NTC5021 PDF

NORMA TÉCNICA NTC
COLOMBIANA 5021
2001-12-19
CALIDAD DEL AGUA.

METODOS GENERALES CUALITATIVOS DE
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella
E: WATER. QUALITY. GENERAL QUALITATIVE ISOLATION

AND IDENTIFICATION PROCEDURES FOR SALMONELLA
CORRESPONDENCIA:
DESCRIPTORES: Salmonella en agua.
I.C.S.: 67.040, 07.100.20
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435
Prohibida su reproducción Editada 2002-01-31

PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional

de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector
gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los
mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 5021 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-12-19
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través
de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología.
3M COLOMBIA S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.

ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. POSTOBÓN
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS INDEPENDIENTE-BEATRIZ MACÍAS
S.A. INDEPENDIENTE-DIANA ZABALETA
AQUALAB INDEPENDIENTE-LILIANA BOCANEGRA
ASINAL LTDA. INDEPENDIENTE-MARCELA JOHANA NAVAS
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE INDEPENDIENTE-MARCELA ORJUELA
MICRIOBIOLOGÍA INDEPENDIENTE-MARÍA CLEMENCIA MORA
BIOCONTROL LTDA. INGENIO PICHICHI
BIOQWUILAB LTDA. INGENIO PROVIDENCIA
CALIDAD MICRIOBIOLÓGICA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO-
CARULLA VIVERO S.A. ICA
CERVECERÍA LEONA S.A. INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
COLOMBINA S.A. IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
CONSULTORÍAS MICROBIOLÓGICAS LESNIAK E.U.
COOPERATIVA DE GANADEROS DE MERCADEO DE ALIMENTOS DE
CARTAGENA LTDA. COLOMBIA S.A. - MEALS S.A.
CREPES & WAFFLES NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y NULAB LTDA.
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
FÁBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS LTDA.
EL REY S.A. QUIOS LTDA.
FRIGORÍFICOS SUIZOS S.A. VIKINGOS
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

siguientes empresas:
ALGARRA AVESCO LTDA

ASESORIAS MICROBIOLÓGICAS BAVARIA S.A.
CASA LUKER S.A. MAYAGUEZ S.A.
CENICAÑA MERCK COLOMBIA S.A..
COLSUBSIDIO MINISTERIO DE SALUD
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL
CONGELAGRO PASSIFLORA COLOMBIANA S.A.
CONSESIONARIO TIBITOC PROCESADORA DE LECHE S.A.
DISA S.A. PRODUCTORA DE JUGOS S.A.
FRIGORIFICOS COLOMBIANOS S.A. QUALA S.A.
HACIENDA SANTA HELENA RICA RONDO S.A.
INGENIO RIOPAILA S.A. TECNYCA LTDA
INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS-INVIMA PÚBLICA
LABORATORIO MICROBIOLOGIA PARA UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
LA CALIDAD DE LOS ALIMENTOS UNIVERSIDAD JAVERIANA
LABORATORIO PROCALIDAD UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
LABORATORIOS GRAM UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 5021
CALIDAD DEL AGUA.

METODOS GENERALES CUALITATIVOS
DE DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella
Advertencia. Para proteger la salud del personal de laboratorio, es esencial que los
ensayos de laboratorio para detectar Salmonella sean únicamente ejecutados en
laboratorios apropiadamente equipados, bajo la supervisión de un microbiólogo y/o
bacteriólogo experimentado, y que se tenga un gran cuidado en la disposición de todos
los materiales incubados.
1. OBJETO
Los métodos presentados a continuación para la detección de Salmonella en las aguas crudas,
tratadas y residuales, pueden necesitar modificaciones para adaptarlos a condiciones
particulares y se recomienda establecer comparaciones entre los métodos.
Más que un protocolo específico para la detección de Salmonella en el agua, se ofrece un

breve resumen de los métodos apropiados para la recuperación de dichos microorganismos.
Los métodos actualmente utilizados se han empleado en numerosas investigaciones de campo

para comprobar la presencia de Salmonella tanto en aguas dulces como saladas. La presencia
de esta bacteria en el agua es muy variable, existen limitaciones y variaciones tanto en la
sensibilidad como en la selectividad de los métodos aceptados para el aislamiento de la
Salmonella y la detección de los más de 2 300 serotipos del microorganismo actualmente,
reconocidos. Por tanto, un resultado negativo con cualquiera de estos métodos no significa la
ausencia de Salmonella ni la de otros patógenos.
2. DEFINICIÓN
Para los propósitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones:
2.1 Salmonella: bacteria gram negativa que forma colonias típicas sobre un medio selectivo,
el cual exhibe características bioquímicas y serológicas descritas en la presente norma.
2.2 Detección de Salmonella: determinación de la presencia o ausencia de Salmonella, en

una muestra particular de producto, cuando los ensayos son realizados de acuerdo con la
presente norma.
1
3. PRINCIPIO
3.1 Concentración de la muestra mediante métodos mecánicos, como el uso de torunda,

tierra de diatomáceas, filtro de membrana y muestreador para grandes volúmenes.
3.2 Pre-enriquecimiento con medio M-Endo MF, se utiliza este medio para el caso de agua
potable, cuando se usa la técnica de concentración de filtro de membrana.
3.3 Enriquecimiento en medio líquido selectivo, que permite el desarrollo del

microorganismo patógeno e inhibe el crecimiento de la flora acompañante.
3.4 Siembra en medio sólido selectivo diferencial, seleccionando tanto la temperatura de

incubación adecuada, como el medio de cultivo que permita efectuar la inhibición de la flora
acompañante y la diferenciación de Salmonellas con otras especies.
3.5 Identificación de colonias sospechosas mediante reacciones bioquímicas específicas.
3.6 Confirmación serológica a través de la aglutinación con sueros monovalentes y

polivalentes.
4. MEDIOS DE CULTIVOS, REACTIVOS Y ANTISUEROS
4.1 GENERALIDADES
En la NTC 4092 (ISO 7218) se presenta información sobre la práctica corriente de laboratorio.
4.2 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS
Nota 1. Debido al gran número de medios de cultivo y de reactivos, se considera preferible, para la claridad del texto,
dar su composición y preparación en el Anexo B.
4.2.1 Medio de enriquecimiento selectivo
Véase el numeral B.1.
4.2.2 Medios sólidos para aislamiento
4.2.3 Medios para pruebas bioquímicas
4.2.4 Medios para pruebas bioquímicas reacciones de fermentación
4.3 ANTISUEROS
4.3.1 Suero polivalente
4.3.2 Suero monovalente
2
5. APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO
Nota 2. Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material
de vidrio reutilizable.
Equipo usual de laboratorio microbiológico y, en particular, lo siguiente.
5.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN

HÚMEDO (AUTOCLAVE)
Véase la NTC 4092 (ISO 7218).
5.2 CABINA DE SECADO
Ventilado por convección, capaz de operar entre 37 °C ± 1 oC y 55 °C ± 1 oC.
5.3 INCUBADORA
Con capacidad de funcionar a 35 oC ± 2 oC.
5.4 BAÑO DE AGUA
Con capacidad de funcionar a 42,5 ºC ± 0,5 oC o incubadora, capaz de funcionar a 42 oC ± 0,5 oC.
5.5 MEDIDOR DE PH
Con precisión de calibración de ± 1 unidad de pH a 25 ºC.
5.6 BOTELLAS O FRASCOS PARA CULTIVO
Nota 3. Pueden usarse botellas o frascos para cultivo con tapa rosca metálica o plástica no tóxica.
5.7 TUBOS PARA CULTIVO
De 8 mm de diámetro y de 160 mm de longitud.
5.8 PIPETAS GRADUADAS
De capacidades nominales de 10 ml y de 1 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,5 ml

y 0,1 ml respectivamente.
5.9 CAJAS DE PETRI
6. MUESTREO
Para la toma de muestra y muestreo seguir los procedimientos descritos por el Standard
Methods Parte 9060 Capítulo 9-17 ó NTC-ISO 5667-3, NTC-ISO 5667-5 y NTC-ISO 5667-14
excepto para la técnica de concentración por torunda.
3
7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Se comienza el examen microbiológico de las aguas máximo 24 h después de su recolección.

Si se sabe que el resultado puede ser usado para una acción legal analizar la muestra antes de
6 h, manteniéndola refrigerada y con cadena de custodia
8. PROCEDIMIENTO
Véase el diagrama del Anexo A (Normativo)
8.1 TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN
En general, es necesario examinar una muestra relativamente grande de agua para encontrar
microorganismos patógenos aislados, que suelen existir en números escasos en comparación
con los coliformes, ya que su esporádica aparición esta relacionada con incidencia de
enfermedades o infecciones en un periodo determinado.
8.1.1 Técnica de la torunda
Se preparan torundas a partir de una gasa (estopila) de 23 cm de ancho, doblada cinco veces
en una longitud de 36 cm y se corta a lo largo, desde unos 10 cm de un extremo en tiras de
alrededor de 4,5 cm de ancho. Se asegura envolviendo el extremo no cortado o doblado de
cada torunda con un alambre de calibre 16 de forma que pueda suspenderse la torunda en el
agua. Pueden sustituirse las torundas por compresas de grosor similar (por ejemplo,
compresas de maternidad), o una alternativa comercial.
Se coloca la torunda en bolsas de papel fuerte de buena calidad y se esteriliza a 121 ºC

durante 15 min. Se colocan las torundas inmediatamente por debajo de la superficie de la
localización de la toma de la muestra durante 1 d a 3 d (la mayor exposición de las torundas no
produce mayor atrapamiento de patógenos). Durante la toma de la muestra, se concentran
partículas de materia y microorganismos procedentes del agua que pasa a través o sobre la
torunda. Tras la exposición, se retira la torunda, se coloca en una bolsa de plástico estéril y se
envía al laboratorio.
El tiempo máximo de conservación permisible es de 6 h. No se debe transportar en medios

enriquecidos; el transporte a temperatura ambiente puede dar lugar a una proliferación de
organismos competitivos suficiente para enmascarar a las Salmonellas.
En el laboratorio se coloca la torunda o porciones de ella en un medio de enriquecimiento.

Como las torundas están frías se deben atemperar junto con el medio en un baño de agua a
44,5 °C durante 5 min antes de meterlos en una incubadora de aire.
8.1.2 Técnica de tierra de diatomáceas
Se coloca una compresa absorbente (no un filtro de membrana) sobre el receptáculo del
portafiltro, se coloca el embudo y se añaden 2,5 g de tierra de diatomáceas estéril hasta llenar
completamente el cuello del embudo. Se aplica el vacío y se filtra 2 l de muestra. Tras la
filtración, se desarma el embudo, el “tapón” de compresa absorbente y la tierra de diatomáceas
que se forma, se divide en la mitad en condiciones asépticas con la ayuda de una espátula
estéril de borde afilado, y se añaden ambas partes al medio de enriquecimiento adecuado.
También puede colocarse la totalidad del tapón en el medio de enriquecimiento.
4
8.1.3 Grandes volúmenes de muestra
Para estudiar varios litros de muestra se utiliza un filtro formado por microfibras de vidrio
borosilicato con resina epóxica siempre que la turbidez de la muestra no limite la filtración. El
aparato consiste en un filtro de cartucho de 2,5 cm x 6,4 cm y un portafiltros. Se esteriliza en
autoclave a 121 ºC durante 15 min. Se coloca el instrumental de filtración estéril (conectado en
serie con una tubería a un deposito de 20 l de agua y a una bomba de vacío en el envase con
20 l de muestra adecuadamente graduado para medir el volumen realmente filtrado. Se aplica
el vacío y se filtra el volumen deseado.
Cuando se ha completado la filtración se extrae el filtro y se coloca en un medio de

enriquecimiento adecuado.
8.1.4 Técnica de filtro de membrana
Para estudiar aguas de escasa turbidez se filtran varios litros a través de una membrana estéril
de un diámetro de 142 mm y un tamaño de poro de 0,45µm.
En el caso de aguas turbias se hace un recubrimiento previo del filtro así:
Se prepara una suspensión de 1 l de tierra de diatomáceas estéril (5 g/l de agua destilada) y se

filtra alrededor de 500 ml, sin interrupción. Se procede a la filtración rápida de la muestra (1 l o
más) unida al resto de la suspensión. Al finalizar se coloca la membrana en una jarra
mezcladora estéril que contenga 100 ml de agua de peptona al 1 % estéril y se homogeneiza
adecuadamente durante un min. Se añade la totalidad del homogeneizado a 100 ml de medio
de enriquecimiento de doble concentración. También pueden utilizarse filtros de membrana
múltiple de 47 mm de diámetro para filtrar la muestra. Se sumerge cada membrana en
condiciones asépticas en 50 ml de medio de enriquecimiento selectivo de concentración
sencilla y se incuba.
La detección cualitativa de Salmonella en una agua potable sospechosa puede hacerse

también en cultivos M-Endo MF seleccionados (a partir de muestras de 100 ml ) en los que se
presentará un crecimiento significativo de Salmonella y de coliformes totales, tras acabar el
recuento habitual de coliformes, se sitúa todo el filtro en que se encuentra el crecimiento mixto
en 10 ml de medio líquido tetrationato (con 1:50.000 de colorante verde brillante) para
enriquecimiento de Salmonella antes de realizar el aislamiento diferencial de las colonias en
agar verde brillante. Este tipo de metodología no requiere muestras especialmente grandes y
puede considerarse como una extensión del análisis habitual de coliformes totales.
8.2 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO
Se enriquece de forma selectiva la muestra concentrada en un medio de crecimiento que inhiba

el desarrollo de las bacterias coliformes. El enriquecimiento de la muestra es esencial, ya que
habitualmente los patógenos se encuentran en escaso número y los medios selectivos sólidos
para el aislamiento de colonias son ligeramente tóxicos, incluso para los patógenos. No existe
un único medio de enriquecimiento recomendable que favorezca el crecimiento óptimo de
todos los serotipos de Salmonella. Para que la detección sea óptima se deben utilizar dos o
más medios de enriquecimiento selectivo. Las temperaturas elevadas de 40 °C, 41,5 °C y 43 °C y
la adición del medio colorante verde brillante ayuda a inhibir el crecimiento de la flora
acompañante y puede mejorar la detección de Salmonella, pero estas modificaciones pueden
inhibir también el crecimiento de algunos serotipos incluso Salmonella typhi.
5
8.2.1 Medio liquido de selenita cistina: inhibe el crecimiento de gram positivas y

enterobacterias no patógenas mientras permite la recuperación de la mayoría de Salmonellas
incluyendo S. typhi
Se realizan repiques de los tubos con turbidez varias veces durante el primer día y diariamente
hasta los 5 d para incrementar el potencial de recuperación de todos los serotipos que pueden
estar presentes. Se transfiere 1 ml del medio líquido de selenita a un nuevo tubo con el mismo
medio para continuar con la incubación y enriquecer el crecimiento de Salmonella aumentando
la recuperación.
Un tiempo de incubación óptimo para recobrar un máximo de Salmonella es de 48 h a 35° a 37 °C.
8.2.2 Caldo selenito F, permite la óptima recuperación de más especies de Salmonella

incluyendo S. typhi, después de 24 h de incubación a 35 °C - 37 ºC
Este incremento en la recuperación de Salmonella es acompañado por un ligero descenso en

la selectividad cuando se compara con el caldo selenito cistina.
Más significativo, es que el crecimiento de E. coli no es inhibido. Se repiten siembras de los

tubos que aparecen con turbidez desde el primer día y se permite la recuperación hasta por 5 d
para incrementar el porcentaje de recuperación de todos los serotipos que pueden estar
presentes.
Se transfiere 1 ml de caldo selenito a otro tubo con el mismo medio para continuar la
incubación y se enriquece más el crecimiento de Salmonellas y se realiza siembra por estría.
8.2.3 Caldo tetrationato, incubado a 35 ºC inhibe coliformes y bacterias gram positivas,

permitiendo un enriquecimiento selectivo de las especies de Salmonella, incluyendo S. typhi.
Ha sido reportado que el caldo tetrationato es más selectivo para Salmonella que el caldo basal
de selenito cuando es incubado por 48 h a 43 ºC.
Mientras esta formulación es fuertemente selectiva, esta es incapaz de inhibir a Proteus

mirabilis, el cual presenta un crecimiento óptimo.
El crecimiento de Proteus y Citrobacter pueden ser inhibidos con adición de agar verde brillante
(véase el numeral 8.3.1). El incubar a 43 ºC y adicionar verde brillante también puede inhibir
algunas especies de Salmonellas, incluyendo S. typhi
8.3 SIEMBRA EN MEDIO SÓLIDO SELECTIVO DIFERENCIAL
Se facilita una mayor separación de los patógenos del resto de bacterias no patógenas si se
hace una elección adecuada de la temperatura de incubación para el enriquecimiento primario,
seguido de una diferenciación secundaria en medios sólidos selectivos. Estos dos factores
temperatura de incubación y elección del medio, están relacionados entre sí. Ninguna
combinación es óptima para la recuperación de todos los tipos de Salmonella. Se deben
comparar las diferentes combinaciones para determinar la mejor en una circunstancia dada.
Los medios sólidos utilizados habitualmente para la detección de los patógenos entéricos
pueden dividirse en tres grupos:
a) Medios diferenciales con escasa o nula inhibición de bacterias no patógenas como

el EMB (que contiene sucrosa).
6
b) Medio selectivos con sales biliares o desoxicolato de sodio como inhidores, como
es el caso del agar de MacConkey, el agar desoxicolato o el agar Xilosa lisina
desoxicolato (XLD).
c) Medios selectivos que contienen verde brillante, como el agar verde brillante o
agar sulfito de bismuto. Independientemente, del medio elegido este debe inhibir al
máximo los coliformes a la vez que favorecer buena recuperación del grupo
patógeno. En caso de tener muestras con alta cantidad de microorganismos que
interfieren se recomienda sembrar dos cajas de diferente concentración de
muestra.
8.3.1 Agar verde brillante
En este medio crecen colonias típicas y bien aisladas de Salmonella que adoptan un color
blanco rosado con un fondo rojo. S. typhi y algunas otras especies de Salmonella crecen mal
debido al contenido de verde brillante. Los fermentadores de la lactosa que no resultan
inhibidos en su crecimiento dan lugar a la aparición de colonias grisáceas o de otras
coloraciones. En ocasiones, los fermentadores débiles de la lactosa (Proteus, Citrobacter y
Pseudomona) originan colonias semejantes a las de un patógeno. Puede inhibirse el
crecimiento expansivo de las Pseudomonas aumentando la concentración de agar al 2 %. En
algunos casos, se ha observado que Proteus tiende a “expandirse”, tendencia que puede
contrarrestarse con el uso de cajas con agar desecadas para eliminar la humedad de la
superficie. Si tras 24 h de incubación no aparecen las colonias esperadas de Salmonella, se
hace una reincubación de otras 24 h para permitir que los microorganismos de crecimiento
lento o parcialmente inhibido las desarrollen. Cuando no se encuentran colonias típicas o las
cajas sembradas aparecen con demasiados crecimientos, se hace un aislamiento puro de
algunas colonias para someterlas a análisis bioquímicos. Existe el riesgo de enmascaramiento
de las colonias no fermentadoras de la lactosa situadas a gran proximidad de las
fermentadoras.
8.3.2 Agar sulfito de bismuto (Medio de Wilson y Blair)
En este medio es de esperar un crecimiento abundante de muchas especies de Salmonella

(entre ellas S. typhi).
Se examinan las cajas de sulfito de bismuto a las 24 h de incubación y si no se encuentran

colonias se prolonga la incubación otras 24 h para que se desarrollen las cepas de crecimiento
lento. Las colonias típicas suelen desarrollar un color negro con o sin brillo metálico y es
frecuente que este ennegrecimiento se extienda más allá de la propia colonia para producir un
efecto de “halo”.
Pocas especies de Salmonella desarrollan una coloración verde, por lo que habrá que aislar
este tipo de colonias cuando falten las típicas. Como en el caso del agar verde brillante, la
coloración típica de las colonias puede verse enmascarada por otras numerosas colonias que
las rodean tras 48 h de incubación. Las colonias que producen H2S desarrollan también un
color negro, como es el caso de Proteus y algunos coliformes.
C) Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): En comparación con el verde brillante, el

desoxicolato de sodio es solo ligeramente tóxico para Salmonella. Estos
microorganismos y los del género Arizona producen colonias rojas con el centro negro.
Las bacterias coliformes, Proteus y muchos Enterobacterias producen colonias
amarillas. El tiempo óptimo de incubación es de 24 h. Si se incuban las cajas durante
más tiempo, se produce, una inversión alcalina y el consiguiente ennegreciemiento de
los no patógenos positivos al H2S (Citrobacter, Proteus vulgaris y P. mirabilis).
7
D) Agar Xilosa lisina verde brillante: Este medio es especialmente adecuado para
Salmonella en muestra de agua marina. El verde brillante inhibe a muchas especies de
Proteus, Enterobacter y Citrobacter)
8.4 REACCIONES BIOQUÍMICAS
Muchos microorganismos entéricos con escasa o nula capacidad patógena comparten ciertas
características bioquímicas importantes con Salmonella. La identificación de los patógenos por
las características de las colonias en medios sólidos selectivos, con lleva limitaciones
inherentes a las variaciones biológicas de determinados organismos y no puede ser fiable ni
siquiera para una identificación provisional. Las colonias sospechosas que crecen en los
medios sólidos selectivos han de ser purificadas y después caracterizadas mediante reacciones
bioquímicas, la verificación final se basa en una identificación de serología.
Es posible utilizar equipos de medios diferenciales disponibles comercialmente como

alternativas a las fases 1, 2 y 3 descritas más adelante antes de efectuar la confirmación
serológica, estos medios proporcionan una correlación de 95 % al 98 % con respecto a las
pruebas convencionales, si bien para una mejor diferenciación de las cepas de Enterobacterias
pueden hacerse necesarias pruebas más significativas.
Si no se utiliza estos métodos se sigue un patrón secuencial de análisis bioquímicos que dará
lugar a una mayor economía de medios y de tiempo del personal del laboratorio.
Las siguientes fases se pueden montar simultáneamente.
Fase 1. Detección preliminar, actividad de fenilalanina desaminasa:
Se desecha inmediatamente los cultivos positivos a la fenilalanina desaminasa como indicio de

que se trata de Proteus. En esta prueba, se realiza el aislamiento en agar Fenilalanina que se
incuba a 35 ºC o 37 ºC durante 24 h la actividad de fenilalanina desaminasa esta señalada por
una zona verde visible alrededor de la colonia tras inundar la caja con una solución de FeCl3
0,5M, los cultivos negativos a la fenilalanina demasiada pasaran a las pruebas bioquímicas de
la fase 2.
Fase 2. Otras pruebas bioquímicas
Los análisis utilizados son:
MEDIO FINALIDAD DEL ANALISIS
TSI Patrón de Fermentación: producción de H2S

LIA Actividad de la lisina descarboxilasa, Producción de H2S
Caldo Urea Producción de ureasa
La conformidad con los patrones bioquímicos típicos de Salmonella, determina la continuación

o no del proceso (fase 3). Pueden encontrarse cultivos que no cumplan todas las reacciones
clásicas atribuidas a cada grupo de patógenos. Por tanto en todos los casos habrá que revisar
las reacciones en su conjunto y no rechazar cultivos a causa de pequeños números de
anomalías aparentes.
8
Fase 3. Reacciones de fermentación
Se examinan las reacciones de fermentación en caldo con dextrosa, manitol, maltosa, dulcitol,
xilosa, ramnosa e inositol para la mejor caracterización de las capacidades bioquímicas de los
cultivos. Este estudio adicional disminuye el número posible de cultivos positivos que han de
ser llevados a confirmación serológica, si el laboratorio realiza la identificación serológica
puede prescindirse de esta serie de pruebas.
9. IDENTIFICACIÓN DEL GÉNERO MEDIANTE TÉCNICAS SEROLÓGICAS
Una vez realizados los análisis bioquímicos recomendados, se inocula el cultivo puro
sospechoso de Salmonella en medio inclinado de agar infusión cerebro-corazón y se incuba
durante 18 h - 24 h a 35 °C o 37 °C. Se toma un portaobjetos limpio con alcohol y se divide en
cuatro partes con un marcador, se prepara una suspensión densa del microorganismo en
estudio procedente de la incubación anterior en 0,5 ml de solución de NaCl al 0,85 %. Se
coloca una gota de antisuero polivalente “O” de Salmonella, en la primera porción y el antisuero
más NaCl al 0,85 % en la segunda. Con una asa limpia, se pasa la suspensión de bacterias a
la tercera porción y la cuarta porción se pasa una suspensión de bacterias más antisuero.
Se inclina ligeramente el porta hacia delante y hacia atrás. Si no se produce aglutinación en la

cuarta porción al cabo de 1 min, la prueba es negativa. Todas las demás porciones deben
permanecer sin aglutinación.
Si las reacciones bioquímicas son características de S. typhi y el cultivo reacciona con el

antisuero polivalente “O” se comprueban las colonias restantes de la misma caja mediante una
reacción con el antigeno Vi. Si no se produce aglutinación con antisuero Vi anti Salmonella, el
cultivo no es de S. typhi. La identificación de los serotipos de Salmonella requieren determinar
los antigenos H comparando según lo descrito por Edwards y Ewing. Pueden identificarse a los
cultivos productores de reacciones bioquímicas compatibles con Salmonella que son positivos
al antisuero polivalente “O” como “Salmonella sp., serotipo o bioserotipo indeterminado”.
10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS
De acuerdo con los resultados de la interpretación, se indica la presencia o ausencia de

Salmonella en una porción de x ml de agua
11. INFORME DE ENSAYO
En el informe de ensayo se debe especificar el método usado y los resultados obtenidos. Éste
debe mencionar todas las condiciones de operación no especificados en esta norma, o
considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que puedan haber
influido en los resultados.
En el informe de ensayo se debe incluir toda la información necesaria para la identificación

completa de la muestra.
9
12. APÉNDICE
NORMAS QUE DEBEN CONSULTARSE
Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de este
texto, constituyen la integridad del mismo. En el momento de su publicación eran válidas las
ediciones indicadas. Todas las normas están sujetas a actualización; los participantes,
mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la última
versión de las normas mencionadas a continuación.
NTC 4092:1997, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales

para los análisis microbiológicos. (ISO 7218:1997).
NTC-ISO 5667-3:1995, Gestión Ambiental. Calidad de agua. Muestreo. Directrices para la

Conservación y manejo de las muestras.
NTC-ISO 5667-5:1996, Gestión Ambiental. Calidad de agua. Guía para el muestreo de agua
potable y agua utilizada para alimentos y procesamiento de bebidas.
NTC-ISO 5667-14:1999, Calidad de agua muestreo. Parte 14. Guía para el control de la calidad
en el muestreo y en el manejo ambiental del agua.
13. DOCUMENTO DE REFERENCIA
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION;

WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods For The Examination of Water and
Wastewater, 20 TH EDITION.1998. Washington General Qualitative Isolation and Identification
Procedures for Salmonella (SM 9260 B).
10
Anexo A (Normativo)
Diagrama de procedimiento
CONCENTRACIÓN DE
SALMONELLA EN AGUAS
TÉCNICA DE TÉCNICA DE GRANDES

TÉCNICA DE TIERRA DE FILTRO DE
LA TORUNDA VOLUMES
DIATOMACEAS MEMBRANA
SE CORTAN SE COLOCAN SE COLOCA EN UN

TORUNDAS DE COMPRESAS EN ORTAFILTRO EL
10 x 4,5 cm EMBUDO DEL FILTRO ADECUADO
PORTAFILTRO
SE COLOCAN SE ESTERILIZA
EN BOLSAS SE AÑADEN 2,5 g 121°C POR 15 min.
RESISTENTES DE TIERRA DE
DIAMOTACEAS
SE ENSAMBLA EL
SE ESTERILIZA INSTRUMENTAL DE
121°C POR 15 min. SE APLICA FILTRACIÓN
VACÍO ADECUADO
SE COLOCA BAJO LA
SUPERFICIE EN EL SE FILTRAN SE FILTRA
PUNTO DE TOMA 2 LITROS DE
DURANTE 1 A 3 DIAS MUESTRA
SE EXTRAE
EL FILTRO Y SE
SE COLOCAN EN SE COLOCA EL COLOCA EN
BOLSAS ESTERILES TAPÓN FORMADO EL MEDIO
ENTERO O DIVIDIDO,
EN EL MEDIO
SE LLEVA AL
LABORATORIO
SE ATEMPERAN
TORUNDAS CON
MEDIO ANTES DE
INCUBAR
11
CONCENTRACIÓN DE
SALMONELLA EN AGUAS
TÉCNICA DE
FILTRO DE
MEMBRANA
AGUAS CON
AGUAS AGUA
ESCASA
TURBIAS POTABLE
TURBIDEZ
SE FILTRA 1 L O SE FILTRA 1 L O SE FILTRA 100

MÁS DE MUESTRA MÁS DE MUESTRA mL DE MUESTRA
POR UN FILTRO POR UN FILTRO POR UN FILTRO
DE 0,45 µm DE 0,45 µm DE 0,45 µm
SE PREPARA 1 SE INCUBA EN
LITRO DE TIERRA MEDIO
DE DIATOMACEAS M-ENDO POR 24 -
(5 g/l) Y SE 48 h, 35 A 37°C
FILTRAN 500 mL
SE PREPARA 1
LITRO DE TIERRA
DE DIATOMACEAS
(5 g/l) Y SE
FILTRAN 500 mL
SE FILTRA 1 LITRO
O MÁS DE MUESTRA
Y EL RESTO DE LA
SOLUCIÓN DE
TIERRA DE
DIATOMACEAS
SE COLOCA LA
MEMBRANA EN 100
mL DE AGUA
PEPTONADA AL 1%
SE
HOMOGENIZA
POR 1 MIN
CALDO
TETRATIONATO
CON 1:50.000
12
CONCENTRACIÓN DE
SALMONELLA EN AGUAS
TÉCNICA DE TÉCNICA DE GRANDES

TÉCNICA DE TIERRA DE FILTRO DE
LA TORUNDA VOLUMES
DIATOMACEAS MEMBRANA
PASAR A UN MEDIO
DE ENRIQUECIMIENTO
CALDO CALDO CALDO

TETRATIONATO SELENITO - F SELENITA / CISTINA
SE INCUBA POR 48 SE INCUBA POR 24 SE REPICA VARIAS

HORAS A 43°C HORAS A 35 - 37°C VECES EL PRIMER
DIA Y DIARIAMENTE
POR 5 DIAS
SE TRANSFIERE 1
mL A MEDIO
FRESCO
SE INCUBA
POR 48 HORAS
A 35 - 37°C
SE PASA A UN MEDIO SOLIDO

SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
AGAR VERDE AGAR AGAR XLD AGAR XILOSA

BRILLANTE SULFITO LISINA VERDE
BISMUTO BRILLANTE
SE INCUBA
POR
24 HORAS
ESPECIAL
SE INCUBA 24 - 48 HORAS AGUA
A LA TEMPERATURA MARINA
ADECUADA
13
COLONIAS
CARACTERÍSTICA
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
FASE I
ACTIVIDAD FENILALANINA SE INUNDA LA CAJA

DESAMINASA CON SOLUCIÓN DE
35 A 37°C POR 24 HORAS FeCl 3 0,5 M
(+) (-)
INDICIO DE
PROTEUS FASE II
TSI LIA UREA
PRODUCCIÓN ACTIVIDAD LISINA PRODUCCIÓN PRODUCCIÓN

HS DESCARBOXILASA HS DE UREASA
DEXTROSA MANITOL MALTOSA DULCITOL XILOSA RAMNOSA INOCITOL FASE III
SEROLOGIA
14
SEROLOGIA
AGAR INFUSIÓN CEREBRO - CORAZÓN

POR 18 - 24 HORAS A 35 - 37°C
COLONIAS PRESUNTIVAS SE
SUSPENDE EN 0,5 ml DE
CLORURO DE SODIO AL
0,85 %
PORTAOBJETO
1 GOTA 1 GOTA SUSPENSIÓN SUSPENSIÓN DE

ANTISUERO ANTISUERO DE BACTERIAS BACTERIAS EN NaCl
POLIVALENTE + EN 0,85 % +
(0) NaCl 0,85 % NaCl 0,85 % SUERO POLIVALENTE
SE INCLINA LIGERAMENTE EL
PORTAFILTRO HACIA ADELANTE
Y HACIA ATRAS DURANTE 1 MINUTO
Y DE OBSERVA
(-) (-) (-) (+) (-)
SALMONELLA
15
COLONIAS
CARACTERÍSTICA
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
SOSPECHA DE SEROLOGIA
(-) (+) (+) (-)
ANTIGENO
Vi
(+) (-)
16
Anexo B (Normativo)
Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos
B.1 MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
B.1.1 Caldo Selenita Cistina
B.1.1.1 Composición
Peptona de caseína 5,0 g

L – Cistina 0,01 g
Lactosa 4,0 g
Fosfato sódico 2,0 g
Hidrógeno selenito sódico 4,0 g
Agua destilada 1 000 ml
B.1.1.2 Preparación. Se disuelven los componentes en el agua destilada, se mezclan bien. Se

ajusta el pH de tal modo que después del calentamiento, sea de 7,0 ± 0,1. No esterilizar en
autoclave. Se calienta hasta 60 °C máximo, se esteriliza por filtración para almacenamiento
prolongado.
B.1.2 Caldo Selenita - f
Selenita ácido de sodio 4,0 g

Digesto pancreático de caseína 5,0 g
Lactosa 4,0 g
Fosfato monopotásico 7.0 g
Fosfato disódico 3,0 g
B.1.2.2 Preparación. Se disuelven los componentes en el agua destilada, se mezcla bien. Se

autoclave. Se calienta hasta 100 °C por 30 min si se va a almacenar.
B.1.3 Caldo Tetrationato

Peptona de carne 2,5 g
Mezcla de sales biliares 1,0 g
Carbonato cálcico 10,0 g
Tiosulfato sódico 30 g
17
B.1.3.2 Preparación. Se disuelven los componentes en el agua destilada, se mezclar bien. Se

autoclave. Se calienta hasta ebullición, se enfría rápidamente a 45 °C y se agregan 20 ml de la
solución de yodo y 10 ml de la solución al 0,1 % de verde brillante.
Solución de yodo:
Yodo 6 g, Yoduro potásico 5 g, agua destilada 20 ml.
B.1.4 Caldo Rappaport Vassiliadis

Peptona de soya 1,0 g
Cloruro Magnésico hexahidratado 29,0 g
Cloruro sódico 8,0 g
Hidrogenofosfato dipotásico 0,4 g
Dihidrogenofosfato potásico 0,6 g
Verde de malaquita 0,036 g

ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 5,5 ± 0,1. Se
distribuye en los recipientes definitivos. Se esteriliza a 115 ºC durante 15 min.
B.2 MEDIOS SÓLIDOS PARA AISLAMIENTO SELECTIVO
B.2.1 Agar Verde Brillante
Peptona de carne 5.0 g

Peptona de caseína 5.0 g
Cloruro sódico 3.0 g
Extracto de carne 5.0 g
Hidrógeno fosfato disódico 2.0 g
Lactosa 10.0 g
Sacarosa 10.0 g
Rojo de fenol 0.08 g
Verde brillante 0,012 5 g
Agar – agar 12.0 g

ajusta el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 6,9 ± 0,1. Se esteriliza
a 121 ºC durante 15 min
18
B.2.2 Agar Bismuto Sulfito
Extracto de carne 5,0 g

D(+) Glucosa 5,0 g
Hidrogenofosfato disódico 4,0 g
Sulfato ferroso 0,3 g
Verde brillante 0,025 g
Indicador bismuto – Sulfito 8,0g
Agar – agar 15,0 g

ajusta el pH de tal modo que después del calentamiento sea de 7,6 ± 0,2 No esterilizar en
autoclave. Se calienta con agitación frecuente hasta que disuelva el agar. No sobrecalentar.
B.2.3 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)
Extracto de levadura 3,0 g

D(+) Xilosa 3,5 g
Lactosa 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
L(+) Lisina 5,0 g
Tiosulfato de sodio 6,8 g
Desoxicolato sódico 2,5 g
Citrato de amonio y hierro (III) 0,8 g
Rojo de fenol 0,08 g

ajusta el pH de tal modo que después del calentamiento sea de 7,4± 0,2 No esterilizar en
autoclave. Se calienta con agitación frecuente hasta que disuelva el agar. No sobrecalentar.
B.2.4 Agar Xilosa Lisina Verde Brillante
Xilosa 3,5 g
L Lisina 5,0 g
Lactosa 7,5 g
Sucrosa 7,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar agar 13,5 g
19
B.2.4.2 Preparación. Verde brillante: Se adicionan 1,25 ml/l de solución acuosa de verde
brillante al 1 %.
Se disuelven los componentes en el agua destilada, se mezcla bien. Se ajusta el pH de tal

modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,5 ± 0,2. Se esteriliza a 118 ºC
durante 10 min.
B.3 MEDIOS PARA PRUEBAS BIOQUÍMICAS
B.3.1 Tres azúcares / Agar hierro (Agar TSI)

Peptona 20,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Citrato férrico(III) 0,3 g
Tiosulfato de sodio 0,3 g
Rojo fenol 0,024 g
1)
Agar 12 g a 18 g
Agua 1 000 ml
1)
Depende de la fuerza del gel
B.3.1.2 Preparación. Se disuelven los componentes en agua, se mezcla bien y se calienta si es

necesario. Se ajusta el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,4 ± 0,1.
Se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml y se esteriliza a 121 ºC durante 15 min. Se deja
solidificar en posición inclinada.
B.3.2 Agar L-lisina descarboxilasa
L-lisina monohidroxiclorada 5,0 g

Glucosa 1,0 g
Tiosulfato sódico 0,04 g
Citrato de amonio y hierro (III) 0,5 g
Púrpura de bromocresol 0,015 g
Agua 1 000 ml
B.3.2.2 Preparación. Se disuelven los componentes en agua, semezcla bien y se calienta si es

Se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml. Se esteriliza a 121 ºC durante 15 min. Se deja
20
B.3.3 Caldo urea

Dihidrogenofosfato potásico 9,1 g
Hidrogenofosfato disódico 9,5 g
Urea 20,0 g
B.3.3.2 Preparación. Se disuelven todos los componentes en agua, calentando, máximo a

60 °C. Se esteriliza por filtración. Se ajusta el pH a 6,8 ± 0,1. No se esteriliza en autoclave.
B.3.4 Agar Fenilalanina
L- Fenilalanina 2,0 g
Fosfato sódico 1,0 g

Se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml. Se esteriliza a 121 ºC durante 10 min. Se deja
B.3.4.2.1 Preparación solución cloruro férrico. Solución de cloruro férrico (FeCl3) 0,5M. Se
disuelven 13,51 g de FeCl3 en 100 ml de agua destilada estéril.
B.4 PRUEBAS BIOQUÍMICAS REACCIONES DE FERMENTACIÓN
B.4.1 Caldo Dextrosa

D(+) –Glucosa 10,0 g
21

Se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml. Se esteriliza a 121 ºC durante 15 min.
B.4.2 Caldo Manitol

Manitol 10,0 g

Se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml. Se esteriliza a 121 ºC durante 15 min.
B.4.3 Caldo Maltosa

Maltosa 10,0 g
B.4.3.2 Preparación. Se disuelven los componentes en agua, se mezclan bien y se calienta si

es necesario. Se ajusta el pH a 7,4 ± 0,1. Se esteriliza por filtración con membranas con poros
de 45 µm.. Se distribuye en tubos estériles en cantidades de 5 ml.
B.4.4 Caldo Dulcitol

Dulcitol 10,0 g
22

es necesario. Se ajusta el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de
7,4 ± 0,1. Se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml. Se esteriliza a 121 ºC durante 15 min.
B.4.5 Caldo Xilosa

Filosa 10,0 g

es necesario. Se ajusta el pH a 7,4±0,1. Se esteriliza por filtración con membranas (poros de
45 Dm). Se distribuye en tubos estériles en cantidades de 5 ml.
B.4.6 Caldo Ramnosa

Ramnosa 10,0 g
B.4.6.2 Preparación. Se disuelven los componentes en agua, se mezcla bien y calentar si es

necesario. Ajustar el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de 7,4 ± 0,1.
se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml. Se esteriliza a 121 ºC durante 15 min
B.4.7 Caldo Inositol

Inositol 10,0 g
23

necesario. Se ajusta el pH de tal modo que después del tratamiento en autoclave, sea de
7,4 ± 0,1. Se distribuye en tubos en cantidades de 5 ml. Se esteriliza a 121 ºC durante 15 min
24

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NORMA TÉCNICA NTC

CALIDAD DEL AGUA.

E: WATER. QUALITY. GENERAL QUALITATIVE ISOLATION

DESCRIPTORES: Salmonella en agua.

I.C.S.: 67.040, 07.100.20

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Prohibida su reproducción Editada 2002-01-31

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

La NTC 5021 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-12-19

3M COLOMBIA S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

ALGARRA AVESCO LTDA

CALIDAD DEL AGUA.

Más que un protocolo específico para la detección de Salmonella en el agua, se ofrece un

Los métodos actualmente utilizados se han empleado en numerosas investigaciones de campo

Para los propósitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones:

2.2 Detección de Salmonella: determinación de la presencia o ausencia de Salmonella, en

3.1 Concentración de la muestra mediante métodos mecánicos, como el uso de torunda,

3.3 Enriquecimiento en medio líquido selectivo, que permite el desarrollo del

3.4 Siembra en medio sólido selectivo diferencial, seleccionando tanto la temperatura de

3.5 Identificación de colonias sospechosas mediante reacciones bioquímicas específicas.

3.6 Confirmación serológica a través de la aglutinación con sueros monovalentes y

4. MEDIOS DE CULTIVOS, REACTIVOS Y ANTISUEROS

4.2 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS

4.2.1 Medio de enriquecimiento selectivo

Véase el numeral B.1.

4.2.2 Medios sólidos para aislamiento

Véase el numeral B.2.

4.2.3 Medios para pruebas bioquímicas

Véase el numeral B.3.

4.2.4 Medios para pruebas bioquímicas reacciones de fermentación

Véase el numeral B.4.

4.3.1 Suero polivalente

4.3.2 Suero monovalente

5. APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO

Equipo usual de laboratorio microbiológico y, en particular, lo siguiente.

5.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN

Véase la NTC 4092 (ISO 7218).

5.2 CABINA DE SECADO

Ventilado por convección, capaz de operar entre 37 °C ± 1 oC y 55 °C ± 1 oC.

Con capacidad de funcionar a 35 oC ± 2 oC.

5.4 BAÑO DE AGUA

Con precisión de calibración de ± 1 unidad de pH a 25 ºC.

5.6 BOTELLAS O FRASCOS PARA CULTIVO

5.7 TUBOS PARA CULTIVO

De 8 mm de diámetro y de 160 mm de longitud.

5.8 PIPETAS GRADUADAS

De capacidades nominales de 10 ml y de 1 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,5 ml

5.9 CAJAS DE PETRI

7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Se comienza el examen microbiológico de las aguas máximo 24 h después de su recolección.

Véase el diagrama del Anexo A (Normativo)

8.1 TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN

8.1.1 Técnica de la torunda

Se coloca la torunda en bolsas de papel fuerte de buena calidad y se esteriliza a 121 ºC

El tiempo máximo de conservación permisible es de 6 h. No se debe transportar en medios

En el laboratorio se coloca la torunda o porciones de ella en un medio de enriquecimiento.

8.1.2 Técnica de tierra de diatomáceas