Revista Cubana de Química

ISSN: 0258-5995
revcubanaquimica@cnt.uo.edu.cu
Universidad de Oriente
Cuba

Rodríguez-Gámez, Odalys; Vilasó-Cadre, Javier E.; Aguilera-Rodríguez, Isabel; Pérez-

Silva, Rosa M.; Ábalos-Rodríguez, Arelis
Validación por verificación del método colorimétrico de la antrona para la cuantificación de
ramnolípidos
Revista Cubana de Química, vol. XXV, núm. 3, mayo-septiembre, 2013, pp. 287-294
Universidad de Oriente
Santiago de Cuba, Cuba

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Recepción: marzo 2013
Aceptación/publicación: junio/sept. 2013

Validación por verificación del método colorimétrico de la

antrona para la cuantificación de ramnolípidos
Verifying Validation of the Anthrone Colorimetric Method for
Rhamnolipids Quantification
MSc. Odalys Rodríguez-Gámez, Javier E. Vilasó-Cadre, Lic. Isabel Aguilera-Rodríguez,

"
Dra. Rosa M. Pérez-Silva, Dra. Arelis Ábalos-Rodríguez
oroga@cebi.uo.edu.cu; javier.vilaso@cebi.uo.edu.cu; isabel@cebi.uo.edu.cu;
rmaria@cebi.uo.edu.cu; aabalos@cebi.uo.edu.cu
Centro de Estudios de Biotecnología Industrial. Facultad de Ciencias Naturales. Universidad
de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba

z Resumen

El presente trabajo tiene como objetivo realizar la validación por verificación del método colorimétrico
de la antrona para cuantificar ramnolípidos en un medio de cultivo microbiano. Para ello se determinaron
los parámetros: linealidad, precisión, exactitud, límites de detección y cuantificación y la robustez. Se
demostró que el ensayo es lineal y exacto en el rango de 10-70 µg/mL de carbohidratos; se obtuvieron
coeficientes de variación inferiores al 3 % para la repetibilidad, y se determinó que tiene un límite de
detección igual a 1,63 µg/mL y un límite de cuantificación de 5,45 µg/mL. Se comprobó que el método
es robusto frente a variaciones en la temperatura y tiempo de calentamiento así como a la cantidad de
reactivo añadido a las muestras.
Palabras clave: validación, antrona, ramnolípìdo, método colorimétrico.

z Abstract

This paper aims to to validate by checking of anthrone colorimetric method to quantify rhamnolipids
in microbial culture medium. Linearity, precision, accuracy, limits of detection and quantitation and
robustness: This parameters were determined. It was demonstrated that the assay is linear and accurate
in the range of 10-70 µg/mL of carbohydrates, coefficients lower than 3% variation for repeatability were
obtained, and were found to have a detection limit equal to 1,63 mg / mL and a limit of quantification of
5,45 g / mL. It was found that the method is robust against variations in temperature and heating time
as well as the amount of reagent added to the samples.
Keywords: validation, anthrone, rhamnolipid, colorimetric method.

z Introducción son los ramnolípidos, en los cuales una o dos

moléculas de ramnosa están unidas a una o dos
Los glicolípidos son biosurfactantes microbianos moléculas de ácido â-hidroxidecanoico. La
compuestos por uno o dos carbohidratos combinados producción de estos compuestos fue descrita por
con uno o varios ácidos grasos, hidroxiácidos grasos primera vez en Pseudomonas aeruginosa por
o alcoholes grasos. Debido al alto rendimiento y la Jarvis y Johnson /2/.
posibilidad de utilizar recursos renovables para su
producción, se considera que son los más Para la determinación del contenido de
prometedores para su utilización y producción ramnolípidos en un medio de cultivo se ha reportado
comercial /1/. Los glicolípidos mejores estudiados el empleo de diferentes métodos analíticos, como son

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las técnicas colorimétricas de la antrona /3/, el orcinol z Materiales y métodos

/4/ y el método del fenol-sulfúrico /5/, y métodos
cromatográficos como la cromatografía líquida de Materiales y equipos
alta resolución (HPLC) /6/ y la cromatografía líquida
acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) /7/, los Las determinaciones se realizaron en un
cuales son utilizados, además, para la caracterización espectrofotómetro Spectroquant Pharo 300 Merck
estructural de estos compuestos. UV-visible a 625 nm con celda de vidrio con paso de
luz de 1.0 cm. Todos los reactivos empleados fueron
Entre los ensayos colorimétricos, el método de la de calidad puro para análisis.
antrona es uno de los más utilizados, el cual se ha
empleado para determinar azúcares solubles en Reactivo antrona/sulfúrico
muestras diversas, como tejidos vegetales /8, 9/,
productos biofarmacéuticos /10/, muestras de factor El reactivo de antrona/sulfúrico se preparó en
de transferencia /11/ y determinación de glicolípidos el momento de realizar el análisis disolviendo 0,2 g
en diferentes muestras /12, 13/. Se basa sobre la de 9,10 dihidro-9-oxoantraceno (antrona) (0,2 %)
reacción del derivado hidroximetilfurfural (formado en 100 mL de ácido sulfúrico concentrado (98 %),
por la deshidratación del azúcar en medio ácido para una concentración final de 2 gL -1. Durante su
caliente) con la antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno) empleo se conservó en frasco ámbar y protegido
para formar un compuesto de color verde con una de la luz /13/.
absorción máxima a 630 nm /13/.
Procedimiento analítico
El método de la antrona es rápido, sencillo (no
requiere un instrumental muy sofisticado) y muy El ensayo se realizó según procedimiento descrito
utilizado tanto para la detección de glicolípidos por Sim et al. (1997) /16/. Se tomaron 1,25 mL de
como para su cuantificación. Otra ventaja que muestra y se mezclaron con 2,5 mL de reactivo
tiene el método es que se pueden tratar grandes antrona en tubos de ensayos con tapas de rosca,
cantidades de muestras a escala de microplacas de inmersos en agua fría (10-15 ºC). Se agitaron en un
titulación /10/. vórtex, se colocaron durante 15 min en baño de agua
a 100 ºC y posteriormente se enfriaron a temperatura
La validación de un método analítico es el ambiente por 1 h. Se determinó la absorbancia por
proceso a través del cual se obtiene evidencia triplicado, a 625 nm contra blanco de reactivo.
documentada que dicho método conducirá con un
alto grado de seguridad a la obtención de resultados La determinación de la concentración se evaluó
precisos y exactos dentro de las especificaciones mediante curva de calibración. Para ello se preparó
y atributos de calidad previamente establecidos / una solución patrón de ramnosa de 1 g·L-1, a partir de
14/. Esta capacidad del método de aportar resultados la cual se prepararon patrones desde 10 µg·mL-1
fiables se manifiesta mediante parámetros como la hasta 70 µg·mL-1, los cuales recibieron el mismo
linealidad, precisión exactitud y robustez, entre tratamiento que las muestras.
otros. Por otra parte, la verificación de un método
no es más que la acción que el laboratorio realiza Tratamiento previo de las muestras
previo a la introducción de un método en la rutina
Las muestras de medio de cultivo se centrifugaron
de trabajo, para comprobar y documentar su
a 10 000 rpm por 10 min para separar las células
competencia /15/.
bacterianas. El sobrenadante se acidificó con H2SO4
El presente trabajo tiene como objetivo concentrado hasta pH = 2 unidades y se dejó en
realizar la validación por verificación del método reposo toda la noche a 4 ºC. El glicolípido precipitado
colorimétrico de la antrona para la cuantificación se obtuvo por centrifugación a 4 000 rpm por 10 min.
de un ramnolípido en muestras de medio de Se resuspendió en cloroformo y luego de la
cultivo, según NC TS 368: 2010 para su posterior evaporación del solvente a temperatura ambiente, se
implementación en los análisis de rutina. disolvió en 2 mL de agua destilada.

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Parámetros evaluados para la validación S.A = cantidad original en la muestra (sin analito
del método añadido).
A = cantidad de analito añadido.
Para realizar la verificación del método se evaluaron
los siguientes parámetros: Para determinar el porcentaje de recuperación, se
realizaron cuatro determinaciones en muestras patrón,
Linealidad: De la solución patrón de ramnosa de añadiendo 30 mg de analito.
1 g·L-1, se tomaron las alícuotas correspondientes
para obtener concentraciones de 10, 20, 30, 50 y 70 Límite de cuantificación: Se evaluó como diez
µg·mL-1, y realizar el procedimiento para un tamaño veces la desviación típica estándar de veinte muestras
de muestra n = 10. Se determinó la recta de regresión blanco.
lineal y se determinaron los coeficientes de
determinación y correlación (r y r2). Límite de detección: Se evaluó como tres veces
la desviación típica estándar de veinte muestras
Precisión: El criterio de precisión verificado fue blanco.
la repetibilidad y se determinó mediante el cálculo de
Robustez: Se realizó un diseño factorial 23,
las desviaciones estándar y típica relativa (coeficiente
de variación), de los resultados obtenidos de los considerando las variables: cantidad de reactivo
análisis a tres niveles de concentración, para n = 10. antrona/sulfúrico añadido, temperatura del baño
caliente y tiempo de incubación en el baño. Se
Exactitud o veracidad: Para determinar el grado realizaron ocho determinaciones.
de exactitud de un método analítico existen varias
pruebas según la disponibilidad o no de un material de z Resultados y discusión
referencia o de un método de referencia. Cuando no
se dispone de materiales de referencia, debe El método de la antrona ha sido muy utilizado para
determinarse el porciento de recuperación /17/. la determinación de carbohidratos totales en diferentes
matrices, pero la complejidad de un medio de cultivo
El porcentaje de recuperación del analito añadido como matriz conlleva a esta validación por verificación
se calcula como 100 veces la diferencia entre las
del método, la cual se realizó con el objetivo de
medias de las series dividida entre la cantidad de
analito añadida: comprobar y documentar que el método en cuestión
es competente para la finalidad que se quiere.
Linealidad
donde: Para comprobar la linealidad del método se
C.A = cantidad ensayada (muestra con analito determinó la recta de mejor ajuste por el análisis de
añadido). regresión de los mínimos cuadrados (figura 1).

Fig. 1 Curva de calibración para la determinación de glicolípidos

por el método de la Antrona.

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Las características de la regresión: pendiente (b), intercepto (a), coeficiente de correlación (r),
coeficiente de determinación (r 2) y error estándar se calcularon, y los resultados se resumen en
la tabla 1.

TABLA 1. RESULTADOS ESTADÍSTICOS DE LA PRUEBA DE

LINEALIDAD DEL MÉTODO DE LA ANTRONA

El estadístico r2 (coeficiente de determinación) lineal hasta los 70 µg·mL-1 de ramnolípidos, valor

indica que el modelo ajustado explica el 99,59 % de que está en correspondencia con lo reportado
la variabilidad observada y el coeficiente de en otros trabajos /11, 13/, en los que se describe
correlación, con un valor de 0,997 9, demuestra que un comportamiento de linealidad hasta los
existe una dependencia lineal entre la concentración 80 µg·mL-1.
y la señal analítica en el intervalo evaluado.
En la tabla 2 se muestra el análisis de varianza
Un hecho que corrobora la linealidad del método (Anova) del modelo de regresión, se observa que
es el gráfico de los residuos (la diferencia entre los el Fcalculado = 1 944,36 y el Ftabulado (P= 0,05) = 7,7E-
valores experimentales y los predichos por el 11, por lo que Fcalculado > Ftabulado, lo cual demuestra
modelo ajustado) en función de la concentración que existe una buena correlación entre la
(figura 2). Como se observa en la figura, se obtuvo absorbancia y la concentración, lo que permite
que los puntos están distribuidos al azar alrededor evaluar la concentración de ramnolípidos por los
del eje X, indicando que la curva es realmente valores de absorbancia obtenidos.

Fig. 2 Gráfico de residuos µg · mL-1.

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TABLA 2. ANÁLISIS DE VARIANZA (ANOVA) DEL MODELO

DE REGRESIÓN OBTENIDO

Precisión y exactitud Para evaluar la precisión se hizo un estudio de la

repetibilidad, donde se evaluó la variabilidad del método
La precisión de un método depende solamente
efectuando los análisis sobre una muestra en
de la distribución de los errores aleatorios, que no
condiciones operativas idénticas (analista, equipo y
está asociada con el valor verdadero y se expresa
reactivos) en un laboratorio. Para ello se realizaron
generalmente como la desviación típica del
cinco determinaciones a muestras de tres soluciones
resultado analítico.
patrones a concentraciones de 10, 40 y 70 µg · mL-1
El objetivo del estudio de la precisión es conocer correspondientes a los niveles bajo, medio y alto de la
la variabilidad y los factores susceptibles de influir curva patrón, respectivamente, y se calculó el
sobre los resultados de un ensayo no pueden ser coeficiente de variación para cada nivel de
siempre controlados (analista, equipo instrumental concentración. La tabla 3 muestra los resultados de
reactivos tiempo, etcétera) /14/. la prueba de repetibilidad.

TABLA 3. DETERMINACIÓN DE LA REPETIBILIDAD DEL MÉTODO

COLORIMÉTRICO DE LA ANTRONA

En los tres niveles de concentración evaluados el es la concentración del analito. Cuando se trabaja a
coeficiente de variación fue inferior al 3 %, lo que concentraciones altas del analito se aceptan valores
equivale a una buena precisión del método. Como se de coeficientes de variación más bajos que cuando se
observa (tabla 3), a medida que aumenta la trabaja a bajas concentraciones. Esto se debe a que
concentración del analito, disminuye el coeficiente de los errores aleatorios medidos como desviaciones
variación. Se plantea que uno de los factores que más típicas relativas aumentan al disminuir la
puede influir en la repetibilidad del método de análisis concentración del analito /14/.

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La exactitud indica que los resultados que se entre el 80 % y el 110 %, sugiriendo que el método
obtienen con un método analítico están próximos al tiene una exactitud aceptable. Para comprobar
valor verdadero o al que se acepta convencionalmente que la recuperación es satisfactoria se realizó una
como valor verdadero. Para determinar si el método prueba-t donde se comparó la media de recobrado
de la antrona es exacto se realizó la prueba de obtenida con respecto al 100 % (recobrado teórico).
recuperación a cuatro muestras de una solución Debido a que el p-valor para esta prueba es mayor
patrón de 20 µg·mL-1, a las cuales se les añadió una o igual a 0,05 (p = 0,064 1), no se rechaza la
cantidad conocida del analito. hipótesis nula, con un nivel de confianza del 95,0 %
y, por tanto se concluye que el 89,73 % de
En la tabla 4 se muestran los porcentajes de recuperación obtenido representa el 100 %
recuperación obtenidos, los cuales se encuentran de recuperación.

TABLA 4. PORCENTAJES DE RECUPERACIÓN OBTENIDOS EN EL ENSAYO DE

EXACTITUD DEL MÉTODO COLORIMÉTRICO DE LA ANTRONA

Límites de detección y cuantificación del método de la antrona se realizó la determinación

de veinte muestras blanco de agua destilada. Los
El límite de detección (LD) ha sido definido como
resultados se muestran en la tabla 5.
la menor cantidad de analito detectable pero no
cuantificable por el método de análisis en una muestra, El límite de detección calculado fue de 1,63 µg/mL
mientras que el límite de cuantificación o de y el límite de cuantificación fue 5,45 µg/mL. Ambos
determinación (LC) es el valor mínimo de analito resultados confirman la utilidad del método para
cuantificable por el método en una muestra /14/. Para cuantificar pequeñas cantidades de ramnolípido en el
determinar los límites de cuantificación y de detección medio de cultivo.

TABLA 5. DETERMINACIÓN DE LOS LÍMITES DE

DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL
MÉTODO DE LA ANTRONA

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Robustez empleado con varias modificaciones en cuanto a

concentración de antrona, ácido y tiempo de
La robustez de un método analítico se define calentamiento en baño de agua /18/.
como la medida de su capacidad para permanecer
inalterado ante pequeñas pero deliberadas Por ello, para comprobar la robustez del método se
variaciones en ciertos parámetros, proporcionando realizó un diseño factorial 23, donde se evaluaron los
idea de su fiabilidad o "estabilidad" durante su factores: temperatura, tiempo de calentamiento y
empleo en análisis de rutina. Es, por tanto, la proporción de reactivo añadido con respecto a la
capacidad que demuestra el procedimiento de muestra. Se trabajó a dos niveles para cada factor y
análisis para proporcionar resultados válidos en se realizaron un total de 8 determinaciones.
presencia de pequeños cambios respecto de las
En los resultados del análisis ANOVA (tabla 6),
condiciones descritas en el método, susceptibles
se pudo comprobar que ninguno de los factores
de producirse durante su utilización /14/.
estudiados, ni la combinación de estos, influye
Dado que el método de la antrona se fundamenta significativamente en los resultados analíticos del
en una reacción de condensación, las condiciones de método (p-valor > 0,05) con un nivel de confianza del
temperatura son significativas para la obtención de un 95 %, lo que demuestra que el método de la antrona
buen resultado analítico. También, el método se ha es robusto frente a los factores estudiados.

TABLA 6 . RESULTADOS DEL ANOVA PARA EL ENSAYO DE ROBUSTEZ

DEL MÉTODO DE ANTRONA

Determinación de ramnolípidos en La concentración media obtenida fue de 483

muestras de medio de cultivo ± 0,026 µg·mL -1 con un coeficiente de variación
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la de 5,08 %, lo que demuestra que el método es
evaluación del método, se procedió a la cuantificación efectivo en la cuantificación de ramnolípidos en
del glicolípido en el medio de cultivo (tabla 7). el medio de cultivo.

TABLA 7. DETERMINACIÓN DEL GLICOLÍPIDO EN EL MEDIO DE CULTIVO

POR EL MÉTODO COLORIMÉTRICO DE LA ANTRONA

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