2002); mientras que la microalga
Chlorococcum sp parece ser una fuente promisoria de astaxantina,
cantaxantina y adonixantina (Higuera-Ciapara et al., 2006). Es preciso señalar
que además de conferir coloración apropiada, las microalgas tendrían un efecto
positivo en el crecimiento, como fue mostrado en un estudio con larvas de
Penaeus monodon (Darachai et al., 1999).
En el campo de las levaduras, Phaffia rhodozyma es probablemente la
más importante, ya que contiene astaxantina como su principal carotenoide
(Andrewes y Starr, 1976), constituyendo aproximadamente 83 a 87% del total
de pigmentos (Shahidi et al., 1998). El isómero óptico (3R,3’R) de astaxantina
predomina en las levaduras rojas, opuesta a la configuración normal (3S,3’S)
presente en otras fuentes (Andrewes y Starr, 1976). Los isómeros ópticos

tienen el mismo grado de utilización y su configuración óptica es mantenida

después de su deposición en el músculo de la trucha arco iris (Foss et al.,
1984). Johnson et al., (1980) han informado que Phaffia rhodozyma también es
una buena fuente de proteínas y lípidos. La inclusión de esta fuente de
carotenoides, aparte de su efecto positivo en la pigmentación de peces, mejora
la función hepática y el potencial defensivo contra el estrés oxidativo (Nakano
et al., 1995; 1999)
Tabla 1. Fuentes naturales de Carotenoides.
Fuente (mg/Kg)
Harina de flor de cempasúchil (Tagetes erecta) 6000 – 10000

Harina de chile (Capsicum annuum) 500 – 10000
Microalga Chlorella sp. 4000
Harina de alfalfa (Medicago sativa) 400 – 500
Harina de glúten de maíz (Zea mais) 330
Páprika española 274
Achiote (Bixa Orellana) 265
Maíz amarillo (Zea mais) 10 – 25
Fuente: Cuca et al., 1990
Los desechos del procesamiento de crustáceos (camarón, krill, cangrejo

y langostino) tienen también potencial como fuentes de carotenoides. En vista
del hecho que cerca de 70% del peso bruto de la captura constituyen desechos
de procesamiento (Simpson y Haard, 1985), la necesidad de reducir los
problemas medioambientales causados por el gran volumen de estos desechos
(Torrissen y Naevdal, 1984; Sahidi, 1995) y su contenido de carotenoides,
hacen de los desechos de crustáceos un material atractivo para su
industrialización, siendo la astaxantina el carotenoide predominante (Shahidi et
al., 1994; Higuera-Ciapara et al., 2006). Por lo general, este material está
compuesto de sales minerales (15-35%), proteínas (25-50%), quitina (25-35%),
de acuerdo con Lee y Peniston, (1982).
Los subproductos de crustáceos han sido utilizados en la coloración de
tegumentos y músculos de especies de importancia económica, con buenos

resultados (Torrissen et al., 1989; Coral, 1997). Desventajas de esta fuente de

carotenoides son la variabilidad en la concentración de pigmento y los elevados
contenidos de ceniza y quitina, que reduce significativamente su digestibilidad
por los peces y limita grandemente el nivel de inclusión en la formulación de
dietas.
Las plantas también muestran potencial como fuentes de carotenoides,
como los ensayos con pimentón rojo han dado buenos resultados, si bien se
observó una más baja eficacia en comparación con astaxantina disponible
comercialmente (Carter et al., 1994; Yanar et al., 1997). Además, los pigmentos
de la óleo resina de páprika confieren una coloración menos deseable a la
trucha arco iris, en comparación con la cantaxantina (Katar et al., 1999).
En un estudio llevado a cabo con Sparus aurata (la dorada) alimentada
con una dieta conteniendo harina de gluten (rica en zeaxantina) la coloración
de la frente y el opérculo alcanzaron el amarillo característico de sus
contrapartes silvestres (Robaina et al., 1997). Es de interés continuar
investigando otras probables fuentes vegetales de carotenoides para peces. El
calendula (marigold), rico en luteína, puede ser una alternativa interesante,
dado su eficaz uso en la avicultura para la coloración de la yema del huevo y
de la piel.
1.3. Generalidades de la astaxantina.
La astaxantina (3,3’-dihidroxi-b,b-caroteno-4,4’-diona) es un
oxicarotenoide como se observa en la Figura 4 y pertenece al grupo de las
xantofilas.
La astaxantina producida industrialmente presenta una molécula idéntica
a aquella presente en organismos vivos, siendo una mezcla de los isómeros
(3S, 3S), (3R, 3S) y (3R, 3R) en proporciones 1:2:1, respectivamente (Fig. 4).
Al igual que otros carotenoides, este pigmento está formado por ocho unidades
de isopreno que por condensación dan estructuras carbonadas de cuarenta
átomos, llamados tetraterpenos.
La fórmula molecular de este carotenoide es C40H52O4 y posee un peso
molecular aproximado de 596.86. Este pigmento fue identificado químicamente
por Kühn y Sorenson, (1983) y presenta formas de cristales de color violeta

oscuro, su punto de fusión es de aproximadamente 224oC. Es insoluble en

soluciones acuosas, pero soluble en diclorometano (30 g/L), en cloroformo (10
g/L), acetona (0.2 g/L), dimetilsulfóxido (0.5 g/L) y otros disolventes polares. Es
sensible a la luz, a la temperatura, a los ácidos, al oxígeno y a la presencia de
álcalis. En condiciones de saponificación sufre una conversión a astaceno.
La astaxantina presenta dos carbonos asimétricos en la posición 3 y 3’
(Fig. 4) y puede existir en cuatro configuraciones, incluyendo los enantiómeros
idénticos (3S,3’S; 3R,3’R) y formas meso (3R,3’S; 3’R,3S) (Müller et al., 1980).
Figura. 4. Isómeros configuracionales de la astaxantina (3S,3’S) astaxantina,

(3R,3’S) astaxantina; (3R,3’R) astaxantina.
El isómero configuracional 3S,3’S, se encuentra presente en los huevos

de la langosta (Homarus gamarus), al igual que en la microalga H. pluvialis,
hecho que causó controversia y frenó el desarrollo comercial de la producción
de astaxantina, utilizando como fuente natural a P. rhodozyma, por las
restricciones que pudiera imponer la FDA al considerar que el isómero 3R,3’R
no se encontraba en la naturaleza por lo que fue prohibido el uso de
astaxantina como aditivo para alimento de peces. Estudios posteriores
demostraron que los isómeros meso y sus enantiómeros se encuentran en
huevos de langosta, camarón, salmón en el zooplancton y el krill del Atlántico.

Por lo tanto, el isómero de astaxantina que ingiere el salmón carece de

relevancia biológica (Johnson et al., 1980).
Tabla 2. Principales organismos productores de Astaxantina.
Contenido total de Astaxantina Principal

Especie
Astaxantina (mg/100g) esterificada isómero
Libre y
Salmón Sockeye 26 a 37 3S-3’S
esterificada**
Libre y
Salmón Coho 9 a 21 3S-3’S
esterificada**
Libre y
Salmón Chun 3a8 3S-3’S
esterificada**
Libre y
Salmón Chinook 8a9 3S-3’S
esterificada**
Libre y
Salmón rosa 4a6 3S-3’S
esterificada**
Libre y
Salmón Atlántico 3 a 11 3S-3’S
esterificada**
Libre y
Trucha arcoiris 1a3 3S-3’S
esterificada**
Esterificada**
Huevos de salmón 0 a 14 N. D.
*
Esterificada**
Besugo rojo 2 a 14 N. D.
*
Huevos de besugo 3a8 N. D. N. D.
Libre y
Langosta N. D.
esterificada**
Esterificada**
Copépodos 39-80 3R-3’R
*
Esterificada**
Langostilla 46-130 3R-3’R
*
Esterificada**
Aceite de langosta 72.7 N. D
*
Esterificada**
Harina de cangrejo 13.7 3S-3’S
*
Esterificada**
Camarón del Ártico 116.0 3R-3’R
*
Esterificada**
Phaffia f. (levadura) 30-800 3R-3’R
*
Astaxantina sintética 800 Libre 3R-3’S
Esterificada**
H. pluvialis 1000-3000 3R-3’S
*
*Los crustáceos en donde se encontraron mayormente los isómeros 3S -3’S.
**Dependiendo del tejido, la astaxantina se puede encontrar libre o esterificada.
***También contienen pequeñas cantidades de astaxantina libre.
N.D. No detectado.
Fuente: Christiansen y Torrissen, 1997.

La astaxantina es un pigmento carotenoide presente en animales

marinos tales como los salmones y los crustáceos, ya que estos animales no
pueden sintetizar astaxantina por sí solos la toman en sus alimentos naturales
la cual es adicionada a la alimentación de los salmones, trucha y camarones
cultivados para intensificar su color. En la tabla 2 se describe el contenido total
de astaxantina en varios organismos. La astaxantina posee una actividad
antioxidante más alta que el b-caroteno y el a-tocoferol (Yamane et al., 1997).
La función principal de este colorante es realizar una fotoprotección
pasiva (como filtro), reduciendo la cantidad de luz disponible al complejo
colector de luz del fotosistema II, minimizando el riesgo de fotoinhibición en
cloroplastos (Linden, 1999). La astaxantina es usada para la pigmentación de
la piel y la carne de peces, sobre todo salmónidos, aunque también en cultivos
de crustáceos, dorada, rodaballo y peces ornamentales (Johnson y An, 1991;
Lorenz y Cysewski, 2000).
En los últimos años el interés por este pigmento ha ido incrementándose
a medida que nuevos estudios le confieren nuevas propiedades y no sólo la
capacidad de pigmentación. La astaxantina tiene un elevado potencial como
antioxidante, inmunoregulador, anti-inflamatorio y agente anticarcinogénico
(Guerin et al., 2003; Shahidi et al., 1998). Influye también en la reproducción en
animales: en salmónidos es movilizada desde el músculo a los ovarios antes de
la puesta (Nakano et al., 1999; Bell et al., 2000). La carencia de este pigmento
en la dieta de las larvas de peces puede llevar a problemas en el desarrollo
larvario como sucede en larvas de “halibut” produciéndose una migración
anormal del ojo y una mala pigmentación (Rønnestad et al., 1998; Hamre et al.,
2002).
1.4. Microalgas
1.4.1. Algunas características de microalgas

Las algas son organismos pertenecientes al reino vegetal, que
comprenden un grupo muy diverso de organismos fotosintetizadores (Sur y
Whittick, 1987).
Se clasifican como talófitas, es decir, plantas inferiores, por presentar
una estructura simple no vascularizada con ausencia de raíz, tallo y hojas. Sus

estructuras reproductivas están desprotegidas (Critogamia), productoras de

esporas y desprovistas de semillas y flores (Lee, 1989).
Las microalgas tienen similitudes en muchos aspectos comunes con las
plantas superiores, como por ejemplo la composición de sus carbohidratos de
reservas, proteínas y pigmentos fotosintéticos. Tienen la clorofila "a" como sus
pigmentos fotosintéticos primario (Van Den Hoek et al., 1989). Otros tipos de
pigmentos, como los carotenoides (b-caroteno y fucoxantina), la ficocianina y
ficoeritrina presentan una distribución más limitada en las algas, que funcionan
como pigmentos accesorios (Sur y Whittick, 1987).
Las microalgas presentan una amplia distribución geográfica, se pueden
encontrar en prácticamente todas las condiciones ambientales de la Tierra,
desde los suelos fértiles hasta los desiertos fríos y calientes. Sin embargo, son
en los ambientes acuáticos, tanto marino y en aguas continentales, donde se
encuentra mayor prevalencia de microalgas (Lee, 1989).
El término microlaga no tiene ningún valor taxonómico, incluye
microorganismos algales con clorofila a y otros pigmentos fotosintéticos, son
capaces de realizar fotosíntesis oxígénica y, que para su caracterización
(sistemática) implica la consideración de una serie de criterios (Hoek et al.,
1995; Raven et al., 2001).
Como lo indica Tomasello (2004), las microalgas han sido
tradicionalmente clasificadas tomando en cuenta diversos criterios, tales como
los tipos de pigmentos, la naturaleza química de los productos de reserva y los
compuestos de la pared celular. Asimismo, otros aspectos han sido
considerados como criterios morfológicos y citológicos, como la aparición de
las células flageladas, la estructura de los flagelos, los procesos de formación
del núcleo en la división celular, la presencia y caracterización de envoltorio del
cloroplasto y la posible relación entre el retículo endoplasmático y la membrana
nuclear. Además de los criterios anteriormente mencionados, las técnicas de
biología molecular actuales se han utilizado para la clasificación de las
microalgas (Hu, 2004).
Bajo el nombre de microalgas se incluyen organismos con dos tipos de
estructura celular:
1. Microalgas que presentan una estructura celular procariota, representan
la división Cyanophyta (cianobacterias) y Prochlorophyta;

2. Microalgas que presentan una estructura celular eucariota, representan

la División Chlorophyta Euglenophyta, Rhodophyta, Prymnesiophyta
(Haptophyta, según Teixeira, 2002), Heterokontophyta
(Bacillariophyceae, Chrysophyceae, Xanthophyceae, etc), Cryptophyta y
Dinophyta de acuerdo a la clasificación de Hoek, Mann y Jahns (1995).
A pesar de las diferencias estructurales y morfológicas (Figura 5) entre

los representantes de cada división, son similares fisiológicamente y tienen un
metabolismo análogo al de las plantas (Abalde et al., 1995)
Figura 5. Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y marinas.
Las microalgas se encuentran principalmente en el medio marino, en

agua dulce y el suelo. Estos organismos son responsables de al menos el 60%
de la producción primaria de la Tierra (Chisti, 2004). De acuerdo con
Arredondo-Vega (1995), las microalgas (productores primarios) almacenan la
energía solar, convirtiéndola en energía biológica, siendo la biomasa microalgal
la base de muchas cadenas tróficas en los ambientes acuáticos. Los
constituyentes de este nivel trófico sintetizan nuevos materiales orgánicos a
partir de sustratos inorgánicos, tales como sales (nutrientes), CO2 y agua, y

esta energía biológica se utiliza en su parte como alimento para organismos

que constituyen el segundo nivel trófico (consumidores primarios), dando
continuidad a las cadenas tróficas acuáticas.
En los ambientes acuáticos, las microalgas son, al menos en parte del
ciclo de vida, el alimento principal de los animales fitófagos como algunas
especies de peces, moluscos (filtradores) y de crustáceos, por ejemplo.
Además, todos los organismos vivos (acuáticos y terrestres) dependen directa
o indirectamente, del oxígeno proveniente de la fotosíntesis realizada por las
microalgas para su respiración (Shelef y Soede, 1980).
Según Borowitzka (1999), las microalgas pueden ser cultivadas en
diferentes sistemas de cultivo, con volúmenes que van desde unos pocos litros
hasta miles de millones de litros. En general, los sistemas de producción son
poco sofisticados (Figura 6), ya que muchas empresas desarrollan sus cultivos
en sistemas de tanques abiertos con fondo de tierra y con escaso o nulo control
de los parámetros ambientales.
(b)
(a) (c)
(d) (e) (f)
Figura 6. Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo abierto. (b)

Bolsas. (c) Garrafones. (d) Estanques. (e) Fotobioreatores. (f) Carboy.
Recientemente, algunos cultivos se han desarrollado en los equipos

específicos, llamados fotobioreatores donde se pueden controlar los

parámetros ambientales y esto implica un aumento de la productividad, que

permite la producción de compuestos de alto valor comercial (Tredici, 2004).
Muchas de las sustancias sintetizadas y acumuladas por las microalgas
se encuentran también en las plantas, quienes evolucionaron a partir de las
microalgas verdes o Chlorophyceae (Raven et al., 2001). Sin embargo, según
Cohen (1986) y Richmond (1990a), la producción de microalgas puede ser
justificada por presentar diversas ventajas, dentro de las cuales pueden
destacarse las siguientes:
r Un cultivo de microalgas es un sistema biológico eficiente en el
aprovechamiento de la energía solar para la producción de materia
orgánica, donde muchas especies crecen más rápido que la plantas
terrestres, lo que facilita mayores rendimientos biomasa (mayor
productividad).
r Su naturaleza unicelular asegura una biomasa con la misma
composición bioquímica, como ocurre en las plantas terrestres, que
proporcionan compuestos localizados en partes específicas: en frutas,
hojas, semillas o raíces.
r Mediante la manipulación de las condiciones ambientales de cultivo (por
ejemplo luz, temperatura, nutrientes) muchas especies pueden ser
inducidas a sintetizar y acumular grandes concentraciones de proteínas,
carbohidratos, lípidos, etc. Estos compuestos tienen un alto valor
comercial, principalmente porque son productos naturales.
r Puede crecer bien en regiones con condiciones climáticas extremas. Los
cultivos se pueden desarrollar con agua marina o de estuarios, los
cuales pueden ser no convencionales empleado cultivos de plantas con
poco valor a la agricultura, o con el agua proveniente de diversos
procesos de producción (agrícola, industrial y de residuos domésticos,
por ejemplo).
r El ciclo de vida de la mayoría de las microalgas se completa en pocas
horas, lo que favorece la selección de cepas y al mejoramiento genético
de especies.
El número exacto de especies de microalgas aún se desconoce,

actualmente se encuentra información que puede haber entre 200,000 y varios

millones de individuos de este grupo. Esta diversidad también se refleja en la

composición bioquímica y, por tanto, las microalgas son una fuente de una
cantidad ilimitada de productos, como ácidos grasos poliinsaturados,
colorantes, enzimas etc. (Norton et al., 1996; Pulz y Bruto, 2004).
1.4.2. Aspectos de crecimiento de las microalgas

Tanto en el medio ambiente natural como en los cultivos, el crecimiento
de una población de microalgas es el resultado de la interacción entre los
factores biológicos, físicos y químicos (Raven, 1988). Los factores biológicos
están relacionados con su propio metabolismo de las especies cultivadas, así
como la posible influencia de otros organismos en el desarrollo microalgal. En
cuanto a los factores físico-químicos que afectan el crecimiento de las
microalgas, son principalmente reportados los estudios sobre la luz, la
temperatura, la salinidad y la disponibilidad de nutrientes (Lourenço et al.,
2002).
Según Gladue (1991), la mayoría de las especies microalgales son
fotoautotróficas, es decir, a través de la fotosíntesis obtiene energía de la luz
para fijar el carbono, necesario para la construcción de la biomasa. Así mismo,
la relación entre la síntesis del material orgánico como reflejo de la producción
fotosintética puede ser expresada principalmente por el aumento de la
población microalgal (Balech, 1977). La condición de la luz, que debe ser
considerada en términos de fotoperíodo (tiempo de exposición a la luz, o
fotoperíodo), la intensidad y la calidad (longitud de onda), es de fundamental
importancia para las microalgas (Dubinsky, 1990; Sánchez-Saavedra y
Voltolini, 1994). El hecho de que la luz varíe tanto en el espacio (profundidad y
latitud) y en el tiempo (diario y estacional), implica ser un factor condicionante
para el crecimiento planctónico.
Los pigmentos fotosintetisantes microalgales pueden ser clasificados en
tres grupos: la clorofila, los carotenoides y las ficobilinas, siendo que, cada uno
difiere en su composición química y presenta diferente capacidad de absorción
de la luz en una determinada longitud de onda (Ronda, 1983).
En cultivos fotoautotróficos, la cantidad energía luminosa recibida por el
sistema fotosintético afectará la cantidad de carbono que puede ser fijado,

determinando la producción de biomasa y la tasa de crecimiento de los cultivos

microalgales (Tzovenis et al., 2003).
Del mismo modo, otros diversos aspectos del metabolismo de las
microalgas son también influenciados por las condiciones luminosas. Según
Gunkel (1970), la cantidad, la calidad y la movilidad de los pigmentos
fotosintéticos, la distribución horizontal y vertical del fitoplancton en las masas
de agua y el tamaño y la morfología de las células, entre otros, están
correlacionan con las condiciones de luz, tanto cuantitativamente como
cualitativamente.
En cuanto a la nutrición, para un crecimiento óptimo, las microalgas
tienen la necesidad de una serie de nutrientes. Entre las especies, ocurren
muchas variaciones relacionadas principalmente con la cantidad de nutrientes
en el medio. Sin embargo, estas necesidades nutricionales dependen de
distintas condiciones ambientales (Abalde et al., 1995).
En cuanto a los nutrientes, las microalgas requieren C, N, O, H y P,
además de Ca, Mg, S y K. Como micronutrientes, por lo general requieren Fe,
Mn, Cu, Mo y Co, mientras que algunas microalgas también requieren bajas
concentraciones de vitaminas en el medio de cultivo (Guillard, 1975). Se sabe
que ciertas microalgas tienen necesidades específicas. Además de los factores
descritos anteriormente, otros pueden influir en el desarrollo de los cultivos
como el tamaño y la forma de los depósitos, el tamaño de las células (volumen
celular), la aireación de los cultivos, el pH, etc (Richmond, 1990).
1.4.3. Producción de compuestos de interés

Varias microalgas han sido estudiadas y algunas especies han sido
ampliamente utilizados en la acuicultura, en la alimentación humana y animal,
en la agricultura, en el tratamiento de aguas residuales, en la reducción de
dióxido de carbono de la atmósfera, en la sustitución de los combustibles
fósiles y en la obtención de muchos compuestos (Borowitzka, 1994; Molina
Grima et al., 1995, Shale, 2000, Richmond, 2004). Además de la consolidada
producción de microalgas para la obtención de biomasa, las investigaciones
relacionadas con el cultivo de microalgas aumentaran las perspectivas para la
producción de nuevos combustibles, biopolímeros, biofertilizantes, plaguicidas,
ácidos grasos y pigmentos, así como muchos otros compuestos bioactivos que

pueder ser utilizados en alimentos funcionales (Skulberg, 2000; Skulberg,

2004).
Las proteínas son los componentes esenciales de las microalgas y su
valor nutricional está determinado por el contenido y disponibilidad de los
aminoácidos que la constituyen.
Los lípidos típicos de las microalgas son los ésteres de glicerol y los
ácidos grasos que contengan un intervalo de carbono entre C12 y C20 (Romero,
1999). Otro hecho que despierta el interés en estos microorganismos son las
altas tazas de crecimiento, que establecen ventajas tecnológicas y comerciales
en comparación con las técnicas convencionales de producción de nutrientes
(Dufossé et al., 2005). La fracción lipídica de las microalgas puede contener
cantidades significativas de constituyentes de composición semejante a la de
aceites vegetales. El potencial de aplicación de los aceites extráidos de estos
microorganismos es muy amplio, pudiendo ser utilizados en la extracción de
ácidos grasos esenciales para la alimentación humana y para la industria en la
manufactura de surfactantes y cosméticos (Borowitzka y Borowitzka, 1988). Es
reconocido que las microalgas tienen la capacidad de sintetizar compuestos
nutracéuticos, como los ácidos grasos poli-insaturados (ácido araquidónico -
ARA, ácido eicosapentaenoico -EPA y ácido docosahexaenoico -DHA, por
ejemplo) y pigmentos carotenoides (astaxantina, b-caroteno, luteína y
cantaxantina, etc.) que presentan propiedades terapéuticas (Gill y Valivety,
1997; Ohshima, 1998; Tripathi et al., 1999).
Actualmente, las microalgas son comercializadas como alimentos
naturales ("health food") o como suplementos alimenticios y son encontradas
en polvo ("sun dried" o "spray-dried”), en forma de tabletas, cápsulas o
extractos. Las microalgas, son incorporadas en pastas, bocadillos, dulces,
bebidas, etc., tanto como suplemento nutricional y como colorante natural
(Becker, 2004; Coll et al., 2004; Pulz y Bruto, 2004).
1.5. Haematococcus pluvialis
1.5.1 Descripción de la especie H. pluvialis

Haematococcus pluvialis, también es conocido como Haematococcus
lacustris o Sphaerella lacustris. Es una microalga verde, unicelular, de agua

dulce, que en su clasificación taxonómica pertenece al Phylum Chlorophyta,

como se muestra en la Tabla 3 (Bold y Wynne, 1985).
El Phylum Chlorophyta incluye todas las algas con plástidos rodeados
por dos membranas, que contienen los pigmentos fotosintéticos clorofila a y b y
que forman estados flagelados de esporas o gametos. El principal producto de
almacenamiento de carbohidratos es el almidón (a-1,4-glucano) depositado
dentro del plástido.
Tabla 3. Clasificación Taxonómica de Haematococcus pluvialis.

PHYLLUM CHLOROPHYTA
CLASE CHLOROPHYCEAE
ORDEN VOLVOCALES
FAMILIA Haematococcaceae
GENERO Haematococcus
ESPECIE pluvialis
Las clorofitas, o algas verdes forman un grupo muy extenso, que se

considera como el más evolucionado entre las algas. Tienen características
que las distingue de las demás algas, y las acerca a los briofitos y las plantas
vasculares, como por ejemplo la composición de los polisacáridos que
producen, o la presencia de las clorofilas a y b. El Phylum engloba varias
clases, subdivididas en unos 500 géneros y 8000 especies. Sus características
principales son las siguientes:
1. Aunque algunas son macroscópicas, la mayoría son microscópicas.
Muchas son planctónicas, y viven suspendidas en el medio como
organismos unicelulares aislados o agrupados en colonias, o en forma
unicelular. Otras son bentónicas, y pueden ser epilíticas o perifíticas.
2. Las células pueden realizar movimientos fototácticos, mediante
secreción de mucílagos o por la presencia de flagelos (zoidios). Las
células flageladas son isocontas, esto es, tienen los flagelos con
estructuras iguales pero que difieren en su longitud. Normalmente hay
dos flagelos por cada célula.
3. En los cloroplastos coexisten varios pigmentos, además de las clorofilas,

xantofilas, luteína y zeaxantina. Pero estos pigmentos no enmascaran a

la clorofila, por lo que el color predominante es el que les da el nombre
de algas verdes.
4. En algunos casos las células tiene pirenoides, que se encuentran dentro
del cloroplasto, y a menudo penetrados por los tilacoides.
5. Las reservas de polisacáridos de las células están en forma de gránulos
que pueden encontrarse alrededor del pirenoide, cuando lo hay, o
dispersos en el estroma del cloroplasto, pero no libres en el citoplasma
como ocurre en las demás algas.
6. Su pared celular está compuesta, principalmente, de celulosa.
7. La mayoría son de agua dulce, pero las hay también terrestres y
marinas.
1.5.2. Morfología, estructura y fisiología de H. pluvialis

Como se muestra en la Figura 7 el ciclo de vida típico de H. pluvialis. En
condiciones favorables, los cultivos de esta microalga se componen
generalmente de células vegetativas flageladas junto con células vegetativas
en reposo.
Las células flageladas son esféricas o elipsoidales con dos flagelos de
igual longitud que salen de un extremo anterior. Las células contienen un único
cloroplasto en forma de copa con varios pirenoides.
En los cultivos líquidos, las células biflageladas (zooesporas) poseen un
pared delgada, separada de la plasmalema por un gran espacio, que es
atravesado por finas hebras citoplasmáticas que puede verse seccionadas
longitudinalmente, transversalmente u oblicuamente (Santos y Mesquita, 1984).
En este estado, las células persisten y poseen clorofila a, b y los carotenoides
primarios que normalmente se encuentran en las Clorofitas y en los
cloroplastos de las plantas superiores, tales como b-caroteno, luteína,
violaxantina, neoxantina y zeaxantina (Harker et al., 1996).
Las células flageladas móviles dejan de dividirse después de unas cinco
duplicaciones celulares. Poco después las zooesporas dejan de dividirse,
ocurre la fusión celular, y dentro de las próximas 50 horas, el contenido de ADN
de la mayoría de las células se duplica (Lee y Ding, 1994). A continuación, las
células pierden sus flagelos y se convierten en una forma esférica no móvil.

Las células no móviles muestran una pared celular gruesa, debajo de

esta pared, un espacio pequeño periplásmico, con una electro-densidad
variable y limitado internamente por una plasmalema bastante sinuosa.
Las otras características ultra-estructurales del protoplasma son
similares a las células móviles, pero no hay estigma ni vacuolas contráctiles
(Santos y Mesquita, 1984).
Cuando las condiciones ambientales llegan a ser adversas (privación de
nutrientes, alta irradiancia de luz o alta salinidad) las células sufren cambios
morfológicos, fisiológicos y en las características fotosintéticas, resultando así
la formación de grandes aplanósporas rojas resistentes a las condiciones
ambientales extremas (Boussia y Vonshak, 1991).
Durante la transformación, las células microalgales (ligeramente
redondeadas), pierden sus flagelos, haciéndose células enquistadas inmóviles.
A continuación, se forma una vaina trilaminar resistente a la acetólisis y se
genera una pared secundaria de este material base y engrosada, coincidiendo
con una expansión del volumen celular (Montsant et al., 2001; Hagen et al.,
2002). Entonces se comienza a producir carotenoides secundarios tales como
cantaxantina, echinenone y en particular, del pigmento rojo astaxantina seguido
de una disminución de clorofilas y carotenoides primarios (Harker et al., 1996).
Los microscopios de luz y electrónicos han revelado que, en las células
móviles, aparecen las primeras esferas pequeñas de inclusiones de
astaxantina (limitadas cada una de ellas con una biomembrana no verdadera)
en el citoplasma perinuclear, los gránulos del pigmento no se encuentran
dentro de ningún orgánelo o vesícula (Santos y Mesquita, 1984). En los quistes
que están madurando el número de depósitos de pigmento aumenta y toman
una variedad de formas. La unión de los gránulos globulares depende del
incremento de las cantidades de astaxantina formada y de las edades de las
células.
En las células maduras enquistadas el citoplasma están casi
uniformemente rojas con reducidas cantidades de pigmentos en los
cloroplastos. La astaxantina se dispersa hacia la periferia de las células de
Haematococcus bajo la inducción de luz y se mueve hacia el centro después
que se interrumpe la iluminación (Yong y Lee, 1991).
Sin embargo, este proceso es reversible, es decir, cuando los quistes

maduros se transfieren a un medio fresco y se exponen a una baja de luz, las

células hijas intracelulares se liberan de las células enquistadas maduras
dentro del medio, y las células vegetativas se regeneran de las células hijas. La
germinación coincide con la clorofila y síntesis de proteínas, y la degradación
de carotenoides (Fabregas et al., 2003).
d
f
Figura 7. Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Célula vegetativa

flagelada. b. Célula vegetativa sin flagelos. c. Palmella. d y f. Aplanóspora.
1.5.3. Presencia y distribución de Haematococcus pluvialis

H. pluvialis se distribuye ampliamente y ha sido aislada en Europa, África
y en América del Norte, a partir de cortezas secas de piedra, en los depósitos
de agua en los acantilados, en los musgos de los estanques e incluso en una
fuente (Figura 8) de agua bendita en el patio de una iglesia de Zúrich
(Pringsheim, 1966). Algunas especies fueron recolectadas dos veces por lo
menos en Minnesota (U. S), pero no han sido estudiados los cultivos
(Thompson y Wujek, 1989).
Este género también se encuentra muy extendido en Canadá,
incluyendo British Columbia (Stein y Borden, 1979), Nunavut (Sheath y
Steinman, 1982), Ontario (Duthie y Socha, 1976), en Europa: Gran bretaña
(Pentecost 2002), Alemania (Toepel et al., 2005), Portugal (Sociedad Española

de Ficología, 2008), Rumania (Caraus, 2002), España (Alvarez y Cobelas,

1982, Aboal, 1988b, Sociedad Española de Ficología, 2008); Suramérica:
Argentina (Damiani et al., 2006); Asia: China (Hu y Wei, 2006) y en las Islas del
Pacífico: Islas en Hawai (Sherwood, 2004). H. pluviales también ha sido
reportado en México (Ortega, 1984).
(a) (b)
Figura 8. Haematococcus pluvialis. (a) Depósito de agua estancada en los

Montes Pirineo, España. (b) Pileta con agua estancada.
La extensa presencia de Haematococcus en cuerpos de agua

temporales y no en permanentes se debe, en parte, al hecho de que en esos
depósitos, están comúnmente libres de la competencia de otras microalgas, y
no a ninguna característica inherente de los depósitos de agua.
Haematococcus pluvialis se puede adaptar bastante bien para sobrevivir en
condiciones extremas y en las fluctuaciones luz, de temperatura, concentración
de sales, que muchas otras microalgas, debido a su capacidad de enquistarse
de manera rápida (Proctor, 1957). Pringsheim (1966) sugiere que H. pluvialis
se distribuyó como quistes secos por el viento, de lo contrario no podría
alcanzar la mayoría de las localidades donde se ha encontrado.
1.5.4. Composición química de Haematococcus pluvialis

La composición general de esta microalga consiste comúnmente en
carotenoides, ácidos grasos, proteínas, carbohidratos y minerales.
Tabla 4. Compuestos comúnmente presentes en H. pluvialis.
Compuestos Mínimo Máximo Media

Proteínas (%) 17.30 27.16 23.62

Carbohidratos (%) 36.9 40.0 38.0
Grasas (%) 7.14 21.22 13.80
Fierro (%) 0.14 1.0 0.73
Humedad (%) 3.0 9.0 6.0
Magnesio (%) 0.85 1.4 1.14
Calcio (%) 0.93 3.3 1.58
Biotina (mg/lb) 0.108 0.665 0.337
L-carnitina (ug/g) 7 12 7.5
Ácido fólico (mg/100g) 0.936 1.48 1.30
Niacina (mg/lb) 20.2 35.2 29.8
Ácido pantoténico 2.80 10.57 6.14
Vitamina B1 (mg/lb) <0.050 4.81 2.17
Vitamina B2 (mg/lb) 5.17 9.36 7.67
Vitamina B6 (mg/lb) 0.659 4.5 1.63
Vitamina B12 (mg/lb) 0.381 0.912 0.549
Vitamina BC (mg/lb) 6.42 82.7 38.86
Vitamina BE (IU/lb) 58.4 333 186.1
Cenizas (%) 11.07 24.47 17.71
NatuRose™ Technical Bulletin # 060.
Tabla 5. Perfil de aminoácidos en H. pluvialis.
Valor mínimo Valor máximo Valor medio

Aminoácidos
(%) (%) (%)
Triptófano 0.05 0.56 0.31
Ácido aspartico 1.37 2.31 1.89
Treonina 0.78 1.24 1.04
Serina 0.73 1.06 0.94
Ácido glutamico 1.70 2.39 2.19
Prolina 0.69 1.00 0.89
Glicina 0.84 1.32 1.17
Alanina 1.30 1.92 1.73
Cisteína 0.16 0.21 0.19
Valina 0.83 1.94 1.36

Metionina 0.32 0.43 0.40

Isoleucina 0.55 0.97 0.79
Leucina 1.21 1.84 1.67
Tirosina 0.40 0.63 0.52
Fenilalanina 0.61 1.05 0.90
Histidina 0.48 0.76 0.61
Lisina 0.75 1.32 1.13
Arginina 0.81 1.34 1.07
Tabla 6. Ácidos grasos encontrados en la microalga H. pluvialis.

Media Mínimo Máximo
Ácidos grasos
(%) (%) (%)
C12:0 Laurico <0.01 <0.005 0.01
C14:0 Miristico 0.07 0.04 0.10
C16:0 Palmítico 3.82 2.078 6.15
C16:1 Palmitoleico 0.08 0.02 0.17
C17:0 Margarico 0.03 0.01 0.03
C17:1 Margaroleico 0.17 0.09 0.23
C18:0 Estearico 0.27 0.14 0.46
C18:1 Oleico 3.41 1.66 5.31
C18:2 Linoleico 2.74 1.44 4.40
C18:3 Linolenico 1.47 0.86 2.11
C18:3 gamma linolenico omega 6 0.21 0.09 0.29
C18:4 Octadecatetraenoico 0.19 0.09 0.25
C20:0 Arachidico 0.08 0.04 0.12
C20:1 Gadoleico 0.04 0.01 0.08
C20:2 Eicosatrienoico 0.16 0.06 0.21
C20:3 Gama Eicosatrienoico 0.06 0.02 0.09
C20:4 Arachidonico 0.18 0.082 0.31
C20:5 Eicosapentaenoico omega 3 0.08 0.031 0.180.
C22:0 Behenico 0.05 0.02 0.08
C24:0 Lignocerico 0.03 0.013 0.05

1.5.5. Aplicaciones de Haematococcus pluvialis

La microalga H. pluvialis representa la más rica fuente natural de astaxantina,
y ahora es cultivado a gran escala (Olaizola 2000; Olaizola y Huntley, 2003). El
contenido de astaxantina en esta microalga puede superar el 4% de peso seco,
este valor es por ahora el más alto reportado para cualquier microorganismos,
incluyendo bacterias, hongos y otras microalgas (Boussiba 2000). La
astaxantina es una xantofila de fuerte actividad antioxidante, diez veces
superior que el b-caroteno y más de 500 veces más efectivo que el a-tocoferol,
la astaxantina se ha propuesto como la supervitamina E (Jyonouchi et
al.,1994). La dosis diaria recomendada es de 4 mg (Odeberg et al., 2003).
Hematococcus contiene principalmente mono-ésteres de astaxantina ligados a
ácidos grasos 16:0, 18:0, 18:2 y 18:1 (Restrøm et al., 1981a), teniendo los no
esterificados, los mono y di-ésteres una configuración pura (3S, 3´S) (Grung et
al., 1992). Sin embargo, esta microalga exhibe ciertas características
desfavorables para su cultivo, tales como tasa lenta de crecimiento y ciclo de
vida complejo, en comparación con otras microalgas exitosamente cultivadas a
escala comercial, como la Dunaliella spp. y la Spirulina spp. (Cifuentes et al.,
2003).
El interés en la producción y comercialización de astaxantina microalgal
para el consumo humano también ha aumentado, la inminente aprobación de la
U. S. Food and Drug Administration (FDA) para su uso como ingrediente en
suplementos dietéticos, y para su aprobación en varios países europeos
(Cysewski y Lorenz, 2004).
El mayor mercado para la astaxantina ha sido la acuicultura, donde es
especialmente utilizado para el color rojizo a la carne del salmón cultivado
(Tripathi et al., 1999). La astaxantina se vende a US$2500 por kg con un
mercado mundial anual estimado en US$200 millones (Lorenz y Cysewski,
2000). En el mercado, los productos se encuentran en forma de concentrados
en polvo, liofilizados o biomasa deshidratada, o bien como extracto de aceite
vegetal. Aunque el 95% de este mercado consume derivados de astaxantina
sintética, la demanda de los consumidores por los productos naturales hacen
que los pigmentos sintéticos sean mucho menos deseable y proporciona una
oportunidad para la producción de astaxantina por H. pluvialis.

1.5.5. Medios de cultivo

La microalga H. pluvialis tiene una tasa de crecimiento baja lo que
constituye uno de los principales problemas para su producción a gran escala.
Los medios de cultivo usados de manera habitual para su cultivo han sido
adaptados de los empleados para otras microalgas, para bacterias o incluso
una mezcla de ambos y no han sido diseñados para soportar altos
crecimientos. Este problema ha provocado que se haya realizado un esfuerzo
importante en el desarrollo de un medio de cultivo adecuado a los
requerimientos propios de esta microalga (Gong y Chen, 1997; Pringshe, 1966;
Sarada et al., 2002). La mayoría de estos trabajos se realizaron en condiciones
de cultivo discontinuo o “batch” y se han optimizado sólo algunos componentes
del medio.
cultivo para evaluar los pigmentos obtenidos de la microalga Haematococcus
pluvialis ya que en los últimos años, este organismo ha sido considerado como
una posible fuente natural para la producción de astaxantina.

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA JUSTIFICACIÓN
CAPÍTULO 2 JUSTIFICACIÓN
En la centuria de 1900 el reino vegetal y animal proveía todos los

materiales colorantes para la industria textil, cosmética, pinturas y alimentos.
Este patrón comenzó a cambiar muy rápidamente seguido por el
descubrimiento de los colorantes sintéticos. El impacto inicial fue sentido en la
industria textil para los colorantes naturales los cuales perdieron su mercado.
Progresivamente una amplia variedad de colorantes sintéticos fueron
manufacturados y éstos desplazaron a muchos de los colorantes para
alimentos y cosméticos que se venían utilizando ya que éstos fueron
comparativamente más baratos, mayor consistencia en la calidad, mejor
facilidad de obtención, mejores atributos de calidad y estabilidad superior en
sistemas alimentarios.
Hoy en día el sector alimentario, está experimentando un regreso al
mercado de colorantes naturales, éste cambio no ha sido manejado
directamente por la industria alimentaria sino por los consumidores de países
desarrollados, los cuales están informados y preocupados sobre posibles
riesgos a su salud asociados con aditivos alimentarios sintéticos.
El interés por los alimentos funcionales es cada vez mayor, dado que
éstos, además de satisfacer las necesidades energéticas y nutricionales
básicas, son capaces de aportar beneficios adicionales a nuestra salud.
Además, existe una tendencia entre los consumidores dirigida hacia la ingesta
de productos procedentes de fuentes naturales en contraposición a los
obtenidos de forma sintética.
Actualmente, el número de ventajas de los pigmentos naturales sobre
los sintéticos han aumentado debido a las propiedades farmacológicas que se
han descubierto de los pigmentos naturales. Además, algunos productos han
tenido un gran valor en el mercado porque en la fabricación de éstos se ocupan
solo pigmentos naturales. Sin embargo, es necesario señalar que los
colorantes sintéticos han tenido ventajas bien conocidas como el alto poder
pigmentante, la estabilidad, el almacenamiento, la facilidad del procesamiento y
además son más baratos y están disponibles en cantidades ilimitadas (Wissgot
y Bortlik, 1996).

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA JUSTIFICACIÓN
De acuerdo a datos registrados por el Banco Nacional de Comercio

Exterior (BANCOMEXT, 2006), el volumen de las importaciones a México de
materiales colorantes de origen animal y vegetal aumentaron de 2000 a 2006
en un 61.96%, de 324.5 ton a 1382.190 ton. Por otro lado las exportaciones
bajaron en un 32% (4,481,786 ton en 2000 a 2008, 2,283.037 ton en 2008).
El aumento en las importaciones y la baja en las exportaciones de
materiales colorantes naturales, demuestra la necesidad de buscar nuevas
fuentes alternativas de colorantes de origen natural, así como mejorar y
optimizar los procesos existentes que reduzcan los costos actuales y ser más
competitivos en el mercado internacional.
Las microalgas se consideran como alimentos funcionales, capaces no
sólo de elevar el contenido nutricional de los alimentos tradicionales, sino
también de afectar positivamente la salud de animales y humanos. Poseen
cantidades apreciables de carbohidratos, lípidos, vitaminas, minerales, ácidos
grasos poliinsaturados (omega–3 y omega–6) y antioxidantes (carotenos).
Algunas tienen, incluso, un contenido de aminoácidos superior al presentado
por alimentos convencionales (Méndez, 2003; Abalde et al., 1996; Visentainer,
et al., 2005).
cultivo para evaluar los pigmentos obtenidos de la microalga Haematococcus
pluvialis considerando la hipótesis de que la fuente de nutrientes puede originar
cambios en el crecimiento, contenido de pigmentos y actividad antimicrobiana.
.

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA OBJETIVOS
CAPÍTULO 3 OBJETIVOS
Objetivo general:
Evaluar los pigmentos obtenidos de la microalaga Haematococcus pluvialis

(Chlorophyta:Volvocales) cultivada en diferentes medios.
Objetivos específicos:
1) Validar las técnicas operativas de crecimiento de Haematococcus

pluvialis e inducción de pigmentos utilizando varios medios de cultivo.
2) Determinar la composición de cenizas, lípidos, carbohidratos, humedad

y nitrógeno proteico de la microalga seca de Haematococcus pluvialis
mediante un análisis químico proximal.
3) Obtener extractos orgánicos totales utilizando disolventes de diferente

polaridad y variando el protocolo de extracción.
4) Evaluar el almacenamiento y la estabilidad de la biomasa seca y de los

extractos orgánicos totales.
5) Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos orgánicos totales

de H. pluvialis sobre bacterias gram positivas, gram negativas y un
hongo levaduriforme.
6) Aislar y caracterizar los pigmentos obtenidos mediante cromatografía y

espectroscopía UV-Vis

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA MATERIALES Y MÉTODOS
CAPÍTULO 4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Organismo
La cepa Haematococcus pluviales con clave Hamp-1r se obtuvo del

cepario del Laboratorio de Biotecnología de Microalgas de la Universidad del
Mar, campus Puerto Ángel. Esta cepa es conservada en el medio de cultivo f/2
(Guillard y Ryther, 1962) a 28oC como se observa en la figura 9.
(b)
(a)
Figura 9. Conservación de H. pluvialis con clave Hamp-1r. (a) en agar y (b) en

medio líquido.
4.2. Pruebas preliminares
La microalga fue cultivada en 5 medios de cultivo diferentes y en 3

condiciones diferentes (figura 10).
1)
2)
3)
Figura 10. Pruebas preliminares de cultivo de H. pluvialis.

Los medios de cultivos utilizados fueron BBM, BG-11, f/2, f/2 sin fosfatos
y un fertilizante foliar (QF). Las condiciones de cultivo, fueron las siguientes las
que se describen en la tabla 7.
Tabla 7. Parámetros para las diferentes condiciones preliminarios de los

cultivos de la microalga.
T (oC) Luz (ft∙cd) pH· Agitación
Condición 1 28 110 7.5 Manual
Condición 2 28 420 7.5 Manual
Condición 3 28 230 7.5 Mecánica
Todos estos experimentos se hicieron por quintuplicado, utilizando

tubos, matraces erlenmeyer de 250 y 500 mL. Se ocuparon 2 inóculos de
Haematococcus pluviales uno en su forma vegetativa con flagelos y otro en su
forma de quiste.
Cada dos días se tomaban muestras de la microalga para verlas al
microscopio y observar los cambios morfológicos.
4. 3. Condiciones de cultivo
Se utilizaron cepas de H. pluviales en su forma de quiste. En la Tabla 9

se describe la composición química de los medios de cultivo empleados.
La irradiancia fluctúo entre 4541.03 lux a 3766.26 lux. La agitación fue
manual. Se utilizaron matraces erlenmeyer de 500 mL. Se le adicionó 350 mL
de medio de cultivo y 17.5 mL de inóculo. Todos los experimentos se realizaron
por quintuplicado. En la tabla 8 se detallan las condiciones iniciales de cultivo.
Tabla 8. Condiciones iniciales de los medios de cultivo para H. pluvialis.

Variables fisioquímicas f/2* Fertilizante foliar
pH 8.37 8.42
Conductividad eléctrica (mV) 142.1 142.1
Concentración de inóculo (cel/mL) 8250 21000
*(Guillard y Ryther, 1962)

Tabla 9. Composición química de los medios de cultivo f/2 (Guillard y Ryther,

1962) y del Fertilizante foliar (QF).
Constituyentes BBM BG-11 f/2* f/2 Fertilizante**
[g/L] [g/L] [g/L] [g/L] [g/L]
NaNO3 1.0 1.5 - 0.075 -
Nitrógeno nítrico - - - - 6x10-3
Nitrógeno amoniacal - - - - 2.4x10-3
Nitrógeno orgánico - - - - 2.16x10-2
Fósforo Asimilable - - - - 1.2x10-2
NaH2PO4●4H2O - - - 0.05 -
KH2PO4 0.025 0.036 - - (K2O) 2.1x10-2
MgSO4●7H2O - - - - (MgO) 6x10-5
EDTA 0.075 0.075 9.36x10-5 9.36x10-5 -
FeCl3●6H2O 0.075 0.4 3.15x10-5 3.15x10-5 (Fe) 3x10-5
NaMoO4 0.0175 - 6.3x10-6 6.3x10-6 (Mo) 1.2x10-6
ZnSO4●7H2O - - 2.2x10-5 2.2x10-5 (Zn) 9x10-6
MnCl2●4H2O 0.025 - 1.8x10-4 1.8x10-4 (Mn) 3x10-6
CuSO4●5H2O - 0.001 9.8x10-6 9.8x10-6 (Cu) 6x10-6
H3BO4 - 0.006 - - (B) 4.5x10-6
CoCl3 - 0.2 1x10-5 1x10-5 (Co) 6x10-6
Vitaminas*** 0.005 - 1x10-5 1x10-5 -
*Sin Nitrógeno. **Foliar. ***Solución comercial.
4.4. Recuento celular
Después de inocular los matraces, se lleva el registro de crecimiento

para identificar la etapa de mayor densidad de las microalgas (fase
exponencial) la cual indica el momento apropiado para cosecharlas. Esta etapa
también indica que el cultivo debe transferirse a un volumen mayor de medio
de cultivo o diluirse si el recipiente tiene volumen disponible. Para determinar la
densidad celular cada muestra fue fijada con lugol al 5%. Los conteos se
hicieron empleando una cámara Neubauer estándar de 0.1 mm de altura y 1
mm2 de área. Se hicieron las lecturas en un microscopio óptico Olympus

®
BX51. También se hizo una descripción de la microalga Haematococcus
pluvialis mediante la aobservación de sus célula a través de varios
®
microscopios como el Microscopio Carl Zeis modelo Estándar 25
(esteroescópico), Leica®Zoom 2000 (contraste de fases) y Olympus ®BX51. Las
imágenes de las células fueron capturadas por un dispositivo acoplado a una
cámara fotográfica.
4.4.1. Densidad celular

Con la cámara Neubauer estándar (Hematocímetro) de 0.1 mm de altura
y 1 mm2 de área, la densidad de microalgas se calcularon de acuerdo a la
siguiente relación:
2 = F + F. D. + M × C × 10 × 1000 Cel/mL
Donde:
D= densidad del cultivo.
F= fijador (mL).
F. D.= Factor de dilución (mL).
Vf
î. 2 =
vi
Vf= volumen final de la muestra diluida (mL).
vi= volumen inicial de la muestra r (mL).
M= Mililitros de muestra utilizados.
C= número de células promedio contadas.
10= factor de multiplicación debido a la profundidad del hematocímetro.
1000= factor de conversión a mililitros.
4.4.2 Parámetros Poblacionales

Los principales parámetros poblacionales del crecimiento de un cultivo
de células se calcularon con las siguientes ecuaciones:
1.- Las divisiones por día (k) se calcularon de acuerdo a Guillard (1973):
3.322 N2
= × log
T2 − T1 N1
Donde:
3.322= Factor de conversión del logaritmo base 2 a base 10.

N1= Concentración celular al tiempo T1.

N2.= Concentración celular al tiempo T2.
2.- La tasa de crecimiento específico (m) estimada como lo recomienda E. P. A.

(1971) para ensayos con microalgas:
N2
log N1
= día
T2 − T1
3.- El tiempo de generación (Tg) se determina como lo recomienda Eppley y

Strickland (1968):
log2 T2 − T1 log2
r. = =
logN2 − logN1 k
4.- La producción diaria de microalgas se valora según De la Cruz y Alfonso,

1975:
N2 − N1
. 2. =
T2 − T1
4.5. Cosecha y secado de la biomasa
Las células microalgales fueron separadas del medio de cultivo por

centrifugación (3500 rpm durante 5 min a 5oC) y se secaron en una estufa de
vacio LABLINE a 80°C por 24 horas.
4.6. Análisis Químico proximal
Porciones de microalgas secas fueron molidas en un mortero para la

determinación del análisis químico proximal, el cual se realizó por los métodos
oficiales AOAC (1997), en donde se evaluó el contenido de Humedad (925.10),
ceniza (923.03), lípidos totales y Nitrógeno proteico total (979.09).
El contenido de carbohidratos se estimó por el método de fenol-sulfúrico
(Dubois et al., 1956). En todos los casos, las determinaciones se realizaron por
quintuplicado.

4.7. Extracción
Para evitar foto-descomposición de los pigmentos, este proceso se llevó

a cabo en ambiente oscuro iluminado con luz roja (700 nm). Todas las
extracciones se repitieron hasta que el color de la biomasa se agotase por los
disolventes de extracción. Todos los experimentos fueron realizados por
quintuplicado. Los extractos obtenidos se almacenaron en frascos ámbar a 4°C
hasta su posterior análisis.
4.7.1. Biomasa húmeda

Se tomaron 5 mL de cultivo y se agregó a un tubo de centrífuga de 15
mL de capacidad. Luego se centrifugó a 3500 rpm a 5oC durante 5 min
utilizando una centrifuga (Universal 32R Hettich Zentrifugen®). Los pigmentos
se extrajeron del botón celular mediante la adición de 10 mL de acetona 100%.
Se agitó vigorosamente en un vortex durante 30 seg. Se procedió a congelar la
disolución a -20oC durante 2 horas. Los extractos, por quintuplicado, se
clarificaron mediante centrifugación y se procedió a medir la absorbancia de las
muestras en un Espectrofotómetro de UV-Vis (Marca VARIAN. Modelo cary 50,
USA).
4.7.2. Biomasa seca

Después del secado de la microalga, se realizo una ruptura celular
mediante congelamiento de la biomasa a -40oC durante 20 minutos, seguido de
una molienda con un mortero. Se probaron tres diferentes métodos de
extracción.
4.7.2.1. Método HCl 4N-Acetona

La extracción y determinación del contenido total de pigmentos en las
muestras en estudio se realizó por el método descrito por Sarada et al., (2006),
quienes propusieron un método mejorado para la extracción de astaxantina de
H. pluvialis. Este método se basa en la adición de unas gotas de HCl 4N a
70oC para facilitar la extracción, y se logra hasta un 90% de la extracción del
pigmento sin homogeneizar. Se pesaron, 100 mg de microalga y se añadieron
10 gotas de HCl 4N (PerkinElmer) y 3 perlas de ebullición (sigma, 425-600

micras) a un tubo falcón cónico de plástico. Se mezcló vigorosamente en un

agitador vortex durante 30 seg. A continuación se incubó en un baño maría a
70oC durante 2 minutos y se homogeneizó nuevamente en el vortex. Después
se le adicionó al material celular 5 mL de acetona (Merck) al 100%. La
suspensión fue homogeneizada en un agitador vortex y se sometió a
centrifugación (3500 rpm por 5 minutos). El sobrenadante se colectó en un
matraz balón para después concentrarlo en un rotavapor. Este procedimiento
se repitió hasta la extracción exhaustiva de los pigmentos, lo cual fue
confirmada mediante una exploración espectrofotométrica UV-Vis.
4.7.2.2. Método Acetona 100%

Se pesaron 100 mg de microalga, se añadieron 5 mL de acetona 100%
conjuntamente con 3 perlas de ebullición de vidrio (sigma, 425-600 micras) a
un tubo de centrifuga cónico de 50 mL. La suspensión fue homogeneizada en
un agitador vortex y se sometieron a una centrifugación de 3500 rpm por 5 min.
Los sobrenadantes fueron colectados, en un matraz balón para su posterior
concentración en un rotavapor. Este procedimiento descrito se repitió con el fin
de extraer exhaustivamente los pigmentos de la biomasa seca. La confirmación
de la ausencia de estos compuestos en las muestras fue realizado mediante
una la exploración espectrofotométrica UV-Vis, se consideró finalizado el
procedimiento cuando los valores en la absorbancia fueran inferiores a 0.05
unidades.
4.7.2.3. Método DMSO

A 100 mg de muestra se le añadieron 2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO)
(Merck) y 3 perlas de ebullición de vidrio en un tubo falcón de plástico con
capacidad de 50 ml. Se incubo este material en un baño maría a una
temperatura de 50oC por 30 min., seguido de una rigurosa agitación en el
vortex durante 15 segundos cada 10 min. Posteriormente, el material fue
centrifugado (3500 rpm por 5 min.), se recupero el sobrenadante y se repitió el
proceso de extracción hasta agotamiento.
4.8. Determinación de pigmentos

Para la cuantificación del contenido total de pigmentos se utilizaron los

siguientes métodos:
1. Fórmulas. Las concentraciones de clorofila a, b, carotenoides totales y
astaxantina se determinaron mediante las fórmulas propuestas por
Lichtentaler and Wellburn, (1985).
2.
ߒe Ėa euu = 11.75∎ A>>Þ − 2.350∎ A>50
ߒe Ėa eu = 18.61∎ A>50 − 3.960∎ A>>Þ
81.4C
r ue 1'uĖ 1 a =1 1000 ∙ A5 − 2.270C −
227
3. Patrones de referencia. El contenido de carotenoides totales se

estableció a partir de la concentración de los extractos la cual se obtuvo
de la curva de calibración (absorbancia, Y, en función de la
concentración X expresada en mg/L), elaborada con soluciones
preparadas con b-caroteno (Y= , Astaxantina, Clorofila a y Xantofila. A
todas las soluciones estándares se les determinó el espectro de
absorción visible. Las determinaciones se realizaron por quintuplicado y
los contenidos de pigmentos se expresaron como valores promedios
para cada medio de cultivo.
4.9. Evaluación del almacenamiento y estabilidad de la biomasa

seca y extractos totales
La biomasa seca de H. pluvialis se mantuvo durante 1.5 años bajo las

siguientes condiciones: A temperatura ambiente bajo a la exposición a la luz; a
temperatura ambiente en la oscuridad; congelado a -20oC en la oscuridad; con
antioxidante (0,01% de ácido ascórbico) a temperatura ambiente en la
oscuridad; en una estufa de vacio (P˂0.04 atm).
Los extractos acetónicos de los pigmentos carotenoides, fueron
mantenidos en las mismas condiciones de almacenamiento antes mencionadas
durante 6 meses.

También se hizo un estudio parcial de la estabilidad ante la luz,

ensayándose la estabilidad en exposición a la luz solar, a la luz UV-vis y la
oscuridad.
4.10. Separación e identificación de los pigmentos
Para todos los análisis cromatográficos se utilizo el pigmento seco,

extraído de la microalga Haematococcus pluvialis.
4.10.1. Cromatografía en capa fina

La cromatrografía en placa fina se realizó en la oscuridad sobre una
placa de gel de sílice de aluminio (Sigma-Aldrich Z19329-1) probando
diferentes disolventes de diversa polaridad como eluyentes. La mezcla que
logró mejores separaciones fue hexano:acetona (7:3). El revelado de las placas
se realizó utilizando una lámpara UV (Upland, USA) y vapores de yodo o ácido
sulfúrico al 10%. La identificación de los carotenoides purificados se llevó a
cabo utilizando los patrones de referencia ya antes mencionados y por un
análisis espectrofotómetrico UV-vis.
4.10.2. Cromatografía en columna

Se emplearon columnas de vidrio de 2 cm de diámetro y 25 cm de altura,
empacadas con gel de sílice 60 (malla 60 y 0.040-063 mm. Cromatografía en
columna Merck 1.09385.1000), y con 120 mL de hexano. El extracto se colocó
en un vaso de precipitado y se disolvió en hexano. El pigmento se agregó a la
columna formando una capa delgada uniforme, eluyendo inicialmente hexano
100%. Se obtuvieron fracciones de 6-10 mL en frascos trasparentes forrados
con papel aluminio de 30 mL, que fueron concentrados en el rotavapor a
sequedad, para su posterior estudio. Las fracciones obtenidas de la separación
de los pigmentos por cromatografía en columna se analizaron por HPLC.
4.10.3. Cromatografía liquida de alta resolución

El contenido de carotenoides y astaxantina de los extractos obtenidos
fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución Un dispositivo

HPLC (bomba LC de Perkin Elmer, serie 200, Nor walk CT 06859, USA)
utilizando una columna C18 de fase inversa (Supelco, 25 cm de 4,6 mm). Los
disolventes empleados fueron (A) acetona y (B) una mezcla de metanol:agua
(9:1 v/v). La velocidad de flujo fue de 1.25 mL/min. La separación de los
carotenoides se logró mediante un gradiente entre los disolventes A y B
durante 40 minutos de la siguiente manera: El disolvente B, se eluyo de 80 a un
20% durante 25 min, 20% para 10 minutos, y de 20 a 80% durante 5 min. La
separación de los carotenoides y los ésteres de astaxantina fueron
identificados mediante un detector de matriz de fotodiodos (Brinda et al., 2004).
Los picos fueron integrados a 477 nm para cuantificación de la astaxantina libre
y los ésteres de astaxantina. Fueron utilizados estándares de b caroteno, y la
astaxantina (Sigma) para la identificación y cuantificación de los pigmentos.
4.11. Bioensayo antimicrobiano
4.11.1. Prueba de Susceptibilidad

La técnica de difusión en agar también conocida como de difusión en
disco, antíbiograma o "Kirby-Bauer" es la más utilizada en los laboratorios de
microbiología clínica (Fig. 11). Esta técnica es, en esencia, el resultado de la
interacción de tres elementos: el antibiótico depositado en un reservorio,
generalmente un disco de papel filtro (sensidiscos); un microorganismo que
será inhibido o no por el antibiótico, y un medio sólido (agar) que servirá como
apoyo al crecimiento del microorganismo y de difusión del antibiótico. El
comportamiento de estos tres elementos a su vez estuvo determinado por las
condiciones de incubación: temperatura, concentración de bióxido de carbono y
tiempo de incubación.
Se depositó el disco con el antibiótico sobre el agar ya uniformemente
inoculado; se estableció una competencia entre el antibiótico que se difundió a
través del medio y el microorganismo: que comienza a crecer. Si éste es
susceptible, habría un halo de inhibición que se extenderá hasta un límite dado
por la concentración alcanzada por el antibiótico en ese punto (concentración
crítica).
Por lo que el diámetro de la zona de inhibición indicó el grado de
susceptibilidad del organismo al antibiótico, cuando éste quedó como única

variable del sistema. A mayor zona de inhibición mayor será la susceptibilidad

del organismo. Todos los ensayos se hicieron por quintuplicado.
Figura 11. Determinación de la actividad antimicrobiana por el método de

difusión en placa (Kirby-Bauer). El perfil de acción se mide por la formación de
halos de inhibición.
4.10.2. Categorías de susceptibilidad

El International Collaborative Study Group on Antimicrobial Susceptibillity
Testing de la Organización Mundial de la Salud (Ericsson, 1971) recomienda
cuatro categorías de susceptibilidad:
Categoría 1.- Incluye a las bacterias con un grado de susceptibilidad tal,
que la respuesta in vivo es probable en infecciones sistémicas, moderadas
a severas, cuando se tratan con la dosis habitual de un antimicrobiano.
Estos organismos se consideran como susceptibles.
Categoría 2.- Incluye la susceptibilidad in vitro que hace probable la
respuesta in vivo en infecciones sistémicas, cuando el antibiótico se usa en
dosis mayores o cercanas a la toxicidad.
Categoría 3.- Comprende ciertos grados de susceptibilidad en los que la
Respuesta in vivo es probable cuando se tratan infecciones localizadas en
sitios donde el antibiótico puede ser concentrado por procesos fisiológicos
o por aplicación local. Un ejemplo sería el tratamiento correcto de
infecciones urinarias por Proteus con penicilina G, que resultaría
inadecuado para tratar al mismo organismo alojado en una válvula
cardiaca.

Categoría 4.- Incluye organismos cuya susceptibilidad hace la respuesta in

vivo improbable. Son organismos considerados como resistentes.
Las categorías 2 y 3 corresponden a la susceptibilidad intermedia, como
se informa tradicionalmente, que además de las implicaciones clínicas antes
señaladas sirve para evitar discrepancias significativas que resulten de errores
técnicos no controlables.
4.11.3. Medios de cultivo

Los medios de cultivo que se emplearon fueron agar y caldo Dextrosa
Sabouraud (DIBICO) para Candida albicans agar y caldo Müeller Hinton
(MERCK) para las bacterias.
4.11.4. Microorganismos de referencia

Los microorganismos fueron elegidos entre especies representativas de
distintas bacterias Gram (+) y Gram (-), y un hongo levaduriforme. En la Tabla
10 se describe el tipo de microorganismo y el número de código de los
microorganismos de prueba. Éstos se adquirieron del Cepario de la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.
Tabla 10. Microorganismos utilizados en el ensayo antimicrobiano.

Microorganismo Tipo de microorganismo No. de código
Bacillus subtilis Bacilo Gram + ATCC 6633
Candida albicans Levadura ATCC 10231
Enterococcus faecalis Bacteria Gram + ATCC 10741
Escherichia coli Bacilo Gram + ATCC 10536
Pseudomona aeruginosa Bacilo Gram - ATCC 27853
Staphylococcus aureus Coco Gram + ATCC 6538
Antes de realizar la determinación del efecto antimicrobiano de los

diferentes extractos de la esponja, se verificó la viabilidad de cada uno de los
microorganismos seleccionados para este trabajo. Todas las determinaciones
del bioensayo antimicrobiano se hicieron por quintuplicado.

4.11.5. Reactivación, mantenimiento y conservación de las cepas

Todos los microorganismos fueron activados en caldo Muller Hinton a
36oC por 24 horas, luego se resembro en agar Mueller Hinton y se incubó en
las condiciones anteriores, para obtener colonias aisladas. Con las colonias
asiladas se hacieron resiembras masivas sobre cuñas de agar Mueller Hinton
con 1% p/v de glicerol y sin glicerol. Los tubos en cuña, luego de ser
incubados, se conservaron en refrigeración para tener cultivos de trabajo. De
las cajas de agar se cosecharon los microorganismos con solución
crioprotectora para conservar las cepas a -20oC. También se determinó
periódicamente la pureza de las cepas microbianas identificándolas por medio
de morfología colonial, aislándolas por estría cruzada en el agar apropiado para
cada microorganismo, por morfología microscópica y pruebas bioquímicas
específicas.
4.11.6. Viabilidad de las cepas

Con el fin de de verificar la viabilidad de cada uno de los
microorganismos, conocer la concentración celular y la fase de desarrollo de
los microorganismos, se realizó una curva de crecimiento empleando caldo
Dextrosa Sabouraud la levadura y caldo Müeller Hinton para las bacterias. En
la figura 12 se muestra el protocolo que se siguió para las cinéticas de
crecimiento.
MÉTODO DE
DIFUSIÓN
EN AGAR
Figura 12. Diagrama de flujo de la curva de crecimiento microbiano de los

microrganismos de referencia.
4.11.7. Preparación de los inóculos

4.11.7.1. Bacterias
Para la preparación de los inocúlos bacterianos se utilizaron las
bacterias S. aureus, E. faecalis, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa (Tabla 10).
Cada bacteria fue transferida al medio de mantenimiento Mueller Hinton e
incubada a 370C durante 24 horas, para la activación respectiva del cultivo.
Para preparar el inóculo fueron seleccionadas de 4 a 5 colonias de
bacterias activas en agar Mueller Hinton y transferidas a un tubo de ensaye
roscado con 5 mL de solución estéril de Caldo Mueller Hinton, seguido por una
homogenización en in vortex durante 15 segundos. La densidad del inóculo fue
ajustada por espectrofotometría a 520 nm, al patrón de turbidez número 0.5 de
McFarland (NCCLS, 1993). El inóculo final se obtuvo de la suspensión diluida
de los cultivos bacterianos respectivos, obteniéndose una concentración
aproximadamente de 1.5 x 106 células/mL (NCCLS, 1993). La suspensión
ajustada del inóculo no debe permanecer más de 15 a 20 minutos antes de
proceder a sembrarla en la caja petri.
4.11.7.2. Hongo levaduriforme

La levadura utilizada para la preparación del inóculo fue Candida
albicans. Se cultivo, por lo menos dos veces, en agar Dextrosa Saboraud, para
asegurarse de la pureza y viabilidad de los cultivos jóvenes de 24 y 48 horas a
370C. El procedimiento para la obtención del inóculo fue el que se describió
para las bacterias.
4.11.8. Selección del Antibiótico (Control Positivo)

Para la selección del control de sensibilidad o control positivo, con el fin
de obtener un marco de referencia acerca de la resistencia o sensibilidad de los
microorganismos objeto de estudio, se realizaron antibiogramas utilizando
algunos antibióticos que se encuentran en el mercado como Ampicilina,
Ketoconazol, Tienam/Imipenem, Cloranfenicol, Estreptomicina, Metronidazol y
Eritromicina. Se ensayaron concentraciones de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 mg/mL.
4.11.9. Control negativo

El control negativo consistió en discos impregnados con disolvente y

secados en iguales condiciones que las muestras; el ensayo es válido si hay

ausencia de halo inhibitorio.
4.11.10. Preparación de las concentraciones de extracto

Se aplicaron diferentes concentraciones (2, 3, 4, 5, 6 y 7 mg/mL) del
concentrado de cada uno de los extractos crudos microalgales obtenidos
anteriormente y disueltos con los diferentes disolventes. Mediante una
micropipeta con puntas estériles, se adicionaron a cada sensidisco estéril
aproximadamente 5 mL de las diluciones de los extractos y se dejaron secar.
Esta operación se repitió las veces necesarias hasta obtener las
concentraciones antes mencionadas.
4.11.11. Determinación de la actividad antimicrobiana

Se utilizaron cajas petri de vidrio, en las que se vertieron 15 mL de agar
Muller Hinton. Se dejaron solidificar y enfriar a temperatura ambiente. Con un
hisopo estéril se sembró en cada caja petri los organismos de referencia.
Inmediatamente se depositaron los sensidiscos con el apoyo de una pinza
estéril, presionándolos ligeramente para asegurar un contacto completo con la
superficie del agar. Se colocaron 6 sensidiscos en cada caja, los cuales
contenían diferentes concentraciones de extracto, además de los controles
negativos y positivos. Para prevenir una sobreposición de las zonas de
inhibición, la distribución de los sensidiscos se procuró tener un límite no menor
de 20 mm entre cada uno, y de 15 mm en relación con el borde de la placa. Las
cajas se incubaron de forma invertida a 37oC durante 24 h, los diámetros de las
zonas de inhibición se midieron por la parte posterior de la placa con una regla
graduada en milímetros, utilizando una fuente de luz brillante, cada hora hasta
completar las 24 horas. El ensayo se considera positivo (+) cuando hay
presencia de halo inhibitorio y negativo (-) cuando hay ausencia de halo
inhibitorio.
4.11.12. Concentración Mínima Bactericida (MBC)

Para determinar la concentración mínima bactericida, se seleccionaron
los cultivos que presentaron halo de inhibición antimicrobiana. Se tomó una

asada de estos cultivos y se sembraron en cajas petri con medio de cultivo de

agar Mueller Hinton y se incubaron a 37oC durante 24 horas. Después de la
incubación de los cultivos que han sido objeto de inspección se verificó
visualmente el crecimiento microbiano.
Para la interpretación de los resultados que se consideraron en la
inhibición es la siguiente si se percibió el crecimiento microbiano los cultivos en
las cajas petri el extracto se considera que es de acción bacteriostática y si no
existe crecimiento en los cultivos la acción se considera bactericida (Baron y
Finegold, 1990).

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CAPÍTULO 5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Características morfológicas de Haematococcus pluvialis
Los cambios morfológicos durante la etapa de formación de glóbulos

rojos incluyen un engrosamiento de la pared celular y un aumento significativo
en el volumen celular, a veces formando gigantes aplanoesporas rojas. Sin
embargo, la mayoría de los quistes son más pequeños de color rojo.
Figura 13. Fotomicrografía H. pluvialis (40X) en forma de quiste tomada con un

microscopio óptico.
En la Figura 13 se observa el espesor de la pared celular de la

aplanoespora de H. pluvialis. Esta pared se caracteriza por una extraordinaria
resistencia contra la agresión mecánica y química. Lorenz y Cysewski (2000)
recomiendan conocer los aspectos del ciclo de vida de H. pluvialis pues cada
vez se hace más importante este aspecto, debido al creciente interés en este
microorganismo como una fuente biotecnología de astaxantina. Al igual como
lo mencionan los autores Bubrick, (1991) y Olaizola, (2000) el engrosamiento
de la pared celular de la aplonoespora disminuye la biodisponibilidad de los
carotenoides acumulados ya que el rompimiento de las células para accesar a
los pigmentos se hace más difícil y caro debido a las multiples técnicas de
extracción.
5.2. Condiciones de cultivo y parámetros poblacionales de H.

pluvialis en los medios f/2 y QF.

Las investigaciones sobre el cultivo de microalgas revisten gran

importancia dada su amplia aplicación biotecnológica y comercial. En tal
sentido, se han utilizado los cultivos discontinuos por su fácil manejo para
determinar la cinética de crecimiento y los parámetros que influyen en el
desarrollo poblacional de las microalgas (Abalde et al., 1995). Sin embargo, el
uso de los medios de cultivo sintéticos ha incrementado sustancialmente el
valor económico para la producción de la biomasa de estos microorganismos
(González et al., 1999).
Recientemente se ha ensayado el uso de sustratos alternativos y no
convencionales como medios de cultivo, destacando: fertilizantes agrícolas,
residuos pesqueros y exudados gomosos, entre otros, para el crecimiento y
desarrollo de algunas microalgas. Se destaca que a partir de estos medios
innovadores se han obtenido resultados comparables y superiores a los
correspondientes a los medios sintéticos.
El objetivo general de este trabajo fue evaluar los cultivos por lotes de
Haematococcus pluvialis en los medios f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un
fertilizante foliar (QF).
Para que las microalgas crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial como el f/2 debe reunir una serie de condiciones. Un medio de cultivo
debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesario y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
5.2.1. Comportamiento del pH, de la conductividad eléctrica y de la

temperatura con relación al crecimiento de H. pluvialis.
Son numerosos los trabajos que se han realizado sobre los factores
físico-químicos que condicionan el crecimiento del fitoplancton en cultivo entre
los que se destacan la luz, temperatura, salinidad, pH y CO2 (Coutteau 1996,
Sánchez et al., 2000, Leonardos y Lucas 2000, Tzovenis et al., 2003).
Como se mencionó el pH es un parámetro fundamental para el
crecimiento de la microalga. Las microalgas de agua dulce, comúnmente
crecen favorablemente en intervalos de ambientes neutros a básicos (Ginzburg
y Ginzburg, 1981). Este parámetro afecta muchos procesos directamente
relacionados con el crecimiento microalgal y el metabolismo, incluyendo la

disponibilidad y asimilación de iones (Borowitzka y Borowitzka, 1988).

El intervalo de pH requerido por el fitoplancton es de 7.7 a 8.2
aproximadamente (14)
QF F/2
10.3
10.0
9.7
9.4
9.1
8.8
pH
8.5
8.2
7.9
7.6
7.3
7.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tiempo (días)
Figura 14. Variación del pH de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar)
de la microalga H. pluvalis en 30 días.
En la figura 14 se observa que el pH siguió la misma tendencia en los

dos medios de cultivo. En el medio f/2 se observa un aumento de

QF F/2
Conductividad Eléctrica (mV)

290
260
230
200
170
140
110
80
50
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tiempo (días)
Figura 15. Conductividad eléctrica de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante

foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días.
La temperatura óptima para el crecimiento de H. pluvialis es

relativamente bajo. Borowitzka et al. (1991) ha reportado que una variedad de
esta microalga (H. pluvialis MUR) crecía mejor a 15oC de temperatura. A 25oC
fue inhibido el crecimiento y a 35oC de temperatura el cultivo decayo en su
totalidad. El mismo modo Harker el al., (1995) demostró que la temperatura
optima de crecimiento estaba entre los 14 y 15 oC.
5.2.1. Densidad Celular.
La curva de crecimiento de las microalgas, de forma general, posee

cinco fases en el tiempo. La duración de cada fase puede acortarse, alargarse
o apenas reconocerde, dependiendo de diversos factores como temperatura,
fuente deluz, composición química del medio de cultivo, tamaño del inóculo y
características propias de las microalgas.
Al inocular un nuevo medio, a menudo no se registra un crecimiento
inmediato en el número de células. Esta fase de inducción o de retraso del

crecimiento se puede dilatar entre 1 a 3 días, dependiendo del tamaño y del

estado del inoculo. En general, este periodo se puede evitar utilizando como
inóculos cultivos que todavía están en su fase de crecimiento exponencial.
Al adaptarse las células al medio, la densidad de las microalgas
aumenta en forma geométrica (exponencial). La fase exponencial puede
presentarse del segundo al tercer día después de inoculado el medio y
prolongarse hasta 4 días.
En la fase de declinamiento relativo del crecimiento, puede durar de 1 a
2 días, empieza a manifestarse un decremento de la velocidad de las células,
debido a condiciones desfavorables en el cultivo generadas en la fase
exponencial. Al final de esta fase la densidad del cultivo alcanza su valor
máximo.
f/2 QF
2.50E+06
2.00E+06
No. de cel/mL
1.50E+06
1.00E+06
5.00E+05
0.00E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tiempo (días)
Figura 14. Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo f/2 y QF

(fertilizante foliar).
Como se observa en la figura 14, el crecimiento de la microalga presentó

una tendencia similar en los dos medios evaluados, con una fase de latencia
que culminó el día 12 para el medio f/2 y para el QF el día 6, seguida de una
fase exponencial que duró 18 días para el medio QF y para el medio f/2 10. La
microalga presentó una fase estacionaria después de los días 24 y 26 en los

medios f/2 y QF respectivamente.

En el día 24 la microalga alcanza su densidad celular máxima (2098250
cel/mL) en el medio QF y en el f/2 el día 22 con 686000 cel/mL.
5.3.3. Divisiones por día (k) en los diferentes medios de cultivo.
f/2 QF
1.60
1.40
k (divisiones por día)
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (días)
Figura 16. Divisiones por día de H. pluvialis en los medios f/2 y QF (fertilizante
foliar) en 30 días de cultivo.
5.3.4. Tasa de crecimiento específico (m) de los medios de cultivo f/2

y QF.

f/2 QF
0.45
0.42
0.39
0.36
0.33
0.30
0.27
m (día-1)
0.24
0.21
0.18
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (días)
Figura 17. Tasa de crecimiento específico (m) de los medios de cultivo f/2 y QF
(fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 días.
5.3.5. Tiempo de generacion (Tg) en los diferentes medios de

cultivo.
f/2 QF
4.70
4.40
Tiempo de generación (Tg)
4.10
3.80
3.50
3.20
2.90
2.60
2.30
2.00
1.70
1.40
1.10
0.80
0.50
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (días)
Figura 18. Tiempo de generación de H. pluvialis en 30 días de cultivo en los

medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar).
5.3.6. Producción diaria de los medios de cultivo f/2 y QF.
f/2 QF
9.E+04
8.E+04
Producción diaria (cel/mL)
7.E+04
6.E+04
5.E+04
4.E+04
3.E+04
2.E+04
1.E+04
0.E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (días)
Figura 19. Producción diaria de la microalga H. pluvialis en los

diferentes medios de cultivo.
5.3. Análisis químico proximal.
Otra de las herramientas para determinar la cantidad y calidad de la

biomasa celular en cultivos es la determinación de su composición bioquímica
(proteínas, carbohidratos, cenizas, humedad y lípidos). Esta información es
sumamente útil para analizar sobre todo aquellas especies de uso potencial en
acuicultura; además puede ser utilizada como una medición indirecta para
mostrar la fase de crecimiento en que se encuentra el cultivo.
Tabla 13. Composición química proximal de H. pluvialis en base de los medios

f/2 y QF.
Análisis f/2*(%) Fertilizante foliar (%)
Proteínas 37.6 ± 0.4 41.2 ± 0.7

Carbohidratos 18.5 ± 0.5 20.2 ± 0.2

Lípidos 29.7 ± 0.3 27 ± 0.7
Humedad 3.3 ± 0.4 3 ± 0.3
Cenizas 10.9 ± 0.1 8.6 ± 0.6
*(Guillard y Ryther, 1962)
Las microalgas, en general, contienen del 25 hasta el 65% de su peso

seco como proteínas, hasta el 53% de lípidos y hasta el 58% de carbohidratos,
dependiendo de su etapa de desarrollo (Castillo y Berger, 1983; Brow et al.,
1989).
La composición bioquímica de la microalga Haematococcus pluvialis ha
recibido relativamente poca atención, ya que la mayoría de las investigaciones
han sido dirigidas a la evaluación de otros compuestos de interés, tales como
carotenoides totales y particularmente la astaxantina, en determinadas
condiciones de cultivo. Sin embargo, es importante examinar la composición
bioquímica de esta microalga (proteínas, carbohidratos y lípidos), sobre todo
cuando van a ser incluidas como células en dietas peletizadas para la
alimentación de peces y crustáceos. Esta propuesta se debe a que además de
la pigmentación que dicha microalga proporciona a estos organismos, podría
funcionar como complemento alimenticio o como un alimento potencial para
otros organismos filtradores que forman parte de la cadena alimenticia. Estos
últimos deben ser capaces de digerir la pared celular, característica de esta
cepa cuando se encuentra enquistada (células en estado plameloide y
aplanosporas). Los resultados obtenidos en el cultivo de Haematococcus
pluvialis en los diferentes medios utilizados mostraron un porcentaje de
componentes bioquímicos adecuados. Estos porcentajes son similares a los
reportados para H. lacustris (Cerón, 1996) y para otras especies de microalgas,
ampliamente utilizadas en acuicultura (Brown et al., 1989).
Durante el desarrollo de los cultivos, predominó la presencia de células
rojas sobre las demás morfologías. Se observaron células flageladas con el
centro pigmentado, esta expresión de la microalga se condiseraría idónea si se
lograra mantener cultivos masivos. En estas condiciones pudiera ser utilizada
directamente en la alimentación de organismos con bajo poder de digestibilidad

de paredes celulares duras, como algunos peces y crustáceos de importancia

económica (Sommer et al., 1991).
5.4. Extracción y determinación de pigmentos
Los pigmentos carotenoides son solubles en lípidos o en solventes no

polares, excepto cuando se forman complejos con las proteínas y azúcares.
Los disolventes polares más utilizados para la extracción de los carotenoides
son el éter de petróleo y el éter etílico. Hay otros, pero, tienen muchos
inconvenientes, como ser inflamables, tóxicos y degradan rápidamente los
carotenoides. Otros disolventes menos polares como la acetona, el metanol y
el etanol también se utilizan para la extracción, pero sólo son eficientes siempre
y cuando se trate de la extracción de xantofilas (Rodriguez-Amaya, 1997).
En general, la extracción de los carotenoides se debe hacer
rápidamente, a fin de evitar el contacto con la luz, el oxígeno y altas
temperaturas, ya que se tiene que minimizar la degradación de estos
compuestos. Según algunos autores (Rodríguez-Amaya 1989, Rodríguez-
Amaya, 1990 y Amaya-Farfan, 1992), hay varios puntos que deben tenerse en
cuenta en la extracción de los carotenoides, dentro de los cuales destacan:
r El origen de los carotenoides.
r La composición de los carotenoides en los alimentos ya que éstos varían
tanto cualitativa y cuantitativamente.
r La predisposición a la isomerización y la oxidación.
5.4.1 Determinación de los pigmentos en la biomasa húmeda

0 2 4 6 8 10 12 14
(días)
16 18 20 22 24 26 28 30
0.38
0.35
0.32
0.29
Unidades de absorbancia
0.26
0.23
0.2
0.17
0.14
0.11
0.08
0.05
0.02
-0.01
340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740
Longitud de onda (nm)
Figura 15. Espectro de absorción f/2.
0 2 4 6 8 10 12 14
(días)
16 18 20 22 24 26 28 30
0.18
0.15
Unidades de absorbancia
0.12
0.09
0.06
0.03
0
340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740
-0.03
Longitud de onda (nm)
Figura 17. Espectro de absorción QF.

Clorofila a Clorofila b Astaxantina b-caroteno Luteína
1.2
1.0
Concentración (mg/mL)
0.9
0.7
0.6
0.4
0.3
0.1
-0.1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
-0.2
Tiempo (días)
Figura 11. Concentración de pigmentos f/2
Clorofila a Clorofila b Astaxantina b-caroteno Luteína
1.2
1.0
Concentración (mg/mL)
0.9
0.7
0.6
0.4
0.3
0.1
-0.1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
-0.2
Tiempo (días)
Figura 15. Concentración de pigmentos biomasa humeda QF.
Lababpour y Lee (2005) probaron varios disolventes orgánicos (metanol,

hexano, cloroformo, n-propanol y acetonitrilo) y seleccionaron a la acetona
100% como el mejor disolvente extractivo de los pigmentos, debido a su
sensibilidad y baja toxicidad en comparación con otras pruebas. No obstante en

este estudio se obtuvieron bajos rendimientos en la extracción de Astaxantina

con la Acetona 100%.
Un rompimiento con DMSO es un método rápido y reproducible en
comparación con los métodos de mecánicos, por lo que es un método
alternativo que puede utilizarse eficazmente para de extracción de astaxantina
a partir de células de H. pluvialis.
Tal como se presenta en la literatura, algunos autores han señalado que
en la extracción de astaxantina se han utilizado distintos extractantes y
disolventes, entre ellos la acetona que ha sido uno de los disolventes orgánicos
para la extracción de dicho pigmento.
Se evaluó el potencial extractor de tres disolventes: Acetona 100%,
Acetona-HCl 4N y DMSO. Según los resultados que se presentan en la Tabla
10.
Tabla 10. Resultados de las extracciones

Disolvente F/2 (Guillard y Ryther, 1962) QF (Fertilizante foliar)
[mg/mL] [mg/mL]
Acetona 100% 3.5 (1.4% en 50 mg*) 2.0 (0.79% en 50 mg*)

Acetona-HCl 4N 2.1 (0.8% en 50 mg*) 3.8 (1.5% en 50 mg*)
DMSO 3.2 (4% en 50 mg*) 2.8 (3.5% en 20 mg*)*
En la figura 20 se observa las células antes y después de las extracciones con

los diversos disolventes.

Figura 20. Fotomicrografía de células enquistadas de H. pluvialis (a1, b1) antes

de la extracción y (a, b) después de la extracción. (a=F/2 and b=QF)..
5.5. Separación e identificación de los compuestos.
La separación e identificación de la separación de estos compuestos

generalmente se produce por métodos cromatográficos, como Cromatografía
de Capa Fina (TLC) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Desde HPLC es la técnica preferida de columna, ya que esto tiene dos
ventajas: el hecho de que es cualitativa y cuantitativamente el mismo tiempo.
Esta técnica es ideal para los carotenoides, ya que estos compuestos pueden
ser fácilmente controlados por los rayos UV detectores visibles. Un factor que
ha contribuido aún más a los estudios de los carotenoides es que se dediquen
a los detectores de fotodiodo, que permiten la detección de más de una
longitud de onda. En general, la técnica de cromatografía líquida de alto
rendimiento tiene las siguientes ventajas sobre otras técnicas: alta sensibilidad,
resolución, reproducibilidad y rapidez en el análisis (Taylor, 1988). La técnica
más utilizada para el análisis de los carotenoides es la espectroscopia UV-
visible, que proporciona información sobre la presencia de anillos, grupos
carbonilo y los efectos de isómeros. En este análisis, el máximo de absorción,
la forma y la estructura del espectro están las características de las moléculas
de los cromóforos.
5.6. Actividad antimicrobiana

Casi siempre, la búsqueda de productos naturales activos esta
íntimamente ligada a ensayos antimicrobianos. Con estos bioensayos, se pudo
conocer la capacidad que tiene un compuesto o grupo de compuestos de una
eventual actividad contra algunos microorganismos. Se emplearon métodos en
difusión en placa o discos con agar puesto que es una prueba eficiente,
sencilla, no costosa (Rinehart, 1990) y económica en términos de cantidad de
muestra utilizada. Sin embargo, es importante hacer notar algunos
inconvenientes de esta técnica, puesto que los extractos poco polares tienden
a difundirse deficientemente sobre la placa de agar ya que los compuestos del
agar son altamente polares (Berghe y Vlietinck, 1991). No obstante fue posible

detectar actividad antimicrobiana en extractos poco polares.
Selección del antibiótico (control positivo)

Entre los antibióticos que se encuentran en el mercado se eligieron los
controles positivos (Tabla 11). Todos los microorganismos de prueba
manifestaron resistencia a la Estreptomicina, al Metronidazol y la Eritromicina.
Las cepas bacterianas C. albicans, E. faecalis y P. aeuruginosa fueron las que
presentaron más resistencia a los antibióticos de prueba. Torres-Ariño (2001)
recomendó el uso de Tienam/Imipenem como control positivo pues es uno de
los más efectivos para la eliminación de bacterias heterótrofas. El ketoconazol
solo se probó en Candida albicans, puesto que este medicamento es
antifúngico y no tenía caso probarlo en bacterias.
Tabla 11. Antibióticos probados para definir los controles positivos

Microorganismo Ampicilina Ketoconazol Tienam/ Cloranfenicol Estreptomicina Metronidazol Eritromicina
Imipenem
B. subtilis S N. P. R R R R R
C. albicans R S R R R R R
E. faecalis R N. P S R R R R
E. coli R N. P R S R R R
P. aeruginosa R N. P S R R R R
S.aureus R N. P R S R R R
R= Resistente, S= Sensible, N. P.= No se probo.
B. subtilis, y C. albicans mostraron sensibilidad a la Ampicilina y al

Ketoconazol, respectivamente. El Tienam/Imipenen inhibió el crecimiento de E.
faecalis, P. aeruginosa, y el Cloranfenicol el de E. coli y S. aureus.
En la tabla 12 se ilustran los controles positivos, la concentración de
éstos por disco, y el halo de inhibición que se formó. El halo de inhibición
formado por la Ampicilina para B. subtilis fue el más grande (22 mm). Este
bacilo resultó ser muy sensible a este medicamento, a pesar que el espectro de
acción de dicho antibiótico es mayor que el de la bencilpenicilina; aunque
también es sensible a las penicilinasas. Es menos activa contra bacterias gram
positivas, pero es activa contra algunas gram negativas, como Escherichia coli,
Haemophilus influenzae y Salmonella sp., aunque se han reportado
incrementos en su resistencia (US Pharmacopeia, 1994; Anon, 1995; Barnas y

Nimphius, 1996; Demonty, 1996) La Ampicilina está indicada,

fundamentalmente, en infecciones por algunas bacterias gram negativas y
enterococos, pero es ineficaz frente a Klebsiella, Enterobacter y Pseudomonas
spp. Es eficaz en las infecciones debidas a estreptococos y estafilococos
sensibles, así como en las infecciones urinarias causadas por E. coli, P.
mirabilis y Enterococcus sp., en las meningitis por H. influenzae, neumococos y
meningococos sensibles y en las infecciones por Listeria, incluyendo meningitis
(US Pharmacopeia, 1994; Anon, 1995; Barnas y Nimphius, 1996; Demonty,
1996).
Tabla 12. Halos de inibición de los controles positivos.
Control positivo Halo de inhibición

Microorganismo (mg/disco)
(Antibiótico) (mm)
Bacillus subtilis Ampicilina 3 22

Candida albicans Ketoconalzol 4 19
Enterococcus faecalis Tienam/Imipenem 4 17.5
Escherichia coli Cloranfenicol 3.5 19.5
Pseudomona aeruginosa Tienam/Imipenem 4 16.5
Staphylococcus aureus Cloranfenicol 3.5 21
Valores promedio producto de las cinco réplicas.
La concentración más alta que se manejo de Tienam/Imipenem fue de 4

mg por disco para P. aeruginosa y E. faecalis. El Tienam/Imipenem, derivado N-
formimidoilo de la tienamicina, obtenido del Streptomyces cattleya, fue el primer
antibiótico betalactámico del grupo de los carbapenémicos. Es también
bactericida y actúa, igualmente, inhibiendo la síntesis de la pared celular. Su
espectro de acción es amplio e incluye a microorganismos gram positivos y
gram negativos, aerobios y anaerobios. Se utiliza en el tratamiento de
infecciones intra-abdominales de etiología mixta y nosocomiales; incluyendo las
de microorganismos gram negativos resistentes, como son las de Enterobacter;
y las originadas por el uso previo de antibióticos de amplio espectro. Tiene
buena actividad contra P. aeruginosa y Bacillus fragilis, pero la mayoría de las
cepas de estafilococos resistentes a la meticilina lo son también al imipenem y
la P. aeruginosa puede hacerse resistente cuando se usa solo. Es uno de los
antibióticos más caros que existen en el mercado actual, el costo de un

tratamiento puede exceder los $100/día (Alv y Nord, 1995; Ennis y Cobbs,
1995; Norrby, 1995;).
Actividad antimicrobiana en los extractos crudos.

Todos los extractos crudos se ensayaron contra los microorganismos de
prueba como se ilustra en la tabla q.
Tabla 13. Actividad antimicrobiana en los extractos crudos de Haematococcus

pluvialis extraida con DMSO.
Tipo de
Microorganismo 2 3 4 5 6 7
microorganismo
Bacillus subtilis Bacilo Gram + - - + + + +
Candida albicans Levadura - - - - + +
Enterococcus faecalis Bacteria Gram + - - + + + +
Escherichia coli Bacteria Gram - - - + + + +

Pseudomonas - - + + +
Bacilo Gram - -
aeruginosa
Staphylococcus aureus Coco Gram + - - + + + +
(+) inhibición de crecimiento microbiano. ( - ) no inhibición de crecimiento microbiano.

pluvialis extraida con Acetona 100%.
Tipo de
microorganismo
Candida albicans Levadura - - - - - +
Pseudomonas - - + +
Bacilo Gram - - -
aeruginosa

pluvialis extraida con Acetona-HCl 4N
Tipo de
microorganismo


Candida albicans Levadura - - - - - +
Pseudomonas - - + +
Bacilo Gram - - -
aeruginosa

CONCLUSIONES
1. La composición química proximal de H. pluvialis presento porcentajes
adecuados y que coinciden con otras microalgas (proteína 37.6-41.2%,
carbohidratos 18.5-20.2% y lípidos 29.7- 27%) por lo que puede ser una
alternativa como suplemento alimenticio para la acuicultura.
2. El DMSO resulto ser el disolvente adecuado para la extracción de

astaxantina, sin embargo no es muy versátil ni adecuado para la
concentración de este extracto.
3. Los extractos crudos extraidos con DMSO resultaron tener más actividad
antimicrobiana que los extractos de Acetona 100% y Acetona-HCl 4N.
4. Todos los extractos crudos tuvieron un efecto bactericida frente a los

microorganismos de prueba.

RECOMENDACIONES.
Los futuros trabajos que deberían realizarse:
· Ensayar la actividad antioxidante de estos extractos crudos.
· Optimizaar las condiciones de producción de H. pluvialis para su

escalamiento a 10 L.
· Realizar pruebas de toxicidad de los extractos.

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA

EVALUACIÓN DE DEL CRECIMIENTO CELULAR Y DE LOS

Director de tesis: Dr. Eduardo San Martín Martínez

MEXICO, D. F. enero, 2010

Alicia Soledad Martínez Silva iii

Alicia Soledad Martínez Silva iv

CAPÍTULO 4 MATERIALES Y MÉTODOS 40

Alicia Soledad Martínez Silva v

Alicia Soledad Martínez Silva vi

2 Estructura química de algunos Carotenoides: Xantofilas. 8

3 Ruta resumida de la biosíntesis de los Carotenoides. 10

4 Isómeros configuracionales de la astaxantina (3S,3’S), 15

5 Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y 19

6 Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo 21

7 Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Célula 28

8 Haematococcus pluvialis. (a) Depósito de agua 29

9 Conservación de H. pluvialis. (a) en agar y (b) en medio 40

10 Determinación de la actividad antimicrobiana por el 49

11 Diagrama de flujo de la curva de crecimiento 52

12 Micrografía H. pluvialis (40X) en forma de quiste 27

13 Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo 33

14 Variación del pH de los medios de cultivo f/2 y QF 34

Alicia Soledad Martínez Silva vii

16 Divisiones por día de H. pluvialis en los medios f/2 y QF 36

17 Tasa de crecimiento específico (m) de los medios de 46

18 Tiempo de generación de H. pluvialis en 30 días de 47

19 Producción diaria de la microalga H. pluvialis en los 48

Alicia Soledad Martínez Silva viii

No. Tabla Página

2. Principales organismos productores de Astaxantina.

3. Clasificación Taxonómica de Haematococcus pluvialis. 25

4. Compuestos comúnmente presentes en H. pluvialis. 29

5. Perfil de aminoácidos en H. pluvialis. 29

6. Ácidos grasos encontrados en la microalga H. 31

7. Parámetros para las diferentes condiciones

8. Condiciones iniciales de los medios de cultivo de H.

9. Composición química de diferentes medios de cultivo 41

10. Microorganismos utilizados en el ensayo 51

11. Antibióticos probados para definir los controles 63

12. Halos de inibición de los controles positivos. 64

Alicia Soledad Martínez Silva ix

La obtención de carotenoides de microalgas es un tema de gran importancia

Alicia Soledad Martínez Silva x

Obtaining carotenoids from microalgae is a subject of great scientific

Alicia Soledad Martínez Silva xi

En la actualidad, uno de los principales intereses en Ciencia y

Alicia Soledad Martínez Silva 1

betacaroteno y Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la

Alicia Soledad Martínez Silva 2

Los pigmentos son generalmente colores que se pueden observar

1.1.3. Pigmentos Naturales

Alicia Soledad Martínez Silva 3

Los carotenoides son pigmentos naturales responsables de los colores

Alicia Soledad Martínez Silva 4

(Maldonade et al., 2007).

Alicia Soledad Martínez Silva 5

representa el color. La estructura responsable de la absorción de la luz es el

1.2.1. Estructura química de los carotenoides