PRÁCTICAS DE FUNDAMENTOS

DE BIOTECNOLOGÍA
Grado de INGENIERÍA QUÍMICA

Dpto. de Ciencias Básicas de la Salud

Área de Bioquímica y Biología Molecular

Universidad Rey Juan Carlos

 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

Prácticas de Fundamentos de Biotecnología:

Índice.

NORMAS GENERALES DE LABORATORIO. 03

INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS 04

PRÁCTICA Nº1:
DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL ADN MEDIANTE AMPLIFICACIÓN
Y RESTRICCIÓN. 05

1.1 AMPLIFICACIÓN DEL ADN MEDIANTE PCR. 12

2.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 13
2.1.2 MÉTODO. 13
1.2 DIGESTIÓN DEL ADN USANDO ENDONUCLEASA DE RESTRICCIÓN. 15
2.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 17
2.2.2 MÉTODO. 17
1.3 ELECTROFORESIS DEL ADN EN GEL DE AGAROSA . 18
2.3.1 MATERIAL Y REACTIVOS. 20
2.3.2 MÉTODO. 20
1.4 CÁLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA 1. 22

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 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

LABORATORIO DE PRÁCTICAS: UBICACIÓN.

Laboratorio 006. Edificio Polivalente I.
Campus de Móstoles – UNIVERSIDAD REY JUAN CARLOS.
Avda. Tulipán s/n 28933 Móstoles – Madrid.

NORMAS GENERALES DE LABORATORIO

Antes de la realización de las prácticas:

1. Estudiar cuidadosamente el guión que corresponda antes del comienzo
de cada práctica. Las posibles dudas se resolverán brevemente al inicio
de la práctica.
2. Se pasará lista para comprobar la asistencia a la práctica, por lo que se
pide puntualidad.

Durante la realización de las prácticas:

1. El uso de bata y guantes es obligatorio, así como cualquier otro material
de protección que indiquen los profesores.
2. Está absolutamente prohibido fumar o comer en el laboratorio.
3. Está absolutamente prohibido pipetear con la boca.
4. Se debe mantener limpio el puesto de trabajo durante el desarrollo de las
prácticas, y limpiarlo completamente al finalizar.

Después de la realización de las prácticas:

Completar el cuaderno de prácticas y si lo considerasen necesario los
profesores/as de prácticas, entregarlo al final de las mismas cuando se
indique. La evaluación de las prácticas tendrá lugar mediante un examen
(consultar guía docente y calendario de la asignatura).

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INTRODUCCIÓN A LAS PRÁCTICAS

Las clases prácticas del laboratorio de Fundamentos de Biotecnología

pretenden proporcionar al estudiante una primera aproximación
experimental a las técnicas básicas empleadas habitualmente en un
laboratorio de Biotecnología.

Cada práctica presenta una breve introducción teórica que ilustra al

alumno sobre los objetivos de la misma. A continuación, se detallan los
reactivos, materiales y métodos que el alumno deberá utilizar. Por último, se
plantean cuestiones relacionadas que el alumno deberá responder
razonadamente. En el cuaderno de laboratorio deberá anotar los resultados
experimentales obtenidos, realizar el trabajo indicado con esos resultados,
anotar las incidencias que hubieran podido ocurrir y responder a las
preguntas planteadas en el laboratorio, en éste guión de prácticas y en el
propio cuaderno.

La práctica está dedicada al aprendizaje de las técnicas de detección

de transgénicos gracias a las variaciones en la secuencia de un gen.

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PRÁCTICAS DE GENÉTICA.

PRÁCTICA Nº1:

DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL ADN MEDIANTE AMPLIFICACIÓN

Y RESTRICCIÓN.

Las mutaciones puntuales son cambios en la secuencia del ADN que

afectan a una sola base. Estos cambios pueden tener o no relevancia a la
hora de expresar la información contenida en el gen. En caso de que la
mutación apenas altere la información expresada, bien porque no cambie
la secuencia de aminoácidos, o bien porque cambie un aminoácido poco
relevante para la función de la proteína, se denomina silenciosa. Si la
mutación altera la función se la denomina de incremento o de decremento
dependiendo de la consecuencia del cambio de aminoácido sufrido. En
caso de que la función quede anulada por completo se denomina
mutación de pérdida de función. Esta pérdida de función puede ser
consecuencia de la aparición de una señal de STOP prematura en la
traducción debido a la mutación, con la subsiguiente formación de una
proteína truncada, o bien de un cambio en el marco de lectura que
produce una secuencia de aminoácidos muy diferente a la original.

En el caso de los organismos modificados genéticamente cuyos

productos se destinan al uso industrial (alimentación, textil, farmacéutico,
etc.), se pretende una mejora de la especie desde el punto de vista de la
mejora de la producción. Técnicamente se puede optar por introducir el gen
de otra especie (de mayor eficacia) reemplazando al original responsable
del control del proceso biológico de interés, para así obtener el efecto
biotecnológico esperado. Otra estrategia es modificar el gen original in vitro
mediante mutagénesis dirigida y reintroducirlo en la especie reemplazando

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 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

al original. Aquéllos casos en donde se introducen mutaciones puntuales, la

reintroducción del gen modificado puede ser supervisada por los cambios
que ocurren entre los patrones de restricción para el gen silvestre y los
patrones de restricción en el gen modificado. La mutación es detectable sin
necesidad de secuenciar el gen completo debido a que la misma genera
una nueva diana de restricción para una endonucleasa concreta. En el
ejemplo que nos ocupa va a generarse una diana EcoRI (5’-GAATTC-3’)
nueva en el gen modificado.

Al laboratorio han llegado unas muestras de plantas de distintos

cultivos biológicos para determinar si el grano que producen es grano
silvestre o si es grano transgénico contaminante, procedente de una
plantación cercana. Para ello, primero extraeremos ADN de las plantas, para
a continuación utilizar ese ADN como molde de la Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR). Mediante la PCR vamos a amplificar un fragmento del
gen de interés, concretamente un fragmento de 2700 pb que contiene la
zona de la mutación. Una porción del producto de PCR será posteriormente
incubada con endonucleasa EcoRI, y los productos de la digestión se
separan mediante electroforesis en gel de agarosa. Sus tamaños son
distinguibles por electroforesis en gel de agarosa. En el caso del ADN
obtenido de la planta transgénica la endonucleasa corta el ADN, en tanto
que el producto de PCR de los ADN de plantas silvestres no resulta cortado.
Identificaremos así a los cultivos biológicos, los cultivos transgénicos, y
aquellos cultivos biológicos que se hayan visto contaminados por plantas
transgénicas.

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1.1 AMPLIFICACIÓN DEL ADN MEDIANTE PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica que

permite copiar ó amplificar una secuencia de ADN concreta, a partir de una
pequeña cantidad de ADN inicial. Está basada en el principio de hibridación
de cadenas de ADN con dos oligonucleótidos de orientación opuesta que
flanquean la zona a amplificar. Antes de proceder a amplificar un segmento
concreto de ADN (de tamaño entre 200 pb y 3000 pb habitualmente),
debemos diseñar y sintetizar los dos oligonucleótidos mencionados. Una vez
obtenidos, se procede a la reacción en presencia del resto de
componentes. La reacción sigue tres fases:

Primero, desnaturalización del ADN a 94 ºC para que las hebras de la

doble hélice se separen y puedan ser copiadas.
Segundo, alineado de los oligonucleótidos con el ADN a 55 ºC para así
delimitar el punto de inicio de la copia por parte de la polimerasa.
Tercero, extensión de la copia por la Taq polimerasa a 72 ºC, la cual es
capaz de copiar 1 kb de ADN por minuto.

Estas tres fases componen un ciclo de PCR, que se repite n veces,

normalmente entre 25 y 40 en función del producto que se quiere obtener.
Debido a que las copias de la secuencia generadas en cada ciclo pueden
ser utilizadas en el siguiente ciclo como moldes para la ADN polimerasa, se
produce una acumulación de copias con una dinámica exponencial, de
modo que a partir de muy poco ADN molde inicial obtenemos mucha
cantidad de producto de PCR. Esta cantidad es suficiente para poder
abordar su manipulación experimental posterior, como por ejemplo la
digestión con endonucleasas de restricción.

La automatización de la PCR ha sido posible gracias a la utilización de

ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que es una enzima termorresistente

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 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

capaz de copiar el ADN a temperaturas entre 68 ºC y 74ºC y de no

desnaturalizarse a temperaturas superiores a 94 ºC.

1.1.1 MATERIAL Y REACTIVOS.

1.- Termociclador.
2.- Tubos eppendorf de 0.2 ml y de 1.5 ml.
3.- Micropipetas con sus correspondientes puntas de plástico.
4.- Tampón de reacción de PCR 10X (incluye MgCl 2).
5.- Solución de oligonucleótidos directo e inverso, a 20 M.
6.- Taq polimerasa 5u/ l.
7.- ADN molde.
8.- Agua destilada.

1.1.2 MÉTODO.

1.- Rotular tres tubos eppendorf de 0.2 ml como “WT”, “M” y como “C”.

2.- Pipetear 1 l de ADN de planta silvestre (control positivo) en un tubo

eppendorf de 0.2 ml rotulado adecuadamente como “WT”. Cambiando la
punta de la pipeta, pipetear 1 l de ADN de la planta procedente del cultivo
a analizar en otro eppendorf de 0.2 ml, rotulado como “M” (muestra). En el
tubo marcado “C” (control negativo) no se pone ADN alguno, ya que es un
control de reacción que nos indicará si ha habido contaminación de la
muestra durante la amplificación del ADN

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3.- En un tubo eppendorf de 1.5 ml, preparar la siguiente mezcla de

reacción:
A.- 6 l de tampón de reacción 10X.
B.- 3 l de oligonucleótido directo 20 M.
C.- 3 l de oligonucleótido inverso 20 M.
D.- 3 l de Taq Polimerasa 5U/l.
E.- 3 l dNTPs
E.- 42 l de agua destilada.

4.- Con la micropipeta p20, pipetear suavemente para mezclar. Una vez
mezclado, pasar 19 l de la mezcla de reacción a los tubos eppendorf de 0.2
ml rotulados como “WT”, “M” y como “C”.

5.- Cerrar los tubos eppendorf y colocarlos en el termociclador, programado

de la siguiente manera:
A.- Un ciclo de desnaturalización a 94 ºC durante 30 segundos.
B.- Veinticinco ciclos de:
B1.- Desnaturalización 15 segundos a 94 ºC.
B2.- Alineado 15 segundos a 55 ºC.
B3.- Extensión 60 segundos a 72 ºC.
C.- Un ciclo de extensión final de 7 minutos a 72 ºC.

6.- Dejar el termociclador funcionando hasta el día siguiente.

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1.2 DIGESTIÓN DEL ADN USANDO ENDONUCLEASA DE RESTRICCIÓN.

Las endonucleasas de restricción (ER) son enzimas que cortan el ADN

sólo si detectan una zona con secuencia de bases concreta en la cadena
de ADN. La longitud y composición de cada secuencia es específica para
cada endonucleasa. Las ER forman parte de los sistemas de modificación-
restricción (MR), sistemas desarrollados por diferentes cepas bacterianas en
defensa a los ataques de virus bacteriófagos. En estos sistemas, la parte de
modificación metila el ADN bacteriano tras la replicación en una secuencia
de bases específica (p.ej.: metilación de la guanina en la secuencia GAATTC
para el sistema EcoRI). Así pues, la parte de restricción, que reconoce esa
misma secuencia, no puede degradar el enlace fosfodiéster entre la
guanina y la adenina debido al impedimento estérico que supone el grupo
metilo unido a la guanina. Con esta estrategia la bacteria portadora de este
sistema protege su ADN de la auto-restricción, pero cuando se produce la
entrada por infección de ADN del genoma de un bacteriófago, el sistema
de restricción sí actúa sobre ese ADN no metilado, restringiéndolo. Al
perderse la continuidad de la hebra en el genoma del bacteriófago, éste no
puede expresar la información genética y por lo tanto no puede replicarse,
no infectando a la bacteria.

En el laboratorio se utiliza solamente la parte de restricción de los

sistemas MR. Las endonucleasas son designadas en función de la cepa en
donde fueron descubiertas y en función del orden de descubrimiento, ya
que una misma cepa puede tener distintos sistemas MR. Por ejemplo: EcoRI
hace referencia a que es la primera endonucleasa obtenida de la cepa
RY13 de Escherichia coli. Existen dos posibilidades en el resultado del corte
con una ER: que se generen extremos romos o que se generen extremos
cohesivos, aunque cada ER genera siempre un único tipo de extremo

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 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

específico. Por ejemplo, EcoRI genera extremos cohesivos con extremos 5’

protuberantes, pero PvuII genera extremos romos.

Figura 2: Ejemplos de corte cohesivo (con Eco RI) y de corte romo (con PvuII).
A.- Eco RI. B.- PvuII

En este ensayo usaremos la endonucleasa EcoRI para cortar el

producto de PCR obtenido en el ensayo anterior. En caso de que la muestra
procedente del cultivo a analizar (producto “M”) sea transgénica, el
producto de PCR se cortará en dos subproductos. La suma del tamaño de
subproductos debe igualar el tamaño del producto original. Si no hay
mutación (producto “WT”), la endonucleasa no cortará el producto original
de PCR. Si aparecen ambas bandas, es que la muestra de la que se ha
extraído ADN procedía de la mezcla de plantas transgénicas y no
transgénicas, indicando contaminación del cultivo biológico.

1.2.1 MATERIAL Y REACTIVOS.

1.- Estufa o baño a 37 ºC.

2.- Tubos eppendorf de 0.2 ml conteniendo el producto de PCR de las
reacciones etiquetadas como “WT” y “M”.
3.- Micropipetas con sus correspondientes puntas de plástico.
4.- Tampón de reacción de restricción 10X.
5.- Endonucleasa de restricción EcoRI a 10u/ l.
6.- Agua destilada.

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1.2.2 MÉTODO.

1.- Recuperar los tubos que habían sido dejados en el termociclador.

2.- Tomar dos tubos eppendorf de 0.2 ml. Rotular uno como “EWT” y otro
como “EM”. Añadir en este orden:
A.- 7 l del producto de PCR correspondiente.
B.- 2 l del tampón de reacción de digestión 10X.
C.- 1 l de endonucleasa de restricción: EcoRI

3.- Con la micropipeta p20 graduada en 20 l, pipetear suavemente para

mezclar.

4.- Una vez mezclado, cerrar el tubo eppendorf y colocarlo en el baño ó en

la estufa a 37 ºC. Incubar durante 30 minutos.

5.- Tras la incubación de la reacción de digestión, retirar los tubos del baño ó
incubador y mantenerlos en hielo.

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1.3 ELECTROFORESIS DEL ADN EN GEL DE AGAROSA.

La agarosa es un polímero de galactosa y 3-6, anhidrogalactosa que se

disuelve en agua por calentamiento y al enfriarse forma una estructura
tridimensional de tipo gel. Las aplicaciones más importantes de este tipo de
geles son las relacionadas con la separación de moléculas de tamaño
molecular elevado, como son los ácidos nucléicos:
DNA y RNA. El tamaño del poro formado en este gel
depende de la concentración de agarosa: a más
concentración, mejor separación de fragmentos
pequeños, y a menor concentración, mejor
separación de fragmentos grandes. La concentración
suele variar desde el 0.1% al 4%, aunque de forma
rutinaria se pueden separar adecuadamente
fragmentos entre 0.3 Kb y 4 Kb con un gel del 1%.
Los ácidos nucleicos poseen carga neta negativa
debido a la ionización de los numerosos grupos fosfato
presentes en el esqueleto de enlaces fosofodiéster. Por
lo tanto, en solución a pH neutro o básico migrarán
siempre hacia el polo positivo. La relación carga /
masa es constante e independiente del tamaño, por lo que su movilidad es
muy similar. Sin embargo al someterlos a un campo eléctrico en un gel de
agarosa, debido a los poros de ésta, podremos separarlos por tamaño
molecular. Todas las moléculas al tener carga negativa migran hacia el
ánodo o polo positivo pero al entrar en los poros del gel, las moléculas
grandes sufren un retraso al pasar con dificultad entre la trama del gel,
mientras que las moléculas pequeñas pasan fácilmente llegando antes al
polo positivo. Esto produce una diferencia de velocidad de migración entre
las moléculas que será debida a su tamaño e independiente de la carga,
por lo que la separación se realiza en función del peso molecular (Pm).

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 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

Se ha comprobado que la velocidad de migración es inversamente

proporcional a la longitud de las cadenas (peso molecular), existiendo una
relación lineal entre el logaritmo del peso molecular (lg Pm) y la distancia de
migración desde el punto de aplicación. Por ello si se utilizan ácidos
nucleicos de tamaño molecular conocido se puede, una vez transcurrida la
electroforesis, visualizarlos por una tinción específica y medir su distancia de
migración. Con estos datos se puede construir la recta patrón que relaciona
la distancia de migración con el peso molecular y en ella se pueden
interpolar los valores obtenidos para las muestras de peso molecular

desconocido. Los límites de resolución están entre 606.000 pb (4 x 10 8 Da) y

40 pb (26.000 Da) dependiendo de la concentración de agarosa (entre 0.1 %
y 3 %).

Los sistemas de electroforesis son muy utilizados en laboratorios de

Biología Molecular. Para la electroforesis usaremos como muestra la digestión
con EcoRI del producto de PCR obtenido, además de un marcador de pesos
moleculares. El marcador es un conjunto conocido de fragmentos de ADN,
cada uno de un tamaño definido. Los geles para este tipo de electroforesis
se realizan en forma horizontal y sumergidos en el tampón de electroforesis. El
tampón de muestra lleva glicerol para dar mayor densidad a la muestra y
azul de bromofenol para que sirva de indicador del frente de migración.

1.3.1 MATERIAL Y REACTIVOS.

1.- Agarosa en polvo.

2.- Tampón de electroforesis TBE 1X.
3.- Solución de Bromuro de Etidio 10 mg/ml.
El Bromuro de Etidio es un compuesto POTENCIALMENTE
MUTAGÉNICO por contacto, debido a su característica de agente

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intercalante. Está TERMINANTEMENTE PROHIBIDO continuar la práctica SIN

GUANTES. En caso de contaminación accidental, dirigirse INMEDIATAMENTE al
profesor ó profesora de prácticas.
4.- Formador de geles, dique y peines multipocillo.
5.- Cubeta de electroforesis y fuente de alimentación.
6.- Transiluminador ultravioleta.
La luz ultravioleta es una emisión energética POTENCIALMENTE
MUTAGÉNICA por exposición prolongada. Está TERMINANTEMENTE
PROHIBIDO continuar la práctica SIN PROTECCIÓN ADECUADA
PARA LA PIEL Y LA VISTA (bata, mampara de metacrilato, etc.).

1.3.2 MÉTODO.

1.- Colocar el formador de geles en el dique. Colocar un peine multipocillo

en uno de los extremos del formador de geles.

2.- En un matraz, disponer 50 ml de tampón TBE 1X y añadir 0.5 g de agarosa.

Calentar hasta disolver. NOTA: La agarosa debe estar completamente
disuelta, presentando la mezcla aspecto transparente. Dejar enfriar a 50ºC-
55 ºC.

3.- Añadir 3 l de solución de bromuro de etidio a la mezcla disuelta de

agarosa, antes de volcarla en el formador de geles.

4.- Dejar enfriar para que solidifique. Una vez sólida, cobra aspecto
translúcido.

5.- Retirar el peine con cuidado para no romper los pocillos. Retirar el dique.

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6.- Colocar el gel en la cubeta de electroforesis y cubrirlo completamente

con tampón de electroforesis TBE 1X.

7.- Recoger los tubos eppendorf rotulados como “WT”, “M” y “C”. Añadir a
cada muestra 2 l de tampón de carga con la micropipeta p20 y mezclar
pipeteando.

8.- Una vez mezclado, pipetear con cuidado 5 l de muestra preparada en

el pocillo del gel utilizando la micropipeta p20. Pipetear también 3 l de
marcador de peso molecular ya preparado.

9.- Conectar los electrodos (Borne negro: polo negativo; en el lado de los
pocillos. Borne rojo: polo positivo; parte contraria a los pocillos) y aplicar 120
V durante 40 min, ó bien dejar correr la electroforesis hasta que el azul de
bromofenol esté a un centímetro del final del gel.
NOTA: en estas prácticas usaremos un gel comercial Lonza ya preparado. La
electroforesis se dejará correr a 275V durante 4 min.

10.- Sacar el gel de la cubeta y depositarlo sobre el transiluminador de luz

ultravioleta para visualizar los fragmentos de DNA separados. Fotografiar el
gel.

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1.4 CÁLCULOS, RESULTADOS Y CUESTIONES DE LA PRÁCTICA 1.

1.- Sobre la fotografía, medir las distancias de migración de los marcadores

de peso molecular y de los fragmentos de digestión obtenidos. Construir la
recta patrón que nos permita relacionar distancia migrada con peso
molecular y deducir mediante interpolación el tamaño de los productos de
PCR y de digestión obtenidos.

2.- Identificar en la fotografía obtenida cuál es la muestra procedente el cultivo

silvestre, del transgénico y del contaminado, razonando la respuesta.

3.- De los dos fragmentos marcados como B y C en la imagen de la

electroforesis de los productos de PCR digeridos, ¿cuál tiene más cargas
negativas totales?

4.- ¿Qué fragmento ha migrado más en el gel? ¿Por qué migra más este
fragmento?

5.- ¿De qué depende la migración electroforética de DNA en gel de agarosa?

6.- ¿Qué sentido tiene el control “C”?

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 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

BORRADOR PARA LA GRÁFICA DE LOS PESOS MOLECULARES DE

LOS PRODUCTOS DE PCR Y DE DIGESTIÓN.

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 Prácticas de Fundamentos de Biotecnología

PRÁCTICAS DE FUNDAMENTOS DE BIOTECNOLOGÍA.

ANOTACIONES

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