Nombres: ​Barragán José Leonardo, Jinez Rodríguez Ivonne Estefania, Marquez Cadena

Milton Paul, Ruiz Basantes Melany Amanda, Van Ronzelen López Victor Augusto

NRC: ​4531
Fecha: ​ 6 de febrero de 2019

Determinación de proteínas presentes en: atún, leche en polvo e hígado de res; por el
método de Kjeldahl.
Resumen
El contenido proteico de los alimentos ha sido objeto de análisis desde hace cientos de años.
Uno de los métodos más utilizados es el método desarrollado por Kjeldahl en 1883 que
consiste la determinación indirecta de proteínas de acuerdo a la concentración de nitrógeno de
las muestras. En el presente informe se detalla la utilización de este método para determinar
el porcentaje proteico encontrado en atún enlatado, leche en polvo e hígado de res crudo. Se
obtuvieron resultados cercanos a los descritos en bibliografía con excepción del atún enlatado
cuyo resultado pudo haberse visto afectado por la humedad contenida en el mismo.
Palabras clave: ​proteínas, Kjeldahl, digestión, destilación, titulación.
Introducción
Antecedentes
El método de análisis para la determinación de nitrógeno en diferentes muestras es muy
antiguo es por ello que para el año 1883 Johan Kjeldahl publicó un nuevo método para
determinar el nitrógeno en compuestos orgánicos y revolucionó el análisis de nitrógeno ya
que su método era de fácil ejecución y de precisión por tal motivo fue muy utilizado en el
sector alimenticio y de piensos. Pero antes de llegar a este método lo que J. Kjeldahl buscaba
primero era la forma de encontrar las proteínas que contiene el mosto de la cerveza; y a su
vez el científico Jean Dumas se encontraba analizando la combustión de sustancias naturales
para determinar el contenido de carbono y nitrógeno; como se puede apreciar los dos
investigadores partieron de una misma idea en donde una muestra primero debe de digerirse
completamente para poder extraer y determinar el nitrógeno del que están compuestas. Por un
lado Kjeldahl digirió estas muestras con ácido sulfúrico concentrado y Dumas lo hizo con
nitrógeno puro llegando al principio de determinar proteínas en base al nitrógeno (Gerhardt,
2016).
Justificación
La presente práctica de laboratorio pretende determinar el contenido de proteínas en
diferentes alimentos (atún, leche en polvo e hígado) mediante el método Kjeldahl debido a
que es importante considerar el contenido nutricional de varios alimentos ya que esto
proporciona el grado de calidad que se está expendiendo de la industria alimentaria al
consumidor.
Objetivos
General
● Determinar la cantidad de proteína presente en tres muestras: atún, leche en polvo e
hígado de res a partir del método de Kjeldahl
Específicos
● Realizar la titulación de las muestras con ácido clorhídrico
● Identificar cada uno de los pasos del método Kjeldahl

Marco Teórico
Las proteínas son polipéptidos, formados por aminoácidos dispuestos linealmente y plegados
en forma globular, Las proteínas son esenciales en los organismos debido a que participan en
prácticamente, la totalidad de los procesos metabólicos. En tamaño de las proteínas es una
característica importante por lo que los investigadores emplean analizadores de tamaño de
partículas para determinar su peso molecular y tamaño (​Biomolecular Science​, 2018).
La cuantificación exacta de proteínas es esencial para todos los experimentos relacionados
con ellas. Debido a ello se han desarrollado varios métodos para cuantificar proteínas, ya sean
totales, o alguna en particular. Los métodos de cuantificación de proteínas totales incluyen
métodos tradicionales tales como los ensayos de Bradford, el ácido bicinconínico y la
medición de la absorbancia a 280 nm, así como métodos alternativos como el de Lowry o
novedosos ensayos desarrollados por los proveedores comerciales, los cuales expenden kits
muy prácticos y diseñados para cada tipo de ensayo. Los métodos para cuantificar proteínas
individuales incluyen el ELISA, Western blot y, más recientemente, la espectrometría de
masas, entre otros (Johnson, 2012).
Las proteínas pueden ser contabilizadas a partir de métodos de extracción de proteínas,
métodos de determinación directa o indirecta. Dentro de los métodos de extracción de
proteínas, se encuentran dos: Método de extracción de sal/alcalina, que consiste en
homogeneizar las proteínas utilizando hidróxido de sodio y cloruro de sodio, con ello se
obtiene un sobrenadante que es de hecho las proteínas. La extracción good´s Buffer, en la
cual las muestras se homogenizan con un tampón de ácido ​4- (2-hidroxietil)
piperazina-1-etanosulfónico, cloruro de magnesio y 3- ( (3-holamidopropil) dimetilamonio)
-1-propanosulfonato, con lo cual también se obtiene las proteínas en forma de sobrenadante
(Mæhre, et al. 2018).
El método de determinación directa de proteínas consiste en un análisis de aminoácidos, para
ello se debe agregar ácido clorhídrico concentrado, luego se lava las muestras con gas
nitrógeno para posteriormente hidrolizar las muestras y finalmente redisolverlas a una
concentración adecuada en tampón de citrato de litio. El análisis de aminoácidos se realiza
con cromatografía de columna de intercambio iónico. La determinación indirecta de
proteínas, se puede realizar por el método de Lowry modificado, método de Bradford o por el
método de Kjeldahl, el primero de ellos consiste en el empleo de 3 soluciones especiales y
permite realizar una curva estándar de la albúmina de suero bovino. El ensayo Bradford
consiste en disolver Coomassie Brilliant Blue G-250 en etanol, luego agregar ácido fosfórico,
luego se coloca la muestra en la solución obtenida y se realiza una curva estándar se BSA
(Mæhre, et al. 2018).
El método de Kjeldahl es una técnica que determina la cantidad de nitrógeno en muestras
orgánicas e inorgánicas. Este método es usado históricamente desde hace más de 100 años en
todo tipo de muestra. Comúnmente la determinación de nitrógeno se realiza en alimentos,
carne, pienso, césped, bebidas y entre otros con el fin de determinar el contenido de proteína
de manera indirecta. También se puede hacer la determinación de nitrógeno en aguas
residuales, suelos o aguas de riego​(Mæhre, et al. 2018)​.
El primer paso del método de Kjeldahl consiste en hidrolizar el material bruto (muestra a
analizar) con ácido sulfúrico concentrado, agregar catalizadores y elevar la temperatura, así la
reacción que tiene lugar es:

Luego se debe destilar la solución obtenida, en este caso los iones amonio se convierten en
amoniaco con la adición de una base fuerte como el NaOH:

Debido a la elevada temperatura, el amoniaco junto con moléculas de agua se trasladan a un

matraz receptor. La función del matraz receptor es capturar el amoniaco y retenerlo para
realizar la titulación. Generalmente se usan soluciones de ácido bórico del 2-4% para capturar
el amoniaco en forma de iones de amonio solvatados:

El último paso del método es la titulación que tiene como fin determinar la concentración de
iones amonio capturados en la solución de ácido bórico. Se puede usar técnicas como
titulación directa o en retroceso (se usa otra solución para la captura). El punto final puede ser
determinado con un cambio colorimétrico o con ayuda de un pH-metro (ITW, 2018).

Los indicadores utilizados suelen ser mezclas como rojo de metilo y verde de bromocresol (1)
o rojo de metilo y azul de metileno (2). En el caso número 1 el intervalo de viraje va de 4.8 a
5.5 cambiando de rosa liláceo a verde esmeralda (ITW, 2017). Si la titulación es en retroceso
se suele preferir la utilización de naranja de metilo o rojo de metilo.
Cabe resaltar que este método tiene una larga duración y los resultados también pueden estar
sujetos a errores pues no todo el nitrógeno de la muestra proviene de proteínas. A pesar de
esto, el método de Kjeldahl es ampliamente utilizado a nivel internacional y sigue siendo el
método estandarizado en comparación a otros por su precisión y buena reproducibilidad
(McClements, 2001).
La cantidad de nitrógeno total en las materias primas se multiplica por el factor de conversión
tradicional y por el factor de conversión específico de la especie, y de esta forma se determina
el contenido total de proteínas (​Mæhre, et al. 2018)​. Este factor de conversión depende del
tipo de proteína presente en la muestra y la fracción proteica compuesta de aminoácidos con
otras fuentes de nitrógeno como arginina o histidina. El rango de variación de estos factores
es relativamente corto y se suele utilizar el factor de 6.25 como estándar para la mayor parte
de alimentos (FAO, 2007).
La titulación es un método que se utiliza para la determinación cuantitativa de una sustancia
conocida; en el caso del amoníaco este forma un complejo amoniato-borato en el ácido
bórico. El amoníaco se libera del complejo con el uso del ácido fuerte (HCl) utilizado para
titular formando cloruro de amonio y ácido bórico. La titulación generalmente se determina
mediante un método colorimétrico empleando diferentes indicadores como por ejemplo
Shiro-Tashiro , al entrar en el viraje el punto de equivalencia se encuentra entre pH 4,4 y 4,7
pero si se llega a usar un titulador automático el pH exacto llega a ser de 4,65 (Mendoza,
2016).
Materiales y Métodos
La práctica se realizó en los laboratorios del IASA de la Universidad de las Fuerzas
Armadas-ESPE el 1 de febrero del 2019. Para esto se llevaron tres muestras de alimentos:
atún, leche en polvo e hígado de res. Se pesó aproximadamente 3 g de cada muestra para la
determinación de proteína por el método de Kjeldahl.
Primero se procedió a la digestión, se colocó las muestras envueltas en papel encerado en los
tubos de digestión Kjeldahl con 15 mL de ácido sulfúrico concentrado y ⅓ de una pastilla
catalizadora Kjeldahl, estos tubos fueron llevados al digestor. Para iniciar este proceso se
puso la máquina al 25% de su temperatura máxima por 15 minutos, después se procedió a
subir la temperatura al 40% por otros 15 minutos y luego al 60% por 15 minutos más, por
último se dejó la muestra por una hora al 80% de la temperatura máxima del equipo. Una vez
terminado este proceso se dejó enfriar la muestra hasta ser manipulable, y luego se agregaron
75 ml de agua destilada lentamente para evitar la ruptura del tubo a causa del cambio de
temperatura.
La segunda etapa del método Kjeldahl consiste en la destilación, entonces el tubo con la
muestra digerida y agua se colocó en la máquina de destilación (UDK Distillation Unit de
VELP Scientifica), a este tubo se burbujea hidróxido de sodio al 32% durante 5 minutos a
alta temperatura produciendo una reacción entre el hidróxido de sodio y el sulfato de amonio,
obteniendo amoníaco el cual se condensa dentro de la máquina y se transfiere al recipiente
receptor, matraz. En el matraz se colocó previamente una solución para capturar el amoniaco,
que consiste en 30 ml de ácido bórico 4% y tres gotas de indicador (2 g rojo de metilo, 1 g
verde de bromocresol), el cual cambió de un color rojizo a un color verde debido al aumento
del pH.
La tercera etapa de este método es la titulación, para esto se colocó un agitador en el matraz
el cual se puso sobre una plancha de agitación, para la titulación se utilizó ácido clorhídrico
0,1 M. Entonces se dejó caer el ácido gota por gota hasta que la solución vuelva al tono rojizo
inicial indicando el punto final de la titulación. Se tomaron los datos HCl 0,1M gastado para
cada muestra de alimento y se procedió a calcular la cantidad de proteína.
Los desechos producidos fueron de acuerdo a las normas de bioseguridad.
Resultados
El volumen utilizado de HCl 0.1 N para neutralizar la alcalinidad dada por NH​3​ se muestra en
la tabla 1.

Tabla 1: ​Resultados de la titulación con HCl 0,1N.

Muestras Titulaciones Volumen HCl Coloración Coloración
(g) (HCl 0,1N) gastado en la Inicial Final
titulación

Atún Primera 61,40 ml Verde Rosado

(3.0123) valoración

Leche en Primera 65,40 ml Verde Rosado

Polvo valoración
(3.1267)

Hígado Primera 79,70 ml Verde Rosado

(3.1176) valoración

Los moles contenidos en el volumen de HCl utilizado reaccionan de manera equivalente con
los moles de NH​3 contenido
​ en el matraz y el nitrógeno presente en estas moléculas proviene
principalmente de la ruptura de los enlaces formados por el nitrógeno en las proteínas de la
muestra.
Cálculos:
*Contenido de nitrógeno en las muestras en base seca

La fórmula a utilizar es : Pg (N) = N * 14 * ( V 1 - V 0 )

En donde:
Pg (N) = Peso en gramos de Nitrógeno
N= normalidad del HCl
V 1 = volumen (l) empleado en la titulación de HCl al 0,1N de la muestra
 V 0 = volumen (l) empleado en la titulación de HCl al 0,1N del blanco = 0 ml

● Muestra de Atún
Pg (N) = 0,1 * 14 * (0,0614-0) = 0,086 gramos
● Muestra de Leche en polvo

Pg (N) = 0,1 * 14 * (0,0654-0) = 0,09156 gramos

● Muestra de Hígado de res

Pg (N) = 0,1 * 14 * (0,0797-0) = 0,11158 gramos

*Contenido de proteína en las muestras en base seca

P g(N )
La fórmula a utilizar es : %P = P g (muestra) * 100 * F
En donde:
%P= porcentaje de proteína
Pg (N) = Peso en gramos de Nitrógeno
Pg (muestra) = Peso en gramos de la muestra
F= factor de conversión dependiendo del tipo de muestra

● Muestra de Atún
0,086
%P = 3,0123 * 100 * 6, 25
% P atún = 17,8352%

● Muestra de Leche en polvo

0,09156
%P = 3,1267 * 100 * 6, 38
% P leche p. = 18.6827%

● Muestra de Hígado de res

0,11158
%P = 3,1176 * 100 * 6, 25
% P hígado = 22,369%
Los resultados finales se detallan en la tabla 2.
Tabla 2: ​Resultados de peso de nitrógeno y porcentaje proteico de cada muestra.
Muestra Peso (g) Pg N (g) %Proteico (%)

Atún 3.0123 0,086 17.8352

Leche en Polvo 3.1267 0,09156 18,6827

Hígado 3.1176 0,11158 22,369

Tabla 3: ​Resultados de error experimental.

Muestra %P. Experimental %P. Teórico Error experimental

Atún 17,8352 29,09 38,69

Leche en Polvo 18,6827 19,35 3,4486

Hígado 22,369 23* 2,7434

*Dato de la USDA, 2015

Discusión
La tabla 1 indica la cantidad de volumen de ácido usado en la titulación, en este caso se usó el
HCl con una normalidad de 0,1N porque el compuesto a titular es una base débil (Méndez,
2010). Esta cantidad de volumen es directamente proporcional a la cantidad de nitrógeno en
la muestra y a su vez también es proporcional al porcentaje de proteína encontrado en dicha
muestra (Santiago, 2011).
Para las determinaciones del porcentaje de proteína en las muestras es necesario eliminar la
humedad de la muestra a tratar, la humedad es un factor que genera un error en el cálculo
debido al peso de la muestra que se ve alterado por dicho factor. La muestra de atún presentó
el mayor porcentaje de error experimental esto puede haberse dado por el nivel de humedad
de atún enlatado con aceite que es cerca de 72% (Alfara, Añez, Delgado, Izquierdo, & Torres,
2001). La muestra de leche en polvo es aquella que tiene el porcentaje de error experimental
menor, que puede ser comparado con un valor teórico exacto, esto puede ser debido a la
humedad del alimento que es poca y el peso no varía en gran cantidad (González, Reyes &
Pérez, 2010). El porcentaje de error teórico de la muestra de hígado es bajo pero cabe
destacar que no existe un porcentaje teórico estándar para este tipo de muestra sino un valor
estimado por la USDA (U​nited States Department of Agriculture,​ 2015).
Nielsen (1994), determina que existen varias fuentes de error en el método de Kjeldahl tanto
en el proceso de digestión como en el proceso de destilación. A pesar de que la cantidad de
nitrógeno no-proteico es despreciable en comparación al nitrógeno proteico, la inclusión del
primero puede arrojar datos erróneos. Ejemplos de compuestos con nitrógeno no proteico
son: urea, carnitina, taurina, colina, creatina, etc,. Estas moléculas pueden encontrarse en
músculos animales como productos o moléculas propias del metabolismo (van Waarde, 1988;
Tymoczko, Berg & Stryer, 2015). De igual manera se puede perder el nitrógeno durante la
digestión por exceso de catalizadores que al aumentar mucho la temperatura de ebullición
pueden generar descomposición por calor. Durante la destilación, el error más común
proviene de una neutralización incompleta de la mezcla digerida o por pérdidas de amoniaco
debido a fisuras en el circuito de destilación o debido a enfriamiento insuficiente en el
condensador (Santiago, 2011). A pesar de que estos errores se eliminan con el uso de equipos
automatizados, la falta de mantenimiento o el mal uso de los mismos puede influir en los
resultados.

Conclusiones
● Se logró determinar el porcentaje de proteína de las muestras analizadas.
● Por el método utilizado se obtuvo valores cercanos a los encontrados en las tablas de
información nutricional de las muestras de atún y leche en polvo.
● La humedad es un factor importante en cálculos de proteínas por este método.
● El porcentaje de proteínas del hígado de res es mayor al del atún y leche en polvo.
Bibliografía
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Anexos
 Anexo 1. ​Digestor para el método ​Kjeldahl para cuantificación proteica.

Anexo 2. ​Destilador, matraz receptor con ácido bórico al 4% e indicador, previo a la destilación.