UVM campus Zapopan Universidad del Valle de México

Práctica número 9: Cuantificación de muestras de DNA genómico y determinación de la

integridad por electroforesis

Ramírez Bazán Rogelio Antonio

Asignatura: Biología Molecular
Licenciatura QFBT
Periodo 2019-I
Fecha de entrega 10 de abril de 2019
Docente: Dra. Diana Laurenco
RESUMEN
La electroforesis es el proceso de movimiento de moléculas cargadas en una solución al aplicar un campo
eléctrico. La práctica consistió en realizar una electroforesis a muestra de ADN extraídas en prácticas
anteriores con el fin de observar la integridad de la muestra cualitativamente, los resultados obtenidos no
pudieron ser apreciados por la falta de manejo de material y la falla de fijación de la muestra en la agarosa.
palabras clave: ADN, electroforesis, espectrofotometría
INTRODUCCIÓN

Cuantificación de ADN contribuciones son más significativas

cuando se trata de oligonucleótidos y
Los ácidos nucleicos absorben
deben ser consideradas si se requiere
eficientemente luz ultravioleta debido a la
determinar correctamente la
presencia de bases aromáticas
concentración. (Atvars, T. D. 2002)
nitrogenadas a lo largo de las cadenas de
DNA. La absorción de UV de DNA es una Electroforesis
característica de la molécula, que es
La electroforesis es el proceso de
usada eficientemente para determinar su
movimiento de moléculas cargadas en
concentración. Cada una de las bases
una solución al aplicar un campo
tiene su propio y único espectro de
eléctrico. Debido a que las moléculas en
absorción y por lo tanto contribuye de
un campo eléctrico se mueven a una
manera diferente a la propiedad total de
velocidad dependiente de su carga,
absorción de UV de una molécula de
forma y tamaño, la electroforesis se ha
DNA.
desarrollado ampliamente para la
Para muchas aplicaciones, el porcentaje separación de diversas biomoléculas.
de contribución de cada una de las bases
Debido a que es una herramienta
al espectro de absorción de UV de una
analítica simple y relativamente rápida,
molécula de DNA de doble cadena de
se utiliza para el análisis y la purificación
alto peso molecular (dsDNA) puede ser
de moléculas grandes como proteínas y
ignorado. Sin embargo, esas
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ácidos nucleicos o de moléculas supone una herramienta indispensable

pequeñas como azúcares, aminoácidos, en gran cantidad de técnicas de biología
péptidos y nucleótidos. (Fierro, F. F. molecular, bioquímica y biología celular.
2014) Su uso más extendido es para construir
geles que permitan separar moléculas de
Agente caotrópico
ADN mediante electroforesis, además de
Un agente caotrópico es una sustancia ser utilizada para fijar moléculas a su
que desorganiza la red tridimensional del estructura como anticuerpos, antígenos y
agua influyendo en la organización de enzimas. Igualmente se utiliza para el
sus moléculas a través de sus enlaces de cultivo celular y en microbiología. Otros
hidrógeno, y en la interacción de estas usos menos extendidos son la utilización
con otros solutos como macromoléculas de estos geles como matrices en la
tales como proteínas, ADN o ARN, reparación de tejidos dañados. (Pérez, H.
tendiendo a desnaturalizarlas o M. G. 2000)
disolverlas.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Lo realizan actuando sobre las
Conocer los principios básicos de la
interacciones intramoleculares no
determinación de la concentración y
covalentes, que tendrían un papel
pureza del ADN por espectrofotometría y
estabilizador en la molécula; algunos ser capaz de describir y explicar esta
ejemplos de estas interacciones son los técnica, también determinar la integridad
puentes de hidrógeno, las fuerzas de van del ADN por electroforesis en
der Waals y las interacciones comparativa con un pb ADN Ladder.
hidrofóbicas. Algunos ejemplos son la
JUSTIFICACIÓN
urea, la tiourea o el cloruro de guanidinio.
(Efren, D. A. 1993) En biología molecular, una gran cantidad
de técnicas que se realizan comúnmente
Agarosa
requieren el uso de la electroforesis, por
La agarosa es un polisacárido formado lo que supone una parte importante del
por galactosas alfa y beta que se extrae procedimiento sistemático del análisis
de las algas de los géneros Gellidium y (separación, purificación, preparación)
Gracillaria. Es soluble en agua a de los ácidos nucleicos y las proteínas.
La mayoría de las biomoléculas poseen
temperaturas superiores a los 65 °C,
una carga eléctrica cuya magnitud
dependiendo del grado de sustituciones
depende del pH del medio en el que se
hidroxietílicas de sus cadenas laterales.
encuentran; como consecuencia, pueden
Sustituciones las cuales, se pueden desplazarse cuando se ven sometidas a
modificar para provocar que la un campo eléctrico hacia el polo de carga
temperatura de gelificación varíe entre opuesta al de la molécula.
los 17 y los 40 °C.
OBJETIVOS
La agarosa es un producto natural que
General
forma una matriz inerte y no tóxica que

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Analizar por métodos de absorbancia y a) Una vez polimerizado el gel, quitar la

electroforesis la pureza e integridad del cinta adhesiva y el peine con cuidado
DNA respectivamente. para no romper los pozos.
Específicos: b) Colocar el soporte del gel en la cubeta
de electroforesis. Los pozos deben estar
Comprender los fundamentos de la
cerca del cátodo (polo negativo de color
cuantificación de ADN por absorbancia
negro).
de ácidos nucleicos
c) Se añade el buffer TAE de tal forma
Comprender los fundamentos de la
que cubra bien el gel de agarosa.
electroforesis de ácidos nucleicos en
geles de agarosa d) Colocar en el primer pozo, 1 μl del
marcador de peso molecular 50bp DNA
HIPÓTESIS
Ladder. Posteriormente, colocar la
Al realizar un desplazamiento de cargas muestra preparada (ADN + 2 μl de
por electroforesis se podrá observar la loading buffer).
separación de pares de bases de una
e) Se tapa la cámara de electroforesis y
muestra de ADN.
se conectan los electrodos a la fuente de
MÉTODO poder. Se programa la fuente a 80 V por
aproximadamente una hora.
Preparación del gel de agarosa al 0.8%
f) Una vez terminada la electroforesis,
a) En un matraz de 100 ml, con una visualizar el ADN con la luz UV del
probeta colocar 30 ml de buffer TAE y transiluminador y tomar una fotografía de
0.24 g de agarosa. Disolver la agarosa la imagen.
con temperatura y agitación constante,
es importante cuidar la temperatura ya RESULTADOS
que la solución no debe llegar a
ebullición.
b) Añadir 5 μl de SYBR Safe, mezclar
perfectamente sin hacer burbujas y dejar
enfriar la solución de agarosa (aprox.
40°C).
c) Sellar con cinta adhesiva el soporte
donde se verterá el gel de agarosa y
colocar el peine que servirá para formar
los pocillos del gel. Imagen 1. Placa de agarosa observada
d) Verter la solución de agarosa con por transiluminador
bromuro de etidio en el soporte sellado. El la imagen 1 se puede observar en el
Se deja polimerizar el gel entre 20 y 30 primer canal nuestro pb ADN Ladder de
minutos. bases conocidas, mientras que en los
Electroforesis siguientes pocillos se colocaron las
muestras extraídas de ADN, pero por un
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mal manejo no entraron completamente CONCLUSIONES

en el pocillo y quedaron suspendidos en
Al no fijarse la muestra en la agarosa en
el buffer TAE, por lo cual, sin un
el proceso de la electroforesis, la
fijamiento en la agarosa, las cargas
arrastraron la muestra hacia el otro muestra del ADN fue arrastrado por las
extremo sin dejar marcado la posición de mismas cargas que se subministraron a
las pb. la cámara de electroforesis, estás,
llevaron las muestras hacia el otro
Análisis de resultados extremo, del lado positivo, por lo cual no
La técnica común para cuantificar el ADN se pudo apreciar en el transiluminador
y evaluar su pureza es por medición de las franjas separadas de los pares de
la absorbancia. La lectura de bases para comparar con el pb ADN
absorbancia se realiza a 260 nm (A260), Ladder.
longitud de onda en la que el ADN tiene
su máximo de absorción de luz. Referencias
Atvars, T. D., & Martelli, C. (2002).
El valor obtenido permite estimar la
Espectroscopia de luminescência. Revista
concentración en la solución. Para
Chemkeys, (2), 1-9. [consultado el 09 de abril de
asegurarse de que los números 2019] link:
obtenidos sean confiables, la lectura de https://econtents.bc.unicamp.br/inpec/index.php/
la A260 debe estar entre 0.1 y 1.0. chemkeys/article/view/9613

Sin embargo, el ADN no es la única Efren, D. A., Blasco, M. J., & Marin, C. (1993).
molécula que absorbe la luz UV a 260 [Goat brucellosis, serological
nm. El ARN también tiene absorbancia a diagnosis].[Spanish]. In Reunion Nacional de
Investigacion Pecuaria. Jalisco 1993.
260 nm, mientras que los aminoácidos
Guadalajara, Jal.(Mexico). [consultado el 09 de
aromáticos presentes en las proteínas
abril de 2019] link: http://agris.fao.org/agris-
absorben a 280 nm, contribuyendo a la search/search.do?recordID=MX19960045461
medición total a 260 nm si se encuentran
presentes en la solución. Fierro, F. F. (2014). Electroforesis de
ADN. Herramientas moleculares aplicadas en
La guanidina es un agente caotrópico ecología: aspectos teóricos y prácticos, 27.
comúnmente empleado en la extracción [consultado el 09 de abril de 2019] link:
y purificación del ADN que también http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/
710/electroforesis.pdf
incrementa la A260. Esto quiere decir que,
si solo se toma el valor de A260 para Pérez, H. M. G. (2000). Electroforesis en geles de
calcular la concentración, la cantidad de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e
ADN se sobreestimará. importancia. Universo Diagnóstico, 1(2), 31-4.
[consultado el 09 de abril de 2019] link:
El cálculo más común para evaluar la http://www.bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni
pureza consiste en determinar la relación 07200.htm?iframe=true&width=95%&height=95
entre la A260 y la A280. Un ADN de buena %
calidad deberá tener una relación
A260/A280 entre 1.7 y 2.0; cuanto menor
sea esta relación, mayor es la cantidad
de contaminantes presentes
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