ALCALOIDES BENCILISOQUINOLÍNICOS

RESUMEN

Los alcaloides bencilisoquinolínicos (ABI) son metabolitos especializados con una distribución
filogenética antigua pero conservada todavía en clados modernos. Varios de ellos, como la
morfina, sanguinerina y berberina tienen importancia en la medicina moderna. En esta revisión
se analizan los aspectos más sobresalientes del estado actual de la biosíntesis de ABI. Se han
realizado estudios que han permitido conocer la biosíntesis de 22 de estos metabolitos
nitrogenados. En su formación participan 43 enzimas agrupadas en oxidoreductasas,
transferasas y liasas, que en algunos casos representan ejemplos atípicos de la forma en la que
se originó la diversificación del metabolismo secundario, entre ellos proteínas citocromo P450
(CYP450) con actividades catalíticas para la ruta de los ABI, o la enzima norcoclaurina sintasa
(NCS) que está emparentada con proteínas alergénicas de defensa. Así mismo, hay avances
genéticos en los que se ha podido caracterizar 30 enzimas, permitiendo conocer procesos de
regulación. Otro aspecto interesante es la compartimentación de los sitios de biosíntesis y
acumulación de ABI ya que en varios casos están separados espacialmente y en distintas
especies o en la misma pueden participar varios tipos de células. Ello ha sugerido el transporte
intra e intercelular de los alcaloides, los precursores y de las enzimas, se ha documentado el
transporte de berberina entre el citoplasma y las vacuolas del almacenamiento. El panorama de
la biosíntesis de ABI se ha construido con los estudios de ejemplares de importancia
farmacológica.

INTRODUCCIÓN

Las plantas producen metabolitos secundarios, recientemente renombrados como metabolitos

especializados, moléculas que no son ubicuas, y que no están directamente involucradas con los
procesos primarios de crecimiento y desarrollo, lo que significa que no son necesarias en el
metabolismo primario, pero que cumplen con alguna función ecológica y que toman precursores
para su biosíntesis del metabolismo primario.

Dentro de estos metabolitos especializados se encuentran los alcaloides, cerca de 21, 000
compuestos encontrados hasta hoy en el 20% de la plantas, son moléculas nitrogenadas de bajo
peso molecular con una amplia variedad de estructuras químicas y de actividades biológicas.
Algunos de ellos como la vincristina y el taxol son usados como fármacos anticancerígenos y
otros más incluyendo a la morfina como potentes analgésicos. Hasta ahora, la razón de ser de
los alcaloides en las plantas está justificada por sus implicaciones ecológicas, ya que son barreras
químicas contra fitopatógenos (bacterias, hongos y virus) y herbívoros o reservorios de
nitrógeno. La importancia de estos compuestos naturales tanto para las plantas como para los
humanos ha llamado la atención de varios investigadores.

Se han podido determinar aspectos celulares y moleculares de su biosíntesis, entre ellos las
formas, los sitios, los momentos y la regulación. Uno de los puntos más interesantes es el
relacionado con la compartimentación de las rutas de biosíntesis, en donde están involucrados
diferentes tejidos, células, orgánulos y transportadores específicos. El entendimiento de estos
aspectos permite un acercamiento a la forma en la cual las células y los tejidos de las plantas
resuelven un movimiento coordinado de precursores, intermediario, productos, enzimas y
transcritos para la formación de metabolitos secundarios. En el estudio de este tema está
integrado el uso de herramientas modernas y tradicionales en las áreas de biología celular y
molecular, genética, química y bioquímica y en varios casos son investigaciones de frontera. En
este trabajo se documenta el conocimiento actual sobre la biosíntesis de alcaloides
bencilisoquinolínicos y su coordinación espacio temporal.

BIOSÍNTESIS DE ALCALOIDES BENCILISOQUINOLÍNICOS

El primer alcaloide bencilisoquinolínico (ABI) conocido fue la morfina, aislada del opio por
Friedrich Wilhelm Sertürner en 1804, constituyendo todo un suceso en la química de los
productos naturales. Hoy se cuenta con un número cercano a 2500 estructuras, que se
caracterizan por presentar un esqueleto carbonado básico que proviene de un enlace entre un
anillo isoquinolínico y otro bencil (sistema 1-benciltetrahidroisoquinolina, 1-btiq). La diversidad
estructural resulta de las modificaciones al esqueleto 1-btiq por hidroxilaciones, reducciones,
oxidaciones, formación de enlaces C-C y O- y N-metilaciones, de tal forma que se pueden
distinguir básicamente 13 subtipos: simples, aporfinas, benzofenantridinas,
bisbencilisoquinolinas, cularinas, ftalideisoquinolinas, morfinanos, morfinandienonas,
pavinas/isopavinas, protoberberinas, protopinas, rhoeadinas/paverrubinas, y secoberberinas
(Figura 1).
Los ABI además de ser reconocidos por las propiedades farmacológicas que exhiben (Tabla 1),
tienen importancia biológica porque son moléculas con un origen vegetal evolutivo antiguo,
producidas principalmente por Angiospermas primitivas y conservados en clados modernos.

Los estudios para tratar de establecer la biosíntesis de ABI inician en 1910 con Winterstein &
Trier en Alemania, señalando los primeros precursores derivados de la tirosina. Es decir, han
pasado doscientos años desde el aislamiento del primer ABI, y cien del inicio de los estudios para
tratar de descubrir cómo se forman en las plantas. Aunque teóricamente los aminoácidos L-
tirosina y L-fenilalanina son considerados como precursores básicos de toda la diversidad de ABI,
únicamente con el primero se han reportado trabajos de incorporación a la ruta de biosíntesis.

La biosíntesis de ABI puede agruparse artificialmente en tres intervalos:

a) La producción del precursor central de todos los ABI, S-norcoclaurina, desde dos
moléculas de L-tirosina.
b) La transformación de S-norcoclaurina a S-reticulina, el intermediario principal de
diversificación de la ruta.
c) Las rutas de diversificación que dan origen a los diferentes tipos de ABI (Figura 2).
Las dos primeras partes que forman el núcleo de la biosíntesis están bastante bien
caracterizadas a nivel proteómico y genómico, sin embargo, hay 4 enzimas que aún no han sido
aisladas y/o caracterizadas de plantas productoras de ABI aunque se ha reconocido su actividad
catalítica.

En tanto que, sobre la diversificación de la ruta, los avances más importantes se han centrado
sobre seis ramas que inician con (S)- reticulina y permiten la biosíntesis de alcaloides:

a) Bencilisoquinolínicos simples (papaverina)

b) Tipo protoberberina (berberina)
c) Tipo benzofenantidrina (sanguinerina)
d) Morfinanos (morfina)
e) Aporfina (magnoflorina)
f) Tipo fthalideisoquinolina (noscapina).
Así también se conocen las enzimas que producen los ABI diméricos como la berbamunina
que se originan de un precursor que precede a la (S)-reticulina. Dependiendo de la ruta de
diversificación se necesitan entre diez y veinte enzimas para obtener un alcaloide como
producto final (Tabla 2).
Un esquema actualizado de la diversidad biosintética se representa en la figura 2. Este plano
bioquímico se ha construido con estudios de biosíntesis en plantas y/o cultivos celulares de
Argemone mexicana, Berberis stolonifera, B. beaniana, B. canadiensis, Coptis japonica, Corydalis
vaginans, Eschscholzia californica, Papaver somniferum, P. bracteatum, Thalictrum flavum, T.
tuberosum, T. bulgaricum, Tinospora caffra, T. cordifolia y Sanguinaria canadiense.

En suma, se ha podido dilucidar la participación de 43 enzimas en la biosíntesis de los ABI,

agrupadas en 25 oxidoreductasas, 15 transferasas y 3 liasas. Dentro de las oxidoreductasas,
sobresalen las dependientes de citocromo P450 (CYP), tanto por el número (diez) como por sus
características enzimáticas, por ejemplo, las CYP80 y CYP719 encontradas en la ruta de los ABI,
son enzimas típicas de las plantas productoras de alcaloides. En tanto que, las de la familia
CYP719A han sido encontradas solo en plantas productoras de ABI, catalizando la formación de
los puentes metilendioxi, lo que tal vez signifique que la evolución de estas CYP permitió la
presencia y diversificación de los ABI. Otro grupo representativo de enzimas de la ruta son las S-
adenosil-L-metionina metiltransferasas (trece). La metilación enzimática es una reacción ubicua
que ocurre en diversos organismos y resulta en la modificación de las moléculas para diferentes
propósitos funcionales o regulatorios, en la biosíntesis de ABI participan tres N-metiltransferasas
y diez O-metiltransferasas (OMT). Las OMT catalizan la transferencia de un grupo metilo desde
S-adenosil-L-metionina a un átomo de oxígeno de un hidroxilo y participan en la formación no
solo de ABI sino de varios metabolitos especializados, permitiendo la diversificación de
estructuras y en muchos casos la alteración de la solubilidad de la molécula y el incremento de
sus actividades ecológicas. Las dos liasas tienen una participación clave en la ruta, la TYDC que
desvía la tirosina a la biosíntesis de ABI y la NCS que produce el precursor central, ambas son
estimuladas por la presencia de patógenos. En el caso de la NCS hay estudios que la emparenta
genéticamente con proteínas que aparecen en la planta en condiciones patológicas, agrupadas
bajo el nombre genérico de Pathogenesis-Related, proteínas PR o de patogenicidad. La enzima
NCS es la única proteína conocida de la familia PR10 tipo Betv1 (proteínas alergénicas) que
demuestra de manera inequívoca actividad catalítica en las plantas. Como se puede constatar la
biosíntesis de ABI tiene enzimas especiales que hacen muy atractivo su estudio bioquímico,
genético, fisiológico y evolutivo.

Ha sido posible caracterizar los ADN complementarios de cerca de 30 enzimas, 24 solo en P.

sominferum, lo que ha permitido conocer aspectos moleculares sobre la regulación de esta ruta.
Los avances más importantes se centran sobre la biosíntesis de algunos compuestos
sobresalientes por su importancia medicinal, la mayor parte de las rutas de diversificación
permanecen desconocidas.

COMPARTIMENTACIÓN DE LOS SITIOS DE BIOSÍNTESIS Y ACUMULACIÓN DE ABI

Se ha avanzado en la comprensión de la biosíntesis del metabolismo especializado, incluso de la

expresión y regulación de los genes implicados, sin embargo son escasos los estudios sobre los
mecanismos que gobiernan la distribución espacial de las enzimas, cofactores y sustratos que
intervienen en la biosíntesis de alcaloides. Este aspecto es importante para todo el metabolismo
en general, ya que por sí solas, la distribución y localización específica en diferentes sitios
celulares o tisulares de las enzimas han sido consideradas como otro mecanismos de regulación,
la compartimentación permite la optimización de reacciones enzimáticas al procurar diversos
entornos de pH subcelulares, permitiendo el funcionamiento simultáneo de las vías que
compiten por los mismos sustratos, evita además, los ciclos fútiles y confina los metabolitos
tóxicos. Sin embargo y con frecuencia esta separación requiere del transporte de los diferentes
metabolitos de un punto a otro para su conversión, por tanto, existen proteínas específicas de
transporte que facilitan y regular la importación y exportación de metabolitos a través de
membranas, contribuyendo al control del flujo entre compartimentos.

En la biosíntesis y almacenamiento de ABI participan diferentes tipos de tejidos, células y

orgánulos, por ejemplo en P. somniferum, la biosíntesis de morfina y noscapina ocurre en los
tallos y raíces y se acumulan en el citoplasma de células especializadas (células laticíferas) de los
carpelos y de las cápsulas de los frutos, mientras que la sanguinarina es biosintetizada y
acumulada en las raíces; en B. stolonifera, la berberina al parecer es biosintetizada y almacenada
en todos los órganos.

Generalmente las enzimas se encuentran reunidas en un solo tejido aunque pueden tener una
distribución más amplia, algunas como NCS, SalSyn y SaIR involucradas en la biosíntesis de
morfina, son más abundantes en raíces y brotes que en el resto de la planta. Otras como NMCH
son más abundantes en los tallos y disminuyen gradualmente en las raíces, hojas y tejidos
florales. Inclusive los transcriptos de la SOMT, enzima que participa en la biosíntesis de
noscapina, se acumulan mayormente en los tejidos aéreos de P. somniferum en donde ocurre
la acumulación de los alcaloides.

Esta diferenciación espacial puede ser mayor ya que la expresión genética y la actividad de las
enzimas correspondientes, se ubica exclusivamente en ciertas células o compartimentos
subcelulares. Por ejemplo Bird et al. (2003), Weid et al. (2004) y Samanani et al. (2006)
demostraron en Papaver somniferum que en la biosíntesis y acumulación de morfina,
sanguinarina y alcaloides relacionados, participan distintos tipos de células del floema tanto de
los tallos como de las raíces. Utilizando técnicas de inmunofluorescencia e hibridación de ARN
in situ Bird et al. (2003) y Samanani et al. (2006) encontraron que 7 de las 14 enzimas de la ruta
para alcaloides tipo morfina [6OMT, CNMT, NMCH, 4’OMT, BBE, SaIAT y COR] están localizadas
en los elementos cribosos, mientras que los transcritos de éstas se encuentran en las células
acompañantes y los alcaloides en células laticíferas. En tanto que Weid et al. (2004) y Kutchan
(2005) señalan que en los tallos las enzimas 4’OMT y SaIAT están ubicadas en el parénquima y
COR en las células laticíferas, mientras que en la raíz las enzimas 4’OMT, 7’OMT y SaIAT fueron
encontradas en el periciclo del estele y BBE en las células del parénquima del cortex. La
diferencia de resultados pareciera estar en el grado de desarrollo de los tejidos vasculares que
se analizaron en esos estudios, mientras que Weid et al. (2004) al parecer tomaron muestras en
donde los elementos cribosos aun eran inmaduros, Samanani et al. (2002 y 2006) analizaron
ejemplares con grados de madurez completos. Los autores por su lado también atribuyen
diferencias en los métodos y técnicas de estudio, así como en las variedades de las plantas
analizadas por ejemplo la variedad de pobreza en morfina vs silvestre, así como en las
condiciones de cultivo (controladas vs campo). En todo caso surge la pregunta ¿La biosíntesis de
alcaloides en P. somniferum ocurre durante su desarrollo en diferentes sitios? Esta interesante
discusión entre el grupo de P. Facchini y T. M. Kutchan, tiene en común la mención de que la
localización de los componentes del metabolismo de ABI está altamente compartimentada. A
su vez, la participación de los elementos cribosos en la biosíntesis de ABI rompe el paradigma
de que estas células solamente poseían un número limitado de proteínas requeridas para la
conservación celular y el transporte de solutos. En esta década, a los elementos cribosos
también se le han atribuido otras funciones fisiológicas que incluyen el transporte de
macromoléculas de información y la biosíntesis de ácido jasmónico, ácido ascórbico y
compuestos de defensa. Además Bock et al. (2002) señalan que BBE está también en los
idioblastos de las hojas.

Thalictrum flavum también produce y acumula abundantes cantidades de ABI tipo

protoberberina en distintas células de las raíces y rizomas. En raíces, los ABI se localizan en las
células maduras de la endodermis en el inicio del crecimiento secundario, mientras que los
transcritos génicos de nueve de las doce enzimas (TYDC, NCS, 6OMT, CNMT, NMCH, 4’OMT, BBE,
SOMT, CAS) implicadas en su biosíntesis están ubicados en la endodermis inmadura, periciclo y
en algunos casos en las células adyacentes corticales del meristemo apical. En tanto que, en los
rizomas los alcaloides se depositan en la médula y el cortex y los transcritos génicos de las nueve
enzimas en el protodermis del primordio foliar. Esto significa que los sitios de biosíntesis y
acumulación están separados espacialmente y que en distintas especies o en la misma pueden
participar distintos tipos de células.

La biosíntesis de ABI está compartimentada subcelularmente, las dos primeras partes de la ruta
de tirosina a (S)- norcoclaurina y de (S)-norcoclaurina a (S)-reticulina, se realizan en el citosol,
mientras que las rutas de diversificación en vesículas membranosas cuya independencia o
asociación al retículo endoplásmico está en plena discusión (Figura 3). Esta compartimentación
de enzimas, sustratos y productos implica la coordinación y regulación de la ruta lo que no
ocurriría si las enzimas y los sustratos se movieran libremente en el citosol.

Para la producción de alcaloides tipo benzofenantridina (sanguinarina) desde (S)-reticulina se

necesitan siete enzimas, cuatro de ellas (BBE, CFS, SPS y MSH), se localizaron (utilizando
gradientes de centrifugación con sacarosa) en fracciones de membranas con una densidad
específica de δ = 1,14 g/mL y solo una (P6H) estuvo asociada a una fracción de membrana con
una densidad de δ = 1,11 g/mL, consistente con la del retículo endoplasmático (RE). La enzima
STS que participa en la biosíntesis de alcaloides tipo morfina, y las enzimas (S)-
tetrahidroprotoberberina oxidasa (STOX), canadina oxidasa (CDO: CYp719A1) y (S)-adenosil-l-
metionina: columbamina-O-metiltransferasa participantes en la biosíntesis de alcaloides tipo
protoberberina se localizan también en fracciones microsomales con una densidad 1,14 g/mL.
La asociación de estas enzimas con fracciones de membrana de densidad más grande que las
del retículo endoplásmico es lo que permitió especular la presencia de “vesículas
biosintentizadoras de alcaloides (VSA)”. Estas vesículas se han encontrado en algunas especies
productoras de ABI (Annonaceae, Berberidaceae, Menispermaceae y Ranunuculaceae), en
Berberis y Coptis se observaron como agregados dentro de vacuolas pequeñas conteniendo
alcaloides y enzimas. Es interesante el hecho de que la adición de precursores a las vesículas dio
como resultado intermediarios avanzados de la ruta, y si además se suplementa con una sola
enzima (SOMT, que no estaba asociada a estos compartimentos), se encuentra una producción
de ABI congruente con la ruta.

Sin embargo, otros autores dudan de la autonomía de estas vesículas, argumentando que con
excepción de la BBE, las enzimas mencionadas, son dependientes del citocromo P450, por lo que
se ha sugerido que son proteínas ubicadas (integrales o parciales) en las membranas del retículo
endosplásmico (RE) o en compartimentos derivados de este, asociadas a enzimas NAD (P) H
dependiente de citocromo P450 como donadora de electrones. Además el pH óptimo de BBE es
de 8,8, acorde al de las membranas del RE. Sin dejar de notar que la ubicación de los transcriptos
en otras células volvería complejo la independencia de compartimentos de biosíntesis.

Alcantara et al. (2005) utilizando centrifugación en gradiente de densidad y técnicas de

inmunolocalización, sitúo las enzimas NMCH y BBE en el retículo endoplasmático y COR en el
citosol de células de P. somniferum. En este mismo estudio se documentó que al contaminar los
cultivos celulares de P. somniferum con el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea, aumentaron
tanto las enzimas como el alcaloide sanguinarina, y que están asociados con el desprendimiento
de vesículas prolongadas desde el lumen del RE y a su vez conectadas con la vacuola central. En
estas extensiones también estuvieron presentes las enzimas NMCH y BBE, lo que permite
conjeturar que la biosíntesis de ABI está asociada al retículo endoplásmico.

Un hecho contundente es que los ABI se almacenan en vacuolas; los alcaloides berberina,
codeína, morfina, noscapina, papaverina, (S)-reticulina, sanguinarina, (S)- escoulerina y tebaína,
fueron encontrados en vacuolas de diferentes densidades en cultivos celulares de P. bracteatum
y Coptis japonica. En las vacuolas laticíferas de Chelidonium majus las concentraciones de
sanguinarina, chelidonina y berberina se aproximaron a 500 y 1000 mM, mientras que en las del
latex de P. somniferum a 500 mM de morfina y en vacuolas de células de Coptis japonica hasta
72 mM de berberina.

La participación de varios tipos de células y de orgánulos en la biosíntesis y acumulación de ABI

supone el transporte de sustratos, intermediarios y productos desde los sitios productores
(vesículas de RE de elementos cribosos y/o parénquima en P. somniferum) a los sitios de
depósito (vacuolas de células laticíferas). El transporte de metabolitos secundarios ha empezado
a ser sistemáticamente estudiado, algunas revisiones pueden leerse en Yazaki, 2005; Roytrakul
y Veepoorte, 2007; Yazaki et al. 2008.

Para los alcaloides bencilisoquinolínicos se han propuesto y documentado dos mecanismos de

transporte hacia las vacuolas y uno en el tránsito por la membrana plasmática. Matile (1984) y
Otani et al. (2005) señalan que algunos ABI pueden almacenarse en la vacuola mediante un
modelo simple causado por un gradiente de pH conocido como “trampa de iones”, proponen
que en el caso de alcaloides de carácter lipofílico y en una situación de pH neutro como la del
citosol, pueden cruzar el tonoplasto (membrana que delimita la vacuola celular) por difusión
simple, y una vez dentro debido al ambiente ácido que hay en ella y a la presencia de sales
inorgánicas se protonizan a cationes hidrofílicos lo que impide su regreso a través de la
membrana quedando atrapados en este compartimento. Un ejemplo de esto parece ocurrir con
sanguinarina (una molécula lipofílica) y con otros alcaloides no bencilisoquinolínicos (ajmalicina,
cinchonamina, colchicina, ergotamina, nicotina, vinblastina y vindolina, Revisado en Wink y
Roberts, 1998) (55). Otani et al. (2005) Señalan, por otra parte que el tráfico está asociado a un
mecanismo de transporte secundario utilizando el gradiente electroquímico de protones (H+ ),
estos investigadores sugieren que la berberina se mueve de esta forma a través del tonoplasto
mediante una proteína cotransportadora tipo antiporte, aprovechando la expulsión de un
protón para introducir el alcaloide a la vacuola con una Km de 43,7 mM.

Para el paso por las membranas plasmáticas se ha implicado la participación de proteínas

transportadoras ABC de la membrana impulsadas por ATP (ATP bindig cassette). El único
ejemplo es el paso de la berberina a través del plasmalema de células de Coptis japonica y de
Thalictrum flavum. Para C. japonica la proteína fue genéticamente caracterizada como CjMDR1,
dada su similitud con la familia de las proteínas transportadoras ABC fármaco resistentes (MDR
por sus siglas en inglés).

Estos estudios señalan que el transporte de berberina en las células ocurre mediante dos
mecanismos de transporte, uno impulsado por proteínas transportadoras ABC (intracelular) y el
otro por cotransportadores proton-antiportador (intercelular). Este último tipo de mecanismo
parece estar también implicado en el tráfico de (S)-reticulina y (S)- escoulerina en las vacuolas
de Fumaria capreolata.

EJEMPLOS DE ALCALOIDES BENCILISOQUINOLINADOS

Papaverina Noscapina

Apomorfina (one additional ring closure) Morfina (two additional ring closures)
 Berberina (one additional ring closure Protopina (with opened pyridine ring)
with incorporated N-methyl)

Tubocurarina (composed of two

benzylisoquinoline units)

CONCLUSIÓN

La biosíntesis de alcaloides bencilisoquinolínicos, implica una coordinación de varios procesos

biológicos tanto celulares como moleculares. La separación de estos eventos en tiempo y
espacio, deja ver un mecanismo regulatorio complejo, en el cual están implicados, genes,
enzimas, metabolitos secundarios, transportadores específicos, diferentes tejidos, células y
compartimentos. La visión que se tiene de ello todavía es parcial y fragmentaria, lo que a su vez
la convierte en un reto intelectual en el área del metabolismo especializado.
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