Molecular

Descargar como pdf o txt
Descargar como pdf o txt
Está en la página 1de 8

Práctica 8

EXTRACCIÓN Y AMPLIFICACIÓN DE ADN BACTERIANO

OBJETIVOS

1. Identificar la molécula de ADN como polímero biológico responsable de


transmitir la información genética de un organismo.
2. Conocer uno de los mecanismos de extracción de ADN bacteriano.
3. Comprender los fundamentos de la técnica PCR para amplificar ADN.
4. Analizar el producto de amplificación de ADN bacteriano mediante
electroforesis.

MARCO TEÓRICO

Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptación


a diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta
capacidad es importante conocer sus bases genéticas, es decir, como está
organizada la información genética, como realizan y regulan su expresión y que
mecanismos de variación génica poseen.
La capacidad infecciosa de las bacterias patógenas radica en que poseen la
información génica necesaria para colonizar los tejidos del huésped, invadirlos y/o
producir sustancias tóxicas que causarán la enfermedad.
Por otro lado, el conocimiento del funcionamiento genético de las bacterias, sumado
al hecho de que son de fácil manejo en el laboratorio y que tienen crecimiento
rápido, ha permitido usarlas para sintetizar productos útiles a la medicina, tanto para
el diagnóstico como para la prevención y tratamiento de algunas enfermedades.
Estas posibilidades se han visto incrementadas con el desarrollo de la ingeniería
genética y la disponibilidad de técnicas de biología molecular (Betancor, Gadea, &
Flores 2008).
ESTRUCTURA DEL GENOMA BACTERIANO

Toda la información genética esencial para la vida de la bacteria está contenida en


una única molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular,
cerrado por enlace covalente. Dicha molécula se denomina cromosoma bacteriano.
Muchas bacterias poseen además ADN extracromosómico, también circular y
cerrado, denominado ADN plasmídico. Éstos, portan información génica para
muchas funciones que no son esenciales para la célula en condiciones normales de
crecimiento. En términos bioquímicos la composición y estructura de los ácidos
nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier célula. El ADN como
macromolécula, está compuesto por dos cadenas nucleotídicas o hebras
antiparalelas que se enlazan entre sí formando una doble hélice. Los enlaces entre
ambas hebras de ADN están determinados por puentes de hidrógeno entre las
purinas de una cadena, con las pirimidinas de la otra. Entonces, la Adenina forma
dos puentes de hidrógeno con la Timina, mientras que la Citocina forma tres puentes
de hidrógeno con la Guanina. Dicho fenómeno se conoce como complementariedad
de bases. Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hélice de ADN,
en la cual se pueden distinguir pares de nucleótidos o pares de bases (pb). Estos
pb pueden usarse como unidad de tamaño o longitud para las moléculas de ADN,
de esta manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosómico de
Escherichia coli tiene un tamaño de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo de
4.200 kilobases (Kb) (Betancor et al. 2008).

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA


La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que
amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos
repetidos. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN
polimerasa (ADN pol) que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en
las células (Tamay de Dios, Ibarra & Velasquillo 2013).
ELEMENTOS DE LA PCR
El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza química ofrece ventajas
para su manipulación. La carga eléctrica del ADN es negativa y está dada por los
grupos fosfatos. En la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y
funcionan como molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan
la secuencia de interés. Por su parte, la ADNpol se encarga de la catálisis de la
reacción, sintetizando las nuevas cadenas de ADN que se desea amplificar. La
enzima más usada se llama Taq polimerasa, que proviene de una bacteria termófila
llamada Thermus aquaticus, la cual vive en condiciones de temperatura muy altas
y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar ese tipo de temperaturas (Tamay
de Dios et al. 2013).
Los primers, por otro lado, son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y
delimitan la secuencia de interés que se desea amplificar y son complementarios a
ésta. Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de
G-C no debe ser más del 55% de la secuencia. Por su parte, los dNTP’s son los
“ladrillos” o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas
cadenas de ADN.
Algunos factores importantes que contribuyen a la especificidad de la reacción son:
• Buffer: es la solución amortiguadora que se usa en la reacción.
• Magnesio: es un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la
reacción.
• Agua: es el disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada, libre de
nucleasas (enzimas que degradan a los ácidos nucleicos) (Tamay de Dios,
Ibarra & Velasquillo 2013).
Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se
compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión.
Finalmente, los equipos en donde se realiza la reacción son llamados
termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema
homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se
modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar si se
amplificó la secuencia de interés, los productos de la PCR o también llamados
amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue
exitosa (Mas, Poza, Ciriza, Zaragoza, Osta & Rodellar 2016).

Figura 1. Proceso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Fuente: Mas, Poza, Ciriza, Zaragoza, Osta & Rodellar (2016).

ELECTROFORESIS
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida es una de las metodologías
más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos
nucleicos (Fierro, 2014). Mediante la electroforesis es posible separar fragmentos
de ADN y ARN en función de su tamaño y carga, las cuales se desplazarán al polo
positivo ya que a pH superiores a 5 estas moléculas poseen carga negativa. Los
resultados se pueden visualizar mediante una tinción que se intercala con las bases
nitrogenadas, de esta forma, es posible determinar el contenido de ácidos nucleicos
de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de pureza
(Padilla, Diez, Martínez, Bárcena & García 2006).
PROCEDIMIENTO

¡PRECAUCIONES! En este laboratorio se usarán algunos compuestos


considerados tóxicos. Es importante conocer los riesgos que implica el manejo de
estos compuestos, para lo cual se recomienda leer cuidadosamente la siguiente
información:

COMPUESTO RIESGOS/PELIGROS PRECAUCIONES


Buffer TBE Altamente irritante. Muy buena ventilación.
Muy peligroso si se Guantes.
ingiere. Gafas de seguridad.
Buffer TAE Altamente irritante. Muy buena ventilación.
Muy peligroso si se Guantes.
ingiere. Gafas de seguridad.
Agarosa Irritación en los ojos Guantes.
Irritación en las vías Gafas de seguridad.
respiratorias.
Diamond dye (colorante) Inflamable Muy buena ventilación.
Altamente irritante. Guantes.
Muy peligroso si se Gafas de seguridad.
ingiere.

1. EXTRACCIÓN DE ADN
Para extraer el ADN de bacterias, una de las técnicas utilizada es la extracción por
boiling. Esta consiste en desestabilizar la membrana citoplasmática por acción del
calor para dejar libre el ADN. Luego por centrifugación se pretende separar el ADN
del restante material celular. El ADN queda en la fase liquida (sobrenadante) y el
material celular en el fondo del tubo de centrifugación.

Se realizará la extracción del material genético de una bacteria que causa


patologías en el hombre (usted debe determinar cuál bacteria es, basándose en el
mini-caso que le asignará el profesor).
Para llevar a cabo la extracción de ADN bacteriano siga las siguientes etapas:
Figura 2. Etapas de la extracción de ADN mediante choque térmico

2. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)


El segmento de ADN que se amplificará será la región 16S usando los primers 27F
y 1492R (Lane, 1991).
Para realizar la amplificación del segmento de ADN siga el siguiente procedimiento:
En una cabina de extracción prepare en un tubo eppendorf la siguiente mezcla de
reacción:
Nota: los reactivos y las muestras deben permanecer en hielo.
Tabla 1. Reactivos de la reacción de PCR
Reactivo Volumen
Mezcla PCR (Master mix) 12,5 µL
Primer 27F 0,75 µL
Primer 1492R 0,75 µL
Muestra de ADN 1,5 µL
Agua para PCR 9,5 µL
Volumen total 25 µL

La mezcla preparada anteriormente se coloca en el termociclador bajo las siguientes


condiciones:
Protocolo termociclador (C1000 Bio-Rad):
Temperatura de denaturación: 94°C 5 min
Anillaje: 58°C 1 min
Extensión: 72°C 1 min
Número de ciclos: 25

3. ELECTROFORESIS
3.1 Preparación del gel de agarosa (1 %)
-Pese 0.4 g de agarosa y agregue 40 mL de TAE 1X
-Coloque el recipiente con la mezcla anterior en el microondas hasta que observe
ebullición.
-Agregue 1 µL del colorante Diamond dye por cada 10 mL de gel (Para 40 mL de
gel agregar 4 µL de colorante)
-Prepare el molde del gel equilibrándolo adecuadamente.
- Agregue la solución de agarosa en el molde y deje polimerizar (gelificar)

3.2 Separación de fragmentos de ADN mediante Electroforesis


-Después de que haya pasado el tiempo de amplificación en el termociclador
extraiga los tubos eppendorf y conserve en hielo.
-Mezcle en papel parafilm 8 µL de agua estéril + 1 µL de muestra (ADN) + 1 µL de
buffer de carga (6X).
-Adicione 3 µL de la mezcla anterior en un pozo del gel de agarosa.
-Conecte la cámara de electroforesis (Bio-Rad) a 80 V POR 50 minutos.
- Extraiga el gel y observe el resultado de amplificación en el fotodocumentador
(Chemidoc MP Bio-Rad).
-Analice los resultados.
Figura 3. Preparación del gel de agarosa y electroforesis

REFERENCIAS

Betancor, L., Gadea, M. P. & Flores, K. (2008). Genética bacteriana. Instituto de Higiene, Facultad
de Medicina (UDELAR). Temas de Bacteriología y Virología Médica. 3ra Ed. Montevideo: Oficina del
Libro FEFMUR, 65-90.

Fierro, F. F. (2014). Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología:


aspectos teóricos y prácticos, 27.

Lane, D.J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial
systematics. Stackebrandt, E., and Goodfellow, M., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, pp.
115-175.

Mas, E., Poza, J., Ciriza, J., Zaragoza, P., Osta, R. & Rodellar, C. (2016). Fundamento de la Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR). Revista AquaTIC, (15).

Tamay de Dios, L., Ibarra, C. & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en discapacidad, 2(2), 70-78.

También podría gustarte