Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Ingeniería Bioquímica

Departamento de Bioquímica

Laboratorio de Métodos de Análisis

Profesora Guillermina Rosas Sandoval

Alumna Rosalba Hernández de los Santos

Grupo 4IV1

Reporte de Práctica:

Estudio de algunos factores que afectan el establecimiento de un Método

Espectrofotométrico.

10 de octubre del 2019

 ⮚ Objetivos.

Seleccionar tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el espectrofotómetro.

Manejar algunos de los parámetros que intervienen en el establecimiento de un método

espectrofotométrico.

Establecer las condiciones óptimas de los parámetros probados para la aplicación del método.

⮚ Datos experimentales e informe.

De la selección de tubos.

Se escogieron tubos que fueran de la misma marca, tamaño, y volumen que pudieran observarse a simple
vista, para que fueran lo más parecidos en cuanto a su composición.

Tablas 1 y 2. Selección de tubos comunes para utilizarlos como celdas.

Tubo No. %T400 Tubo No. %T400

(H2O) (H2O)
1 95 11 93
2 94.9 12 94.4
3 94 13 93
4 94.7 14 93.2
5 93.3 15 93.3
6 94.4 16 93.8
7 95.2 17 94.4
8 94 18 93.3
9 93.5 19 93.8
10 94 20 93.2
Tubo No. %T400 Tubo No. %T400
(NiSO4) (NiSO4)
1 22.4 11 23.3
2 23.9 12 22.1
3 23.4 13 23.3
4 22.5 14 24.4
5 23.1 15 23.4
6 23.8 16 23.8
7 23.5 17 24.2
8 22.9 18 23
9 23.2 19 23.5
10 23.7 - -

Se descartaron los tubos con valores de Transmitancia sombreados al ser los de menor valor.
 ● Explique qué son las superficies ópticas equivalentes.

Aquellas que tengan una composición similar, que no tengan rayaduras o defectos que puedan alterar la
lectura en el espectrofotómetro.

● Explique qué es el diámetro interno equivalente.

Que todos los tubos que se utilizan para una lectura en el espectrofotómetro tengan diámetros iguales o
con mínimas diferencias para que así la absorbancia dependa solamente de la concentración o absortividad
(interacción materia-energía) dependiendo de la conveniencia en el momento de realizar un experimento.

Curva de calibración.

● Para la concentración de Fe3+ en FeCl3

Si la concentración del FeCl3 es 0.00025M tenemos que

𝑚𝑜𝑙
1 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 = 1
𝐿
Entonces:

0.00025 𝑚𝑜𝑙 𝐹𝑒𝐶𝑙3 1 𝑚𝑜𝑙 𝐹𝑒 3+ 55.845 𝑔 𝐹𝑒 3+ 1000000 𝜇𝑔 1𝐿 𝜇𝑔

( )( )( 3+ )( )( ) = 13.96 𝑑𝑒 𝐹𝑒 3+
𝐿 1 𝑚𝑜𝑙 𝐹𝑒𝐶𝑙3 1 𝑚𝑜𝑙 𝐹𝑒 1𝑔 1000𝑚𝐿 𝑚𝐿

Para cada uno de los tubos:

𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 ; 𝐶2 =?

𝐶1 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐹𝑒 3+ 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒

𝑉1 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜, 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑐𝑎𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑟𝑖𝑚𝑒𝑟 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑒𝑠 0.05 𝑚𝐿
𝑉2 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜

Tabla 3. Curva de calibración de Fe3+ por el método del NH4SCN.

Tubo No. Fe3+ (μg/mL) A480 A480
ajustada por
regresión lineal
1 0.1163 0.020 0.050
2 0.3490 0.059 0.082
3 0.6980 0.121 0.131
4 1.1633 0.208 0.196
5 1.7450 0.290 0.277
6 2.3266 0.349 0.358
7 2.9083 0.451 0.439
8 3.49 0.534 0.520
9 4.0716 0.628 0.601
10 4.6533 0.678 0.682
11 5.8166 0.848 0.844
12 8.1433 1.211 1.168
13 12.7966 1.777 1.816
 3+
C u r v a d e c a li b r a c ió n d e F e (M é to d o d e l N H 4 S C N )

2 .0

1 .5

A 4 8 0 1 .0

0 .5

0 .0
0 5 10
3+
[F e ] (  g /m L )

𝑦 = 0.1393𝑥 + 0.3438 𝑟 2 = 0.9979

3+
C u r v a d e c a li b r a c ió n d e F e ( M é t o d o d e l N H 4 S C N ) c o n a b s o r b a n c ia a ju s t a d a .

2 .0

1 .5

A 4 8 0 1 .0

0 .5

0 .0
0 5 10
3+
[F e ] (  g /m L )

𝑦 = 0.1393𝑥 + 0.03438 𝑟 2 = 1 (ecuación de la gráfica anterior)

 a) ¿Sigue esta reacción la Ley de Bouger y Beer? Explique
Sí sigue la Ley de Bouger y Beer ya que existe una linealidad en la recta.
b) Comente acerca de la sensibilidad del método, el intervalo de concentración y escala de lectura útil
del aparato. Señale estos datos en el gráfico.
c) Una línea recta calculada por regresión lineal, además de utilizarse para tener la concentración de
analitos de interés, se puede usar en la determinación del límite de detección de un método analítico,
empleando la ecuación:
𝑦 = 𝑦𝐵 + 3𝑆𝐵 . . . (1)

Se obtuvo por regresión lineal la ecuación de la recta en la curva de calibración

𝑦 = 0.03438 + 0.1393 𝑥

● Para el Límite de Detección (LDD).

Tubo No. A480 A480 (𝑦 − 𝑦̂1 ) (𝑦 − 𝑦̂1 )2

Ajustada por Diferencia de A480
regresión lineal y A480 ajustada
1 0.020 0.050 -0.030 0.00090
2 0.059 0.082 -0.023 0.00053
3 0.121 0.131 -0.010 0.00010
4 0.208 0.196 0.012 0.00014
5 0.290 0.277 0.013 0.00017
6 0.349 0.358 -0.009 0.00008
7 0.451 0.439 0.012 0.00014
8 0.534 0.520 0.014 0.00019
9 0.628 0.601 0.027 0.00073
10 0.678 0.682 -0.004 0.00001
11 0.848 0.844 0.004 0.00001
12 1.211 1.168 0.043 0.00185
13 1.777 1.816 -0.039 0.00152

∑ = 0.00638

De acuerdo con la ecuación

∑ (𝑦 − 𝑦̂1 )2
𝑆𝐵 = √
𝑛−2

Donde

𝑆𝐵 = desviación estándar del blanco, también 𝑆𝑦/𝑥 que es la desviación estándar de los residuos de y.

0.00638
𝑆𝐵 = √ = 0.02408
13 − 2
Y utilizando la siguiente ecuación

𝑦 = 𝑦𝐵 + 3𝑆𝐵
igualando con la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración 𝑦 = 0.1393𝑥 + 0.03438

0.03438 = 𝑦𝐵
0.1393 𝑥 = 3 𝑆𝐵
3𝑆
𝐵 3(0.02408) 𝜇𝑔
Por lo tanto: 𝑥 = 𝐿𝐷𝐷 = 0.1393 = 0.1393
= 0.5187 𝑚𝐿
𝑑𝑒 𝐹𝑒

Método de Ringbom para determinar el %Ep

Para este método se necesita conocer la absortancia.

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 100 − %𝑇
Sabemos que: 𝐴 = 2 −𝑙𝑜𝑔 𝑙𝑜𝑔 (%𝑇)

Por lo tanto: %𝑇 = 102−𝐴

Las ecuaciones anteriores fueron aplicadas a cada tubo para los datos requeridos.

Así para el primer tubo tenemos:

%𝑇 = 102−0.020 = 95.49
𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 100 − 95.49 = 4.51

Tubo No. Fe3+ (μg/mL) log [Fe3+] A480 %T Absortancia

1 0.1163 -0.9344 0.020 95.49 4.51

2 0.3490 -0.4571 0.059 87.29 12.71
3 0.6980 -0.1561 0.121 75.68 24.32
4 1.1633 0.0656 0.208 61.94 38.06
5 1.7450 0.2417 0.290 51.28 48.72
6 2.3266 0.3667 0.349 44.77 55.23
7 2.9083 0.4636 0.451 35.39 64.61
8 3.49 0.5428 0.534 29.24 70.76
9 4.0716 0.6097 0.628 23.55 76.45
10 4.6533 0.6677 0.678 20.98 79.02
11 5.8166 0.7646 0.848 14.19 85.81
12 8.1433 0.9108 1.211 6.15 93.85
13 12.7966 1.1070 1.777 1.67 98.33
 G r á f ic a d e R in g b o m

a b s o r ta n c ia

100

50

- 1 .0 - 0 .5 0 .0 0 .5 1 .0
3+
lo g [F e ]

A480 %T Absortancia
corregida
0.050 89.13 10.87
0.082 82.80 17.20
0.131 73.97 26.03
0.196 62.68 36.32
0.277 52.85 47.15
0.358 43.86 56.14
0.439 36.40 63.60
0.520 30.20 69.80
0.601 25.07 74.93
0.682 20.80 79.20
0.844 14.33 85.67
1.168 6.80 93.20
1.816 1.53 98.47
 G r á f ic a d e R in g b o m ( c o n A b s o r b a n c ia c o r r e g id a )

a b s o r ta n c ia

100

50

- 1 .0 - 0 .5 0 .0 0 .5 1 .0

3+
lo g [F e ]

De la gráfica de Ringbom con Absorbancia corregida se tomaron en cuenta sólo los valores de los tubos 5 a
10 para la elaboración de la siguiente gráfica, ya que presenta mejor linealidad en ese intervalo a
comparación de la gráfica donde no se utilizó la absorbancia corregida para calcular la transmitancia y la
absortancia, donde no se distingue una linealidad para mínimo 5 puntos en la gráfica.
 G r á f ic a d e R in g b o m ( lin e a l)

100

A b s o r ta n c ia

50

0
0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8
3+
lo g [F e ]

𝑦 = 75.75 𝑥 + 28.62 𝑟 2 = 0.9998

Obteniendo de la recta anterior la pendiente m= 75.75, se obtiene el Error fotométrico de la ecuación:

230.3
%𝐸𝑝 =
𝑚
230.3
%𝐸𝑝 = = 3.04%
75.75

Efecto del tiempo en la estabilidad del color.

Tiempo (min) A480

0 0.533
30 0.488
60 -
90 -
120 -
*Sólo se registraron dos tiempos por errores cometidos en el experimento.
 E f e c t o d e l t ie m p o e n la e s t a b ilid a d d e l c o lo r .

0 .5 4

0 .5 2

0 .5 0

0 .4 8

0 .4 6
0 10 20 30

a) ¿Es estable el color?

No es estable.

b) ¿Cuál es el tiempo óptimo para hacer las lecturas?

En el tiempo cero, es decir al momento de efectuar la reacción frente al espectrofotómetro, es el

tiempo óptimo.

Efecto de la concentración del cromógeno.

Para la concentración de SCN-

0.5 𝑚𝑜𝑙 58.084 𝑔 1000000 𝜇𝑔
[𝑆𝐶𝑁 − ] = . . = 29042 𝜇𝑔/𝑚𝐿
𝐿 𝑚𝑜𝑙 1𝑔
Así para el tubo 1

𝐶1𝑉1 (29042)(0.05 𝑚𝐿 𝑁𝐻4 𝑆𝐶𝑁)

𝐶2 = = = 290.42 𝜇𝑔/𝑚𝐿
𝑣2 5 𝑚𝐿
 Tubo No. SCN- (μg/mL) Fe3+ (μg/mL) SCN-/Fe3+ A280
1 290.42 4.19 69.35 0.255
2 871.26 4.19 208.04 0.349
3 2904.2 4.19 693.46 0.436
4 5808.4 4.19 1386.91 0.542
5 8712.6 4.19 2080.37 0.608
6 11616.8 4.19 2773.83 0.447
7 14521 4.19 3467.29 0.667

De acuerdo con las gráficas, ¿qué concentración de tiocianato recomienda? Explique por qué.
Se recomendaría la concentración en el intervalo donde al observar la gráfica, exista una linealidad o la
absorbancia se mantenga constante, ya que de esta manera puede afirmarse que existe una reacción total
entre el cromógeno y el analito.

Efecto del pH en el desarrollo de color de la reacción entre el Fe3+ y el SCN-.

Tubo No. pH A480

1 1 0.825
2 1 0.845
3 2 0.867
4 3 0.747
5 8 0.012

E f e c t o d e l p H e n e l d e s a r r o llo d e l c o lo r .

1 .0

0 .8

0 .6

A 480

0 .4

0 .2

0 .0
1 1 2 3 8

pH

a) ¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido?

En medios ácidos existe un exceso de protones los cuales favorecen el complejo de coordinación.

b) ¿Cuál es el pH recomendado para que se efectúe la reacción de Fe3+ - SCN-?

Comparando los valores de la gráfica anterior se observa que a valores de pH bajos, es decir en medios
ácidos se obtiene una mayor absorbancia, lo que significa que se efectúa la reacción.
Efecto de algunos aniones sobre la absorbancia absoluta.

Anión A480 inicial A480 final

Fluoruro 0.881 0.153
Oxalato 0.881 0.108
Tartrato 0.881 0.852
Fosfato 0.881 0.853

3+ -
E f e c t o d e a lg u n o s a n i o n e s e n la r e a c c ió n F e - SCN

1 .0
B la n c o F lu o ru ro O xa la to T a rtra to F o s fa to

0 .8

0 .6

A 480

0 .4

0 .2

0 .0

a) ¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la reacción entre el ion férrico y el tiocianato?
la reacción del ion férrico y el ion tiocianato se efectúa de manera adecuada aún en presencia de los
aniones tartrato y fosfato.
b) ¿A qué se debe este efecto?

Se debe a la electronegatividad que presentan los distintos aniones.

Parámetros óptimos para el método del sulfocianuro de amonio para determinar fierro férrico.

Parámetro Valor óptimo

pH ácido
 Tiempo 0, al momento de efectuar la reacción
Concentración de SCN- mayor a 8712.6 y cercana a 14521 (μg/mL)
%Ep calculado 3.04%
Aniones que interfieren (en orden creciente) tartrato < fosfato < oxalato < fluoruro
Límite de detección del método 0.5187 (μg/mL) de Fe

⮚ Discusión.

Al observar la gráfica de la curva de calibración se determina una buena lectura de los datos de absorbancia
y el buen manejo de los reactivos para realizarla, ya que la curva presenta una buena linealidad y cumple la
Ley de Bouger y Beer. Sin embargo se decide realizarla también con la absorbancia corregida para
compararla con la primera.

Con los datos obtenidos de la curva se obtuvo el límite de detección del método utilizando las ecuaciones
correspondientes y obteniéndose un valor de 0.5187 (μg/mL) de Fe, que podría decirse que es un buen
valor al ser pequeño, y por lo tanto con alta sensibilidad, aunque comparándose este valor con los
obtenidos por otros métodos, por ejemplo para Emisión de plasma acoplado por inducción con un valor de
LDD = 0.7 ng/mL; Absorción atómica de llama con LDD = 5 ng/mL; Absorción atómica de horno de grafito
con LDD = 0.02 ng/mL; y para Plasma acoplado por inducción-espectrometría de masas con LDD = 0.008
ng/mL(1), este valor es relativamente grande, aunque el método tampoco es el más específico y los
instrumentos utilizados no fueron los más precisos, además de que también el analista también interfiere al
realizar el procedimiento de manera adecuada. De cualquier forma puede tomarse como un buen valor
para este método y por realizarse una sola vez.

La gráfica de Ringbom nos ayuda a obtener el porcentaje de error fotométrico, y de la misma manera que
ocurrió con la curva de calibración, se determinó realizar esta gráfica con los valores de absorbancia
corregida ya que al compararlas se observó mayor linealidad en la corregida, además de que en la que no
estaba corregida no se distinguía qué valores tomar como lineales; lo anterior es importante ya que
manejar una linealidad nos dice que cumple la Ley de Bouger y Beer, y esto podría afectar el resultado final
del porcentaje de error fotométrico si no se tomaran los valores que dan la linealidad. El valor obtenido fue
de 3.04% con lo cual puede decirse que hubo una buena exactitud del método.

Respecto al efecto del tiempo en la estabilidad del color, hubo el error en la práctica de desechar los tubos
antes de realizar todas las lecturas en los tiempos correspondientes, por lo que sólo se obtuvieron dos
valores, los cuales sí se graficaron y se observó una pendiente negativa, y el valor obtenido de absorbancia
en el tiempo cero fue mayor al obtenido a los 30 minutos. Esto nos dice que al paso del tiempo la reacción
pierde estabilidad, es decir el cromóforo formado no es estable al paso del tiempo. Aunque si quisiéramos
ser más precisos en cuanto a esta prueba tendría que realizarse en intervalos de tiempo más reducidos
para así determinar si en realidad sólo es estable en el tiempo cero.

Para el efecto de la concentración del cromógeno en la determinación de Fe, la gráfica obtenida tanto en
concentración de masa y molar fueron parecidas, y podría decirse que se presentan en dos modalidades o
partes, ya que al principio de la recta, es decir a bajas concentraciones del cromógeno se presenta curva, lo
que nos indica que aún existe analito por reaccionar, ya que este último se mantienen en concentración
constante a lo largo de toda la reacción. Luego tendría que mantener una linealidad, es decir mantenerse
constante la absorbancia ya que significa que existe un equilibrio entre el analito y el cromógeno, dado que
el analito en esta parte no depende de la concentración del cromógeno porque ya reaccionó solamente con
él, es decir, quizá exista cromógeno en exceso pero no afecta a la lectura de absorbancia porque esta sólo
detecta al complejo colorido (cromóforo formado); y se dice que se tendría que mantener lineal, porque
para este caso, en el experimento algo no se realizó de la manera adecuada ya que el penúltimo valor de
absorbancia es mucho menor al último y antepenúltimo valor. Pero observando la tendencia de aumento y
luego una “estabilidad” entre los valores mencionados sí se determina un intervalo de concentración de
cromógeno óptimo, que para este caso es mayor al antepenúltimo valor y parecido o similar al último valor
de concentración, registrado en la última tabla. Obteniéndose un promedio entre estos dos podría decirse
que sería de 11616.8 (μg/mL).

En el efecto del pH para el desarrollo del color en la reacción se observa que a valores menores, es decir
medios ácidos la absorbancia se presenta con mayor valor, y esto puede explicarse debido a que en medios
con exceso de protones el cloro presente debido al cloruro férrico atrae con mayor fuerza a estos protones
que al hierro, además de que podría interactuar con el ion amonio, lo que deja libre al hierro y reacciona
con el ion tiocianato formando el complejo colorido. En el otro caso para medios alcalinos, el ion hidroxilo
atrae con mayor fuerza al hierro formando hidróxido férrico y evitando la formación del complejo colorido.
De esta manera la reacción se efectúa de mejor manera en medios ácidos.

Por último al analizar el efecto de algunos aniones sobre la absorbancia absoluta se obtuvieron valores
mayores de absorbancia con los aniones tartrato y fosfato, es decir no afectaron significativamente la
reacción, a diferencia de los aniones fluoruro y oxalato. Lo anterior puede explicarse debido a las
electronegatividades de los aniones. Si bien no se encontraron las electronegatividades correspondientes a
cada anión, se deducen de la siguientes manera: los aniones con mayor electronegatividad son el fluoruro y
oxalato; el primero porque se encuentra en forma monoatómica y es el elemento con mayor
electronegatividad por sobre los demás elementos de la tabla periódica, y el segundo porque si bien el
oxígeno también es de los elementos con mayor electronegatividad, este se presenta acompañado de otro
elemento con menor electronegatividad, lo que le resta valor, es decir, lo hace menos electronegativo, por
lo que de igual manera afecta sí afecta la reacción pero de menor forma que lo hace el fluoruro.

Ahora los aniones tartrato y fosfato de igual manera tienen al oxígeno con alta electronegatividad, pero
como se mencionó antes, este se encuentra acompañado de otros elementos menos electronegativos, por
ejemplo el tartrato que fue el que menos afectó tiene cuatro átomos de carbono e hidrógeno que lo hacen
menos electronegativo a diferencia del fosfato que sólo tiene al elemento fósforo. Con esto se determina
que los aniones con mayores valores de electronegatividad podrían atraer con mayor facilidad al hierro y
desplazar al cromógeno. De esta manera, se determinó el orden creciente de los aniones que interfieren en
la reacción.

Conclusiones.
Se lograron utilizar tubos comunes de laboratorio para realizar los experimentos adecuados y trabajarlos
para los distintos factores que pudieran afectar el establecimiento de un método espectrofotométrico.

Se establecieron los parámetros óptimos para la aplicación del método espectrofotométrico de acuerdo
a las pruebas realizadas obteniéndose el límite de detección con valor de 0.5187 (μg/mL) de Fe y el
porcentaje de error fotométrico igual a 3.04%.

Los parámetros que afectan el establecimiento de un método espectrofotométrico son el tiempo, la

concentración del cromógeno, el pH y la presencia de algunos aniones con electronegatividades mayores
ajenos a la reacción; ya que al paso del tiempo la reacción no es estable, la concentración del cromógeno
para este experimento es de 11616.8 (μg/mL), el pH en el medio de la reacción debe ser ácido y los
aniones que afectan el método son el fluoruro y oxalato.

⮚ Bibliografía.

(1) Flame, furnace, ICP from R. J. Am. Lab. November 1993, p-24F. ICP-MS from T.T Nham, Am. August
1998

Skoog, A,. D.,. Principios de Análisis Instrumental. 2002. Quinta edición. McGrawHill (Pág. 220-222)