LA

FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTTICOS

C4

CAM

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC):

enzima clave de los metabolismos
fotosintticos C4 y CAM
CRISTINA ECHEVARRA*, JOS ANTONIO MONREAL,
ANA BELN FERIA, EDUARDO TERENCIO JIMNEZ,
ARANCHA LEN, ROSARIO LVAREZ
y SOFA GARCA-MAURIO
Resumen
La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) cataliza
la -carboxilacin del fosfoenolpiruvato (PEP) en presencia de HCO3- y Mg2+, para producir oxaloacetato (OAA) y Pi
(Chollet et al., 1996). La PEPC est ampliamente distribuida
en plantas, algas verdes y microorganismos pero ausente en
levaduras y animales (Chollet et al., 1996). En plantas vasculares su papel estelar est relacionado con la fotosntesis C4 y
CAM (Crassulacean acid metabolism), sin embargo desempea otras funciones como la anaplertica, en relacin a la
sntesis de protenas, homeostasis del pH citoslico, electroneutralidad y osmolaridad. Est formada por una pequea
familia multignica algunos de cuyos representantes estn
regulados a nivel transcripcional por factores como luz,
hormonas y metabolitos (Chollet et al., 1996; Vidal y Chollet,
1997). La naturaleza alostrica de la enzima permite una
regulacin fina en relacin a diferentes ambientes metablicos. La PEPC est regulada por fosforilacin reversible,
proceso ligado a una cascada de transduccin de seales de
alta complejidad. En la actualidad es uno de los mejores
modelos de sealizacin descritos en plantas. Este captulo
se centra en los eventos relacionados con este proceso en
plantas C4 y CAM, los dos sistemas mejor estudiados en la
actualidad (Chollet et al., 1996; Echevarra y Vidal, 2003; Izui
et al., 2004; Nimmo, 2000; Vidal y Chollet, 1997).

Summary
Phosphoenolpyruvate carboxylase (EC 4.1.1.31, PEPC) catalyzes the b-carboxylation of phosphoenolpyruvate (PEP) by
HCO3- in the presence of Mg2+ to yiel oxaloacetate and Pi
(Chollet et al., 1996). PEPC is a widely distributed enzyme
in plants, green algae and micro-organisms but absent in
yeast and animals (Chollet et al., 1996). In higher plants, it
catalyses a pivotal reaction related to such important processes as C4 and Crassulacean acid metabolism (CAM) photosynthesis, the anaplerotic pathway linked to amino acid
synthesis, homeostasis of cytosolic pH, electroneutrality and
osmolarity. PEPC belongs to a small multigenic family (Chollet et al., 1996; Vidal y Chollet, 1997). At the transcriptional
level, some PEPC genes respond to external and internal
factors (light, hormones and metabolites), while at the
* Departamento de Biologa Vegetal y Ecologa (rea de Fisiologa Vegetal).
Facultad de Biologa, Universidad de Sevilla, Avda. de la Reina Mercedes
n 6. 41012, Sevilla, Espaa.

protein level, the allosteric nature of the enzyme allows its

activity to be fine-tuned in relation to a varying metabolic
environment. PEPC undergoes a posttranslational control by
a phosphorylation process linked to a highly complex signal
transduction cascade. Today, it is one of the best-described
models of plant signaling. This chapter will focus on what is
known about these processes in leaves of C4 and CAM
plants, the two systems that have been studied in detail so
far (Chollet et al., 1996; Echevarra y Vidal, 2003; Izui et al.,
2004; Nimmo, 2000; Vidal y Chollet, 1997).

Caractersticas generales
Las plantas de tipo C4 poseen caractersticas anatmicas y bioqumicas que confieren lo que se conoce
como el sndrome C4. Cabe destacar como hecho
caracterstico la induccin de la maquinaria fotosinttica en la vaina vascular, un tipo de tejido que en las
plantas C3 no es fotosinttico. La vaina vascular en
las plantas C4 desarrolla cloroplastos atpicos ricos en
fotosistema I y que contienen la maquinaria necesaria
para la asimilacin del CO2, a saber, el ciclo de CalvinBenson o ciclo C3. En contrapartida las clulas del
mesfilo fotosinttico pierden alguna de sus funciones
fotosintticas y desarrollan cloroplastos ricos en fotosistema II pero deficientes en Rubisco. Estas clulas se
distribuyen formando una corona alrededor de la vaina
dando lugar a la anatoma Kranz, tpica de este tipo de
plantas. El ciclo C4 se desarrolla como va de comunicacin entre ambas clulas, y su fin ltimo consiste en
concentrar el CO2 en las inmediaciones de la Rubisco
para minimizar las prdidas ocasionadas por la fotorrespiracin (Hatch y Slack, 1970). A este hecho contribuye adems la fuerte impermeabilizacin de la vaina a la
difusin del CO2. Como consecuencia las concentraciones de CO2 que se consiguen en la vaina estn muy
por encima (2000 ppm) de las concentraciones de CO2
atmosfricas (360 ppm). Los metabolitos principales
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CRISTINA ECHEVARRA

ET AL.

que transportan carbono y poder reductor desde las

clulas del mesfilo a las de la vaina son el malato o el
aspartato segn la modalidad de planta C4 (Hatch y
Slack, 1970). En este contexto fotosinttico basado en
la separacin fsica de las enzimas y que implica un
intenso trfico intercelular de metabolitos, la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) inicia la
primera reaccin de la va metablica C4 en las clulas
del mesfilo (la carboxilacin del PEP) y es objeto de
un alto grado de regulacin. La figura 1 recoge estos
conceptos mostrando la anatoma Kranz de una hoja
de sorgo (una planta C4 del tipo NADP-ME) y un
esquema, marcado en rojo, de las reacciones que
comportan la va C4 en este subtipo fotosinttico.

Otra variante fotosinttica en la que interviene el

ciclo C4 es la que se da en las plantas CAM. En las
plantas CAM se reproduce el mismo ciclo C4; sin
embargo, la separacin de las dos carboxilaciones
es temporal. El mlico producido va PEPC se acumula en la vacuola durante la noche. Durante el
da es descarboxilado. El CO2 desprendido provoca el
cierre estomtico, minimizando la prdida de agua,
y un aumento de la concentracin de CO2 en las
inmediaciones de la Rubisco eliminando la fotorrespiracin. Finalmente, el CO2 es asimilado en el
ciclo de Calvin-Benson. La eficiencia hdrica de las
plantas CAM es an mayor que la de las C4 (Smith y
Winter, 1996).

FIGURA 1: a) Corte transversal de una

hoja de sorgo mostrando la anatoma Kranz; CM, clula del mesfilo;
CV, clula de la vaina; H, haces
vasculares; EP, epidermis, ES, estoma. b) Ciclo C4 en una planta del
tipo NADP-enzima mlico (NADPME). Lnea gruesa gris, pared celular
gruesa e impermeable que impide la
difusin de CO2 en las clulas de la
vaina. PEPC, fosfoenolpiruvato carboxilasa; MDH, malato deshidrogenasa; PPDK, piruvato fosfato diquinasa. Los datos de concentracin de
CO2 son los estimados para cada
tipo de clula.

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FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTTICOS

Las plantas C4 y CAM constituyen una de las

adaptaciones ms complejas y representativas de los
vegetales a condiciones de estrs (Sheen, 1999). Adems, aquellas que son facultativas cambiando de metabolismo fotosinttico C3 a CAM o a C4 en presencia de
un factor ambiental estresante (baja concentracin de
CO2, altas temperaturas, salinidad, fotoperiodo o condiciones nutritivas adversas), representan unos de los
ms singulares y mejor conocidos ejemplos de aclimatacin (Hasegawa et al., 2000; Lttge, 2004).
En este captulo profundizaremos en los aspectos
relacionados con la regulacin de la fosfoenolpiruvato
carboxilasa fotosinttica (PEPC) y en concreto en su
regulacin postraduccional por fosforilacin reversible.
La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC)
La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC
4.1.1.31) cataliza la -carboxilacin irreversible del
fosfoenolpiruvato (PEP) en presencia de HCO3- y Mg2+,
para producir oxaloacetato (OAA) y Pi (Chollet et al.,
1996). La PEPC fue caracterizada por primera vez en
hojas de espinaca en 1953, considerndose durante
mucho tiempo como una carboxilasa de plantas con
funcin secundaria con respecto a la Rubisco (Bandurski y Greiner, 1953). Sin embargo, el descubrimiento
de la fotosntesis C4 y la implicacin de una isoenzima
especfica de PEPC en esta ruta, aumentaron considerablemente el inters por esta enzima. Adems de su
implicacin en este contexto fotosinttico, la PEPC
tiene una multiplicidad de funciones en la clula.
Debido a la baja Km por el sustrato bicarbonato (en el
rango de molar) esta enzima interviene, como funcin
general, en la economa del carbono de la clula
recapturando el CO2 respiratorio. Como funciones
especficas se le asignan una funcin anaplertica, la
regulacin del pH celular, interviene en la fijacin de
nitrgeno en leguminosas, en la absorcin y transporte
de cationes, en el movimiento estomtico y en la
interaccin del tubo polnico y el estilo (Chollet et al.,
1996; Echevarra y Vidal, 2003; Izui, 2004). Tambin
ha sido implicada en la maduracin y germinacin de
la semilla (Osuna et al., 1996, 1999; Gonzlez et al.,
1998, Izui, 2004) y en la maduracin del fruto (Chollet
et al., 1996; Echevarra y Vidal, 2003; Izui, 2004).
Para satisfacer esta multiplicidad de funciones la
PEPC est formada por una familia multignica que
codifica diferentes isoenzimas. En Sorghum vulgare, por

C4

CAM

ejemplo, est representada por SvC3, PEPC constitutiva de Tipo-C3; SvC4, PEPC fotosinttica de Tipo C4; y
SvC3RI, PEPC de raz, inducible de Tipo C3 (Crtin et
al., 1991). Recientemente se ha descrito la existencia de
una PEPC de tipo bacteriano en Arabidopsis thaliana y
arroz (Snchez y Cejudo, 2003).
La PEPC es una enzima citoslica ampliamente
distribuida en plantas, algas verdes y microorganismos
pero ausente en levaduras y animales (Chollet et al.,
1996). Se organiza como un homotetrmero con subunidades de aproximadamente 110 kDa (Chollet et al.,
1996). La estructura tridimensional de la PEPC de E.
coli y maz muestra que las cuatro subunidades se
organizan en un dmero de dmeros y que todos los
determinantes estructurales importantes son semejantes
entre las dos enzimas (Matsumura et al., 2002), con la
notable diferencia de la adquisicin de un dominio de
fosforilacin en las PEPC eucariotas que est ausente en
la PEPC bacteriana (Snchez y Cejudo 2003; Vidal y
Chollet, 1997). Esta adquisicin ha resultado ser de
gran importancia ya que las PEPC de plantas estn
fuertemente reguladas por fosforilacin reversible
(Bakrim et al., 1993; Echevarra y Vidal, 2003). Tambin existen diferencias importantes entre la isoenzima
fotosinttica (tipo C4) y las isoenzimas de tipo C3. Uno
de los requerimientos bsicos que estn en la base de las
diferencias cinticas de estas isoenzimas es poseer una
Ser situada en la posicin 774 en la PEPC-C4, que en la
PEPC-C3 es una Ala (Blsing et al., 2000). Adems, el
segmento 296-437 (301-442 en maz) es tambin un
determinante crtico que caracteriza a las PEPC C4
(Izui et al., 2004).
Regulacin postraduccional de la PEPC
La coordinacin entre el ciclo C4 y el ciclo de
Calvin-Benson (ciclo C3) exige una fuerte regulacin de
la actividad de sus enzimas carboxiladoras. La PEPC
est regulada a nivel transcripcional por diferentes
factores entre los que destacan la luz, factores de estrs
(salinidad, estrs hdrico, nutricional), hormonas (ABA
y citoquininas) y fotoperiodo (revisado en Echevarra et
al., 2004). Sin embargo, en este captulo nos centraremos en la regulacin postraduccional de la PEPC
profundizando en su mecanismo de regulacin por
fosforilacin reversible y en algunos de los aspectos
novedosos que conciernen a la fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa (PPCK), as como a los elementos de
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CRISTINA ECHEVARRA

ET AL.

la cadena de transduccin de seales que opera para la

sntesis/activacin de esta enzima.
La PEPC est sujeta a regulacin alostrica. En
plantas dicotiledneas, la PEPC se activa por glucosa 6fosfato (G6P) y se inhibe por L-Malato o Aspartato
(Asp). En plantas monocotiledneas, adems de stos,
la Glicina o la Alanina son activadores (Chollet et al.,
1996; Izui et al., 2004). El L-malato interacciona con la
enzima en diferentes puntos, produciendo una inhibicin competitiva, no competitiva o mixta dependiendo
del pH, de la concentracin y del estado de fosforilacin de la PEPC (Chollet et al., 1996; Echevarra et al.,
1994). La G6P incrementa la Vmax de la PEPC produciendo una bajada de la Km para el PEP y disminuye el
efecto inhibidor del malato (Chollet et al., 1996).
Tanto la actividad cataltica como el control metablico
son altamente dependientes del pH, especialmente
cuando se ensaya a valores subptimos de 7,1 a 7,3
(Echevarra et al., 1994); as, la afinidad de la enzima
por PEP y Mg2+ aumenta fuertemente entre pH 7 y 8.
El pH ptimo de la actividad de la enzima ensayada in
vitro es de 8.
La PEPC C4 evolucion a partir de isoenzimas
ancestrales C3 durante la evolucin de las angiospermas, adquiriendo propiedades cinticas y de regulacin
distintas a las de las isoenzimas C3. As, para la
isoenzima fotosinttica C4 de maz encontramos valores
de Km para PEP, Mg2+, y HCO3- a pH 7,3 de 30, 10 y 2
veces superiores a los de la forma C3, respectivamente
(Dong et al., 1998).
La regulacin de la actividad de la PEPC est
influenciada por el estado oligomrico de la enzima,
siendo el tetrmero la conformacin ptima, seguida
del dmero, y con un monmero inactivo. Los cambios
en el estado de oligomerizacin estn propiciados por
factores como dilucin de la enzima, concentracin de
sales en el medio de ensayo, concentracin de L-Malato
o baja temperatura (Chollet et al., 1996). Sin embargo,
la contribucin real de esta regulacin a la actividad de
la enzima in vivo no est clara en plantas C4. Por el
contrario, en plantas CAM hay evidencias de que el
tetrmero actuara durante la fase nocturna asociado a
la fase activa de fijacin de CO2 (Chollet et al., 1996).
La abundancia de cistenas en la PEPC (7, en
posiciones altamente conservadas) hace pensar que la
actividad de la PEPC podra estar influenciada por el
estado redox de la enzima (Chollet et al., 1996). Sin
embargo, hasta la fecha no se ha descrito ninguna
cascada de xido/reduccin tipo ferredoxina/tiorredo88

xina implicada en la regulacin de la PEPC (Chollet et

al., 1996). En otro sentido, recientemente se ha descrito que productos como DTT, mercaptoetanol, o glutatin reducido, cambian dbilmente la sensibilidad de la
PEPC C4 al malato in situ (Pierre et al., 2004). Sin
embargo, ninguno de estos componentes tiene efecto in
vitro. El efecto observado no se debe a ningn proceso
mediado por tiorredoxina o dependiente de fosforilacin; sin embargo, debido a que el glutatin es un
compuesto fisiolgico que se encuentra en el citosol
principalmente en estado reducido, los autores proponen una posible contribucin de este compuesto tilico
a la proteccin de la enzima frente al mlico (Pierre et
al., 2004).
Regulacin de la PEPC por fosforilacin
reversible
La fosforilacin reversible de la PEPC fotosinttica
se puso de manifiesto en Bryophyllum y maz, plantas
CAM y C4 respectivamente (Chollet et al., 1996).
Estudios posteriores pusieron de manifiesto que la
fosforilacin de la PEPC depende de luz en plantas C4
(Echevarra et al., 1990) y de un oscilador circadiano
an sin identificar en plantas CAM (Nimmo, 2000).
En cualquiera de estos casos la fosforilacin de la PEPC
est asociada a la etapa activa de fijacin de CO2. Es un
mecanismo sinrgico que altera la regulacin metablica de sus efectores negativos, L-Malato, y positivo,
G6P, y la respuesta al pH (Echevarra et al., 1994). La
PEPC fosforilada es menos sensible a mlico, responde
mejor a G6P y es ms eficaz a pH subptimo pero
fisiolgico de 7 y 7,3 (Echevarra y Vidal, 2003).
La fosforilacin de la PEPC se produce en un
nico residuo de serina (Ser), localizado en el extremo
N-terminal de la protena. La Ser fosforilable reside en
el motivo E/DR/KxxS*IDAQL/MR, comn a todas las
enzimas de plantas secuenciadas hasta la fecha, pero
ausente en las PEPC de cianobacterias y en la PEPC de
tipo bacteriano de plantas (Chollet et al., 1996; Snchez et al., 2003). Este hecho sugiere que la regulacin
de la enzima por fosforilacin ocurre en los mltiples y
diversos contextos fisiolgicos donde la PEPC est
involucrada.
Los estudios de mutagnesis dirigida sobre una
PEPC C4 recombinante de sorgo, pusieron de manifiesto que el efecto de la fosforilacin puede ser simulado
por la introduccin de una carga negativa, sustituyendo

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FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTTICOS

el residuo de serina por aspartato (S8D) en el extremo

N-terminal de la protena. La incorporacin de una
carga negativa en dicho dominio se traduce en un
aumento de la velocidad cataltica y una disminucin
de la sensibilidad al L-Malato (Chollet et al., 1996). La
modificacin de las propiedades funcionales de la
PEPC tambin se consigue por la unin a la PEPC de
anticuerpos especficos dirigidos contra el pptido sinttico de 20 aminocidos del extremo N-terminal, que
contiene la secuencia del sitio de fosforilacin de la
enzima C4 de hojas de sorgo, denominados APS-IgG
(Pacquit et al., 1995). Estos anticuerpos imprimen una
distorsin en la molcula que simula la fosforilacin
(Pacquit et al., 1995). Otros tratamientos como la
sustitucin de un residuo bsico situado tres aminocidos antes de la Ser por Asn, o la eliminacin del
pptido N-terminal de la PEPC-C4 de maz con enteroquinasa mimetizan parcialmente el efecto de la fosforilacin (Izui et al., 2004).
La fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa
(PPCK)
La fosforilacin de la PEPC la realiza una protena
quinasa llamada PEPC-quinasa (PPCK). La PPCK es
altamente especfica, pertenece a la familia de las
quinasas Ca2+/calmodulina dependientes (CDPK) aunque no posee ninguna extensin N-terminal ni Cterminal que contenga motivos de regulacin como
sitios de unin a Ca2+ o secuencia autoinhibidora;
tambin carece de motivos de fosforilacin. Su actividad es independiente de Ca2+, y es la proteina kinasa
ms pequea conocida hasta la fecha con un peso
molecular de 32 kDa (Hartwell et al., 1999). Es la
primera quinasa descrita cuya regulacin se produce
por cambios rpidos en su velocidad de sntesis, con
una velocidad de recambio de 2 h (Hartwell et al.,
1999; Jiao et al., 1991). Las PEPC-quinasa de Flaveria
y de M. crystallinum contienen una secuencia especfica
(GAA, ATAGAT y elementos GTA) en la regin 3 no
codificante, determinantes para los ARNm de vida
corta, por lo que se les supone una tasa de recambio
rpida para el ARNm (Tsuchida et al., 2001).
Las primeras PEPC-quinasas se clonaron a partir
de Kalanchoe fedltschenkoi y Arabidopsis en 1999 (Hartwell et al., 1999). En la actualidad se sabe que la PEPCquinasa est codificada por una pequea familia de
genes (Hartwell et al., 1999; Nimmo, 2003; Shenton et

C4

CAM

al., 2006). El genoma de Arabidopsis posee dos genes de

PEPC-quinasa, PPCK1 y PPCK2, siendo PPCK1 el
que se expresa de forma ms abundante en las hojas de
la roseta (Fontaine et al., 2002; Nimmo, 2003). En
tomate, la expresin de PPCK2 aumenta considerablemente durante la maduracin del fruto (Marsh et al.,
2003). Tambin se han encontrado representantes de
estas dos isoenzimas en berenjena y tabaco (Marsh et
al., 2003) y en F. trinervia (Nimmo et al., 2003;
Echevarra y Vidal, 2003; Izui et al., 2004). En soja se
han identificado cuatro representantes de PPCK (Sullivan et al., 2004). Dos de las isoformas (GmPPCK2 y
GmPPCK3) se expresan preferentemente en el ndulo
dependiendo del aporte de fotosintatos desde la raz
(Sullivan et al., 2005; Xu et al., 2003, 2007).
Los productos de la traduccin de los ADNc de los
genes PPCK constan de 274-307 residuos de aminocidos, y poseen una masa molecular de 31-33 kDa. Al
alinear secuencias de PEPC-quinasa, se observa que los
subdominios IV, V y VIA son muy variables mientras
que los X y XI estn muy conservados y son caractersticos de esta enzima (Izui et al., 2004).
En especies C4 se han identificado varios representantes de PEPC-quinasa. En F. trinervia se ha identificado un gen PPCK que se expresa fuertemente en hojas
en respuesta a la luz (Tsuchida et al., 2001), mientras
que su expresin en otros tejidos es muy escasa, por lo
que se cree que este gen codifica la PPCK C4 que
fosforila a la PEPC fotosinttica (Shenton et al., 2006).
En maz se han identificado cuatro genes que codifican
para PPCK, denominados ZmPPCK1-4 (Shenton et
al., 2006). ZmPPCK1 se expresa preferentemente en
respuesta a luz en las clulas del mesfilo de hojas,
mientras que ZmPPCK2 se expresa en luz y oscuridad
en clulas de la vaina y no parece estar sometido a
regulacin circadiana. Los otros dos genes de PPCK de
maz se expresan en menor nivel y en otros tejidos de la
planta (Shenton et al., 2006). En sorgo, se han descrito
SbPPCK1 y SbPPCK2, equivalentes a ZmPPCK1 y
ZmPPCK2. Las protenas PPCK1 y PPCK2 de sorgo
poseen un 92 % y un 90% de identidad de aminocidos con las quinasas 1 y 2 de maz respectivamente.
Adems, la expresin de SbPPCK1 aumenta de forma
drstica en respuesta a luz, mientras que la respuesta de
SbPPCK2 a los cambios luz/oscuridad es menor. Estos
resultados muestran que los genes ZmPPCK1 y
SbPPCK1 codificaran para la PPCK1, que estara
considerada como la PPCK fotosinttica que opera en
el ciclo C4 (Shenton et al., 2006). Las protenas PPCK2
89

CRISTINA ECHEVARRA

ET AL.

y 3 de maz y la 2 de sorgo son muy parecidas entre s,

y se diferencian del resto de miembros de la familia
PEPC-quinasa en que contienen una insercin cida de
longitud variable entre el dominio VIb y VII del
dominio cataltico quinasa (Shenton et al., 2006).
Cadena de transduccin de seales
que conduce a la sntesis/activacin
de la PEPC-quinasa
La PEPC-quinasa est regulada principalmente a
nivel transcripcional (Hartwell et al., 1999). En plantas
C4, la PEPC-quinasa se activa durante el da en respuesta a una alta intensidad luminosa, a travs de una
cadena de transduccin de seales de la que se conocen
numerosos componentes (Coursol et al., 2000; Echevarra y Vidal, 2003; Giglioli-Guivarch et al., 1996;). En
plantas CAM, la sntesis de la PEPC-quinasa depende
de un oscilador circadiano que acta en conjuncin
con el malato (Nimmo, 2000). En el caso de las plantas
CAM, el L-Malato se libera de la vacuola al citosol
durante el da, disminuyendo la expresin del gen
PPCK, la actividad PEPC-quinasa y el estado de fosforilacin de la PEPC, proceso que se revierte en oscuridad (Bakrim et al., 2001) siguiendo un ritmo circadiano (Nimmo, 2000 y 2003).
La cintica de aparicin de la actividad PPCK en la
hoja de maz (planta C4) es relativamente lenta, con un
mximo de actividad despus de 90 min de iluminacin (Echevarra et al., 1990). La inhibicin de este
proceso por CHX sugiere la implicacin de una neosntesis de la enzima como elemento de la cadena de
transduccin que conduce a la fosforilacin de la PEPC
in vivo (Hartwell et al., 1999; Jiao et al., 1991) o in
situ, en los protoplastos de clulas del mesfilo de
Digitaria (Giglioli-Guivarch et al., 1996).
La fotoactivacin de la PEPC-quinasa C4 est
mediada por la fotosntesis, ya que se inhibe en presencia de inhibidores del flujo fotosinttico de electrones
(DCMU), de desacoplantes y tambin de inhibidores
del ciclo de Calvin (Chollet et al., 1996; Echevarra y
Vidal, 2003 Vidal y Chollet, 1997). Resultados obtenidos en protoplastos de clulas del mesfilo ponen de
manifiesto que la basificacin del pH y la presencia de
Ca2+ son elementos indispensables para la fotoinduccin de la actividad PEPC-quinasa, as como para la
fosforilacin in situ de la PEPC. En este sentido, se ha
sugerido que el cido 3-fosfoglicrico (3-PGA) es el
90

metabolito mensajero que produce la regulacin positiva de la quinasa en plantas C4 (Giglioli-Guivarch et al.,
1996). En las hojas C4 iluminadas, este metabolito es
producido en el ciclo de Calvin en los cloroplastos de
las clulas de la vaina y difunde a las clulas vecinas del
mesfilo, donde se transporta al cloroplasto en su
forma parcialmente protonada. Existen evidencias que
apoyan que este proceso de bombeo de protones, y la
consecuente alcalinizacin del citosol es, de hecho, lo
que dispara la transduccin de seales para la sntesis de
la quinasa en las clulas del mesfilo C4 (GiglioliGuivarch et al., 1996). La secuencia de acontecimientos de esta cadena de transduccin de seales en hojas
C4 implicara los siguientes elementos: i) la luz, a una
intensidad luminosa superior a 200 E m-2 s-1; ii) el 3PGA, producido en el ciclo de Calvin y que es
transportado al mesfilo actuando como mensajero
intercelular; iii) la basificacin del pH citoslico; iv) la
participacin de una fosfolipasa C dependiente de
inositol (PI-PLC) (Coursol et al., 2000) y produccin
de inositol trifosfato (IP3); v) apertura de canales de
Ca2+ del tonoplasto (sensibles a TMB8) y activacin de
una quinasa Ca2+-dependiente (inhibida por W7), con
caractersticas de protena quinasa C (PKC) (Coursol et
al., 2000; Echevarra y Vidal, 2003; Giglioli-Guivarch
et al., 1996; Osuna et al., 2004); vi) sntesis de la
PEPC-quinasa; vii) fosforilacin de la PEPC, hecho a
su vez modulado por una regulacin metablica (Lmalato y G6P) y por el pH (Echevarra et al., 1994).
Adems, resultados recientes de nuestro grupo han
mostrado que en la cadena de transduccin de seales
hay otra fosfatasa implicada (datos no publicados). Esta
fosfatasa sera de tipo 2B o 2C, ya que no es sensible al
cido okadico ni a la microcistina-LR (inhibidores
especficos de PP2A).
Segn estudios realizados en protoplastos y hojas
de M. crystallinum, existe una cascada de transduccin
similar a la de plantas C4 en plantas CAM (Bakrim et
al., 2001; Taybi et al., 1999). En ellas, el incremento de
pH desencadenante de la sealizacin, que permitira la
expresin del gen PPCK, sera el resultado del transporte de cido mlico a la vacuola durante la noche.
Cuando el malato se libera de la vacuola al citosol
durante el da, la expresin y actividad de la quinasa y el
estado de fosforilacin de la PEPC disminuyen (Coursol et al., 2000; Giglioli-Guivarch et al., 1996; Vidal y
Chollet, 1997). En las plantas CAM, el malato producido por la PEPC citoslica durante la noche se
transporta activamente a la vacuola. Este transporte se

LA

FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTTICOS

realiza por ATP-asas de H+ del tonoplasto que establecen un gradiente electroqumico de H+ a travs de la
membrana cuando los protones son bombeados a la
vacuola (Cushman y Bohnert, 1999). Puede ser que
este proceso produzca la alcalinizacin del citosol en
las clulas del mesfilo de hojas CAM. Apoyando
esto, se ha visto que el pH citoslico del mesfilo en la
planta CAM Kalanchoe daigremontiana aumenta
aproximadamente en 0,3 unidades durante la ultima
fase da/principio de oscuridad.
Los metabolitos, adems de regular la sntesis en
plantas CAM (Nimmo, 2003), tambin tienen efectos
en algunas plantas C3 y C4. Por ejemplo, plantas de
tabaco a las que se les suministra malato por corriente
transpiratoria, reducen los niveles de actividad y de
transcritos de la nitrato reductasa, que a su vez estn
coordinados con los de PEPC y PEPC-quinasa (Nimmo, 2003). En ndulos, el gen de PPCK se expresa en
funcin de los fotosintatos translocados por la hoja,
siendo la PEPC fosforilada durante el ciclo de luz,
coincidiendo con el mayor aporte de fotosintatos (Nimmo, 2003; Xu et al., 2003).
Numerosos estudios realizados en hojas de plantas
C3 y en rganos no fotosintticos indican que en estas
plantas y rganos C3, la activacin de la PPCK tambin
ocurre por sntesis proteica a travs de una cadena de
sealizacin que comparte numerosos elementos con la
descrita en las plantas C4 y CAM, con la notable
excepcin de la activacin de la PPCK de semillas de
trigo y cebada durante la germinacin (Osuna et al.,
1999). As, en protoplastos de clulas del mesfilo de
Arabidopsis se ha comprobado que la expresin de
PPCK1 (la PPCK especfica de la roseta) se activa por
luz e implica el ciclo de los fosfoinostidos, flujos de
calcio desde la vacuola al citosol, y la regulacin
positiva de la PEPC-quinasa mediante el aumento en la
tasa de renovacin (Gousset-Dupont et al., 2005).
Adems, esta cascada es dependiente de fotosntesis. Sin
embargo, en plantas y rganos C3 se han descrito
algunas variantes. Por ejemplo, en hojas cortadas de
tabaco, el aumento de actividad PEPC-quinasa se
bloquea por inhibidores de la fotosntesis y por CHX,
pero tambin por inhibidores de la glutamina sintetasa
(Li et al., 1996). Esta inhibicin se revierte parcial y
especficamente al aplicar glutamina exgena a las
hojas, lo que induce a los autores a concluir que la
PPCK se activa por luz en plantas C3 mediante una
ruta similar, pero no idntica, a la que ocurre en maz.
En protoplastos del mesfilo de cebada, se ha observa-

C4

CAM

do que la fosforilacin de la PEPC dependiente de luz

se modula por sntesis proteica y por calcio, sin embargo, esto ocurre sin una fluctuacin asociada de los
niveles de PEPC-quinasa, que se detecta siempre (Smith et al., 1996). Otra variante importante es la definida
por nuestro grupo. En trabajos realizados con semillas
de trigo y cebada hemos puesto de manifiesto la
fosforilacin de la PEPC durante la germinacin. Sin
embargo la activacin de la PPCK, inactiva en la
semilla seca, no se produce por sntesis proteica (Osuna
et al., 1996 y 1999) sino por un aumento en la relacin
G6P/malato que se produce en las primeras horas de la
germinacin (Feria et al., 2005).
Recientemente, los trabajos de Sullivan et al.
(2004) describen un gen de PPCK de soja (PPCK4),
una planta C3, que se regula de forma circadiana en hojas pero no en races. Comprueban que el gen del reloj
circadiano LHY/CCA1 se expresa tanto en hojas como
en races siguiendo el ciclo normal, lo que indica que el
reloj funciona en ambos rganos, pero slo est conectado a la expresin del gen PPCK4 en las hojas. En este
trabajo se describe por primera vez la expresin de un
gen PPCK bajo un control circadiano en una planta que
no es CAM y, adems, ese control es dependiente del
rgano de la planta (Sullivan et al., 2004 y 2005).
Finalmente, en arroz, se ha descrito recientemente
un nuevo mecanismo en el control de la expresin de
uno de los genes de PPCK, en concreto OsPPCK2. Este
mecanismo se ha llamado iniciacin alternativa de la
transcripcin, y consiste en la expresin de dos transcritos distintos a partir del mismo gen (Fukayama et al.,
2006), uno ms corto y otro ms largo (OsPPCK2-S y
OsPPCK2-L respectivamente). La expresin diferencial
de este gen en respuesta a la nutricin por fosfato y
nitrgeno sugiere que la iniciacin alternativa es un
mecanismo de regulacin de la PPCK2 con significacin fisiolgica (Fukayama et al., 2006).
Otros mecanismos de regulacin de la PPCK
Aunque la sntesis/degradacin de la PEPC-quinasa representa el mecanismo principal de regulacin,
existen otros factores que pueden regular la actividad de
la enzima. En este sentido, la PEPC-quinasa est
regulada por el pH, siendo su ptimo in vitro de 8
(Chollet et al., 1996; Echevarra et al., 1994). Adems,
la fosforilacin de la PEPC en ensayos reconstituidos
con PEPC-quinasa est regulada por metabolitos
91

CRISTINA ECHEVARRA

ET AL.

(Echevarra et al., 1994). La fosforilacin es inhibida por L-Malato (Echevarra et al., 1994). Esta inhibicin por L-Malato es revertida en presencia de G6P
(Echevarra et al., 1994; Chollet et al., 1996; Echevarra
y Vidal, 2003). La base de este mecanismo sera un
cambio de conformacin de la PEPC en presencia de
estos metabolitos y no una accin directa de ellos sobre
la actividad PEPC-quinasa (Chollet et al., 1996; Echevarra et al., 1994; Echevarra y Vidal, 2003). Esta
regulacin por metabolitos de la fosforilacin de la
PEPC tambin ocurre durante el desarrollo, maduracin y germinacin de semillas de cebada y de sorgo
(Feria et al., 2005; Osuna et al., 1999).
Recientemente se ha aislado un inhibidor de la
PEPC-quinasa de hojas de plantas C4 (en maz) y CAM
(en K. fedtschenkoi). Su naturaleza es proteica (100
kDa), y se une por interaccin directa inhibiendo el
nivel basal de PEPC-quinasa existente en condiciones
bajo las cuales no se requiere un flujo rpido de
carbono a travs de la PEPC (Nimmo et al., 2001). Por
el momento no parece estar directamente implicado,
como elemento esencial, en la regulacin luz/oscuridad de la actividad PEPC-quinasa C4 o de la regulacin
circadiana de la PEPC-quinasa de plantas CAM.
Por otra parte, los trabajos de Saze et al. (2001)
muestran que la PPCK de maz se inactiva in vitro en
condiciones semi-oxidativas, y se reactiva eficientemente por una reduccin mediada por tiorredoxina. Adems, observan el mismo fenmeno con la PPCK de F.
trinervia (Saze et al., 2001). Sin embargo, no han
obtenido evidencias de que el mecanismo sea operativo
in vivo o que est implicado en la regulacin circadiana
de la PPCK, ni en plantas C4 ni en CAM.
Otro mecanismo implicado en la regulacin de la
PPCK podra provenir de la interaccin con su sustrato, la PEPC. En este sentido, se ha constatado que
cuando se utiliza como sustrato de la fosforilacin un
pptido sinttico de 20 aminocidos que contiene el
dominio de fosforilacin de la PEPC, la eficiencia de la
fosforilacin por la PPCK es muy baja. Estos resultados
sugirieron la existencia de un sitio secundario de
interaccin con la PPCK. Este segundo sitio de interaccin es, al menos in vitro, el extremo C-terminal de la
PEPC (lvarez et al., 2003). Resultados recientes obtenidos por nuestro grupo mostraron que un pptido
sinttico que contiene los ltimos 19 aminocidos del
extremo C-terminal de la PEPC, inhibe in vitro la
fosforilacin de la PEPC por la PPCK, aportando
la primera evidencia de que la alta especificidad de la
92

PEPC-quinasa por la PEPC, podra provenir de la

interaccin con el dominio C-terminal hidrofbico de
su sustrato (lvarez et al., 2003).
Regulacin de la PPCK en condiciones
de estrs
Las plantas C4 y CAM son conocidas por tener una
eficiencia hdrica superior a la de las plantas C3 (Smith y
Winter, 1996). Adems, son plantas muy competitivas
en ambientes salinos (Echevarra et al., 1988; Hasegawa, 2000). La contribucin de la PEPC a esta respuesta al estrs salino se demostr en algunas especies
C4 como el sorgo (Amzallag et al., 1990), y tambin en
especies C3 (Popova et al., 1995), con un aumento de la
actividad PEPC. Tambin se ha mostrado un aumento
de la actividad PEPC en ndulos tratados con diferentes concentraciones de sal (Soussi et al., 1998). En la
planta halfita Mesembryanthemum crystallinum la salinidad induce la transcripcin y la actividad de la PEPC
y del metabolismo CAM. Sin embargo, curiosamente,
el promotor de la PEPC de Mesembryanthemum crystallinum expresado en plantas transgnicas de tabaco no
es inducible por sal (Cushman et al., 1993).
En la actualidad se sabe que el estrs salino
conlleva un incremento de PEPC y paralelamente un
aumento de actividad nocturna de la PPCK Ca2+independiente, en plantas CAM (Chollet et al., 1996).
Estudios realizados en la planta Clusia, con patrones
fotosintticos entre C3 y CAM constitutivo, han podido demostrar que la expresin de la PEPC es el factor
primario determinado por la capacidad genotpica del
CAM y que la abundancia de transcritos de PPCK
regulados durante el da y la noche (alto durante la
noche) es ms bien la consecuencia del funcionamiento
del CAM y de la fluctuacin diurna de metabolitos
(Taybi et al., 2004). Si bien se sabe que la expresin de
la PEPC en la induccin del CAM por salinidad u otros
factores de estrs es tambin producida por ABA (Taybi
et al., 2002), no existen datos sobre la participacin de
esta hormona en la expresin de la PPCK.
La induccin de la PEPC y de la PPCK en el
metabolismo CAM est bien documentada (Taybi et
al., 2002; Nimmo, 2003); sin embargo, existen pocos
trabajos sobre la contribucin del mecanismo de fosforilacin de la PEPC a la adaptacin o tolerancia a la
salinidad, y en general a otros estreses, en plantas C4.
Este concepto es tanto ms importante cuanto que es

LA

FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTTICOS

conocido que en la planta C4 la fosforilacin de la

PEPC responde del 85% de la eficacia fotosinttica
(Bakrim et al., 1993; Nimmo, 2000).
Los primeros resultados publicados sobre el efecto
de la salinidad en la PPCK y en la fosforilacin de la
PEPC en una planta C4 fueron obtenidos por nuestro
grupo y derivan del hallazgo de un espectacular aumento de la actividad de la PPCK en extractos crudos de
plantas de sorgo aclimatadas a concentraciones crecientes de NaCl (172 y 258 mM NaCl). Este aumento de
PPCK repercute en un incremento de la fosforilacin
in vivo de la PEPC, sin embargo los niveles de PEPC
no se ven alterados (Echevarra et al., 2001). El efecto
sobre la PPCK es independiente del estrs osmtico; se
debe a la toxicidad inica siendo tambin promovido
por Li+ (Garca-Maurio et al., 2003), y no es promovido por la aplicacin de ABA exgeno bien a cultivos
hidropnicos o por pulverizacin foliar (Echevarra et
al., 2001). Por ltimo, el tratamiento con NaCl aumenta la actividad PPCK de hojas de sorgo en oscuridad en un proceso que depende de sntesis proteica.
Este es el primer contexto metablico en el que se
induce la sntesis de la PPCK en oscuridad, en una hoja
de planta C4. La consecuencia de este hecho es un
considerable aumento de la concentracin de malato en
oscuridad adems de un incremento de malato en luz
respecto de las plantas controles. La ausencia de fijacin
nocturna de CO2 parece indicar que la planta C4 en
condiciones de estrs severo, al igual que algunas C3,
podra manifestar un CAM-latente con un aumento de
los niveles de malato tanto nocturnos como diurnos
(Garca-Maurio et al., 2003). Adems del estrs salino
se han descrito resultados sobre un aumento de la
PPCK en aire libre de CO2, en plantas CAM (Nimmo,
2000) y en estrs oxidativo (Izui et al., 2004).
En conjunto estos resultados indican que la participacin de la PEPC en situaciones de desecacin,
salinidad, o CO2 limitante, se puede establecer por una
regulacin del nivel de fosforilacin de la enzima
destacando el papel de la PPCK como enzima implicada en mecanismos de tolerancia al estrs.
Regulacin de la degradacin
de la PEPC-quinasa
El protagonismo en los estudios de la PPCK ha
estado centrado en la regulacin de la sntesis de la
enzima y de la cadena de transduccin de seales que

C4

CAM

conduce a la sntesis/activacin tanto en plantas C4

como CAM. Este hecho est justificado porque la
sntesis de la PPCK es el elemento principal de la
regulacin circadiana de la actividad PPCK en estas
plantas. En este sentido se le ha prestado muy poca
atencin a la regulacin de la degradacin y a los
mecanismos implicados. Los resultados obtenidos por
el grupo de Izui (Agetsuma et al., 2005), utilizando una
PEPC-quinasa recombinante de F. trinervia expresada
transitoriamente en protoplastos de clulas de mesfilo
de maz, sugieren que la PEPC-quinasa puede ser
degradada va ubiquitina-proteasoma. Sin embargo, los
experimentos realizados con anticuerpos anti ubiquitina en los que utiliza extractos crudos o PPCK purificada de hojas de maz no le han permitido mostrar que la
PPCK de la planta est ubiquitinada, sugiriendo que
pueda ser debido a una falta de afinidad del anticuerpo
o a la poca abundancia de esta protena. Resultados
recientes obtenidos por nuestro grupo muestran que en
hojas de sorgo la degradacin de la PPCK est regulada
por ABA en un proceso que podra estar mediado por
el proteosoma. Tanto el ABA como el inhibidor
MG132, infiltrados a hojas o a discos de hojas inhiben
la degradacin de la PPCK. Estas son la primeras
evidencias mostradas en plantas de que la degradacin
de la PPCK podra regularse por un mecanismo en el
que estara implicado el ABA y el proteosoma (Monreal
et al., 2007a). La regulacin de la degradacin de la
PPCK podra tomar relevancia en contextos especficos
como plantas sometidas a estrs. En este sentido, hemos
obtenido evidencias de que en plantas tratados con Li+
el aumento espectacular de PPCK que se mantiene a
partir de 30 min de iluminacin es independiente de la
transcripcin de la PPCK va PLC, y se debe, en parte,
a la inhibicin de la degradacin (Monreal et al.,
2007b).
Otras vas alternativas de sealizacin
para la sntesis/activacin de la PPCK
Los trabajos realizados por nuestro grupo sobre la
cadena de sealizacin que conduce a la sntesis/
activacin de la PPCK en condiciones de estrs salino o
Li+ han aportado una nueva visin de esta sealizacin
y han abierto nuevas alternativas de gran importancia.
El hecho clave ha sido trabajar con discos de hojas en
contraposicin a los estudios clsicos de sealizacin
realizados en protoplastos de hojas. En este sistema, la
93

CRISTINA ECHEVARRA

ET AL.

fosforilacin de la PEPC no se inhibe en presencia de

TMB8 o verapamil (inhibidores de los canales de Ca2+
de los compartimentos endgenos como la vacuola)
sino que necesita la presencia de EGTA en el medio de
incubacin de los discos de hojas. Este experimento ha
puesto en evidencia por primera vez que la ruta de
sealizacin de la PPCK puede utilizar tanto el Ca2+
endgeno como el exgeno. Adems, en discos de hojas
y en hojas infiltradas, el inhibidor de la ruta de la PIPLC, el U73123, no inhibe por completo la activacin
de la PPCK como ocurre en protoplastos (Coursol et
al., 2000), indicando que la activacin de la PPCK
puede ocurrir por vas alternativas a la descrita hasta la
fecha en la que la sealizacin se produce por la va de
la PI-PLC. Estos resultados sugieren adems que los
canales de Ca2+ del plasmalema, poco activos en los
protoplastos, son funcionales en el sistema ntegro de
las hojas con una importante repercusin en los recursos de utilizacin de Ca2+ y en la versatilidad de la
respuesta de activacin de la PPCK. Tambin hemos
puesto en evidencia que el n-butanol (inhibidor de la
ruta de la fosfolipasa D) inhibe la sntesis de la PPCK

sugiriendo que la ruta de la fosfolipasa D (PLD) podra

representar una ruta alternativa o adicional de sealizacin. Otro mensajero de esta ruta como el cido
fosfatdico (PA) tambin parece intervenir; sin embargo
sern necesarios ms experimentos para consolidar estas
alternativas. Una hiptesis que pudiera integrar estas
posibilidades podra ser que la enzima de la cadena de
transduccin que es regulada por Ca2+ (inhibida por
W7) estuviera tambin regulada por PA, lo que podra
llevarnos a una quinasa del tipo protena quinasa C
(PKC). En plantas no existen PKC como tal pero s
CDPK que responden a estos criterios de regulacin,
las PKC-like (Hrabak et al., 2003). Una enzima de estas
caractersticas ha sido recientemente caracterizada en
hojas de sorgo (Osuna et al., 2004). Estudios realizados
en colaboracin con el Dr. Vidal muestran que esta
enzima est presente en las hojas de plantas C4 y que es
activada por Ca2+ y por PA. La figura 2 ilustra un
esquema hipottico de la organizacin de los diferentes
elementos nuevos que podra intervenir en la sealizacin de la sntesis de la PPCK en las clulas del mesfilo
incidiendo en los puntos de regulacin del Ca2+.

FIGURA 2: Posible papel del Ca2+ en

la sealizacin que controla la sntesis de la PPCK en las clulas del
mesfilo. Posible implicacin de la
PLD y de una PKC-like. CDPK, quinasa Ca2+ dependiente calmodulina
independiente; DAG, diacilglicerol; PLC, fosfolipasa C, PLD, fosfolipasa D; Ins (1,4,5)P3, inositol 1,4,5
trisfosfato; PA, cido fosfatdico;
Ptdlns(4,5)P2 , fosfatidylinositol 4,5- bifosfato; PtdCho, fosfatidilcolina ; PEPC-OH y PEPC-OP, PEPC en
su forma desfosforilada y fosforilada respectivamente. PEPCk, fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa.
(Esquema adaptado de Vidal et
al., 2007. Calcium and the control
of C4 photosynthesis. Med. Sci.
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94

LA

FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA (PEPC): ENZIMA CLAVE DE LOS METABOLISMOS FOTOSINTTICOS

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