Esterilización: proceso (físico o químico), que destruye toda forma de

vida microbiana, incluidas las esporas. Esta definición excluye por lo

tanto, cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los mo o
atenuación de la actividad de cualquier tipo.
Conceptos Desinfección: tiene por objeto la destrucción de los mo con el fin de
básicos disminuir su número a niveles mínimos. Esto se logra mediante el uso
de agentes químicos (desinfectantes).
Asepsia: procedimientos utilizados para prevenir que los mo progresen
en un ambiente determinado (exclusión continua de mo contaminantes).
Ej. el trabajo de laboratorio es llevado a cabo asépticamente.

•Prevenir la infección de los humanos, animales y plantas

Razones •Evitar la descomposición de los alimentos y otros productos.
principales para •Evitar la interferencia por mo contaminantes, en procesos
eliminar a los industriales que dependen de cultivos puros.
mo •Prevenir la contaminación de materiales usados en el lab
 Aire caliente
Seco
Incineración
Calor
Pasteurización

Tyndalización
Húmedo
Físicos
Métodos Ebullición
de esterilización
Vapor a presión

Radiaciones

Filtración

Ultrasonidos o vibraciones sónicas

Agentes terapeúticos
Químicos Alcoholes
Fenol y compuestos afines
Tindalización
Calor seco: destruye a los microorganismos por oxidación de sus componentes
celulares.
Incineración
Esterilización de asa de
siembra por medio del
mechero Fisher.

Aire
Aire caliente
frío
Esterilización por
aire caliente en
horno (160°C- 2
horas). Material de
Aire vidrio.
caliente
Calor húmedo: destruye a los microorganismos por desnaturalización de sus
proteínas.

Vapor a presión
Temperatura de 121°C-15 minutos
Olla de presión o autoclave
Mejor método y más utilizado.
El vapor de agua cuando es
comprimido adquiere presión logrando
temperaturas altas.
 Esterilizar medios de cultivo, material sucio
de laboratorio ej. cajas Petri para desechar.

Las bacterias resisten mejor el calor

seco que el húmedo Pasteurización
 El punto crítico de muerte térmica, Temperaturas de 60ºC.
es, probablemente, la temp a la que  Utilizado para productos capaces de
se produce la coagulación de las descomponerse al ser expuestos a
proteínas; el agua es necesaria altas temp. Esterilización de algunos
para esta coagulación. medios de cultivo y soluciones de
azúcares (sufren degradación con las
las altas temperaturas)
Radiaciones
La radiación electromagnética esta formada por la combinación de campos eléctricos y
magnéticos, que se propagan a través del espacio en forma de ondas portadoras de
energía y no necesitan de un medio material para propagarse.
Las diversas radiaciones se clasifican en base a su longitud de onda; las longitudes
más cortas son más perjudiciales para los microorganismos.
Radiaciones no ionizantes (uv) longitud de onda 2.600 Angström )
 Mutaciones letales por su acción sobre los ácidos nucleicos.
Usos: en el control de áreas cerradas (gabinete de bioseguridad) en los
laboratorios; en la industria alimentaria para esterilizar superficies, purifcadoras
Radiaciones ionizantes (partículas alfa, beta, gamma, rayos X, rayos cósmicos)
 Efectos letales y mutagénicos
 Muy penetrantes, longitud de onda más corta (2.000 Angström ) que los uv
 Rayos gamma excelente poder de penetración, los más utilizados en la
irradiación de alimentos.
 Factores a considerar al aplicar las radiaciones
 Tipo de microorganismo: bacterias Gram (+) más resistentes a la radiación, que
las Gram (-). Los mo esporógenos más resistentes que los asporógenos. Las
levaduras más resistentes que los mohos, pero menos que Gram (+).
 Número de mo: cuanto mayor es el número, tanto menos eficaz es la dosis.
 Composición del medio en el que están suspendidos los mo: en soluciones tampón son
más sensibles que en medios que contienen proteínas.
Presencia o ausencia de oxígeno: mayor resistencia en ausencia de oxígeno que en su
presencia.
 Humedad: La resistencia de las células desecadas es considerablemente mayor que
la de las células que contienen humedad.
Edad de los microorganismos: más resistentes inmediatamente antes de la división
celular y se vuelven más sensibles conforme entran en la fase logarítmica.

Efecto de los agentes químicos

 Los alcoholes actúan como coagulantes de las proteínas; el alcohol etílico a conce. De
50-90% es efectivo contra células vegetativas, pero Ineficaz contra esporas bacterianas.
 El fenol se emplea como agente antimicrobiano a conc. de 0.5 al 2%. Actúa
desnaturalizando las enzimas intracelulares (coagulación de las proteínas).
 Los mo se encuentran formando poblaciones mixtas y heterogéneas:
biofilms (grupos de diferentes mo organizados en capas sobre una superficie
Estudio: necesario aislarlos de un cultivo mixto y cultivarlos para obtener
cultivos puros o axénicos (una sola especie, proveniente de una sola célula
El cultivo de mo: proporcionarles las condiciones físicas, químicas y
nutritivas adecuadas para su multiplicación de forma controlada.

 Técnicas de cultivo
En función de las características del medio: cultivos líquidos y
cultivos sólidos.
En función de la disponibilidad de nutrientes: cultivos discontinuos
(sistemas cerrados, no hay control de la densidad de población ni de la
velocidad del crecimiento. Periodo exponencial corto) y cultivos
continuos (sistemas abiertos, control de la densidad de la población y
velocidad de crecimiento. Periodo exponencial largo).
 Laboratorio: técnica de cultivo discontinuo (sistemas cerrados en el
que no se añaden nuevos nutrientes ni se eliminan los desecho.
Inoculación o siembra: transferencia de cierta cantidad de mo (inóculo) de un medio donde se
observa crecimiento, a un medio de cultivo apropiado para su crecimiento.
Inoculación en medios de cultivo sólidos
 Tubo inclinado: con asa en zig-zag.
 Tubo vertical : se inocula por picadura con aguja o varilla sin asa.
 Placa de Petri: por difusión (varilla de vidrio), por estría (con asa o hisopo) y por vertido
 Inoculación en medios de cultivo líquidos
 Tubos o matraces: asa o pipeta Pasteur para transferir el inóculo.
Métodos y técnicas de aislamiento para obtener cultivos puros

 Aislamiento en placa por estrías:

método más utilizado para obtener colonias
aisladas. Se realiza por distintas técnicas.
 La técnica de la estría cruzada consiste en
tomar una pequeña cantidad de crecimiento con
un asa estéril, frotar la muestra en uno y otro
sentido en forma de zig-zag en la superficie del
agar, hasta que se ha cubierto una tercera parte
del Ø de la placa. Se repite el procedimiento,
esterilizando el asa antes de realizar cada
conjunto de estrías. Por último, se traza una
estría muy abierta. El inoculo se va diluyendo
progresivamente de tal manera que a lo largo de
las últimas estrías se van desarrollando colonias
bien aisladas .
 Aislamiento directo de una sola célula
mediante un micromanipulador: Los
micromanipuladores controlan con precisión el
movimiento de una delgada aguja de vidrio que
toma una sola célula a partir de un cultivo mixto,
bajo observación al microscopio.

Enriquecimiento poblacional: Incrementar, en

una población mixta, el número de mo de interés en
relación al resto. Empleo de sustratos específicos o
ciertos inhibidores. Ej. caldo con tetrationato estimula el
crecimiento de S. typhi, pero inhibe el crecimiento de E.
coli. A partir de este cultivo, puede obtenerse fácilmente
cultivo puro por siembra en estría en un medio sólido
selectivo o diferencial.
Siembra por dilución: Tanto el vertido como la extensión en placa, son dos técnicas de
siembra por dilución. Las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra.
Vertido en placa: Se adiciona 1.0 ml de cada dilución de cultivo a las respectivas placas
de Petri y luego se vierte agar fundido y enfriado a 45ºC, se homogeneiza por rotación.
Sólo unas pocas colonias aparecen en la superficie; la primera dilución contiene
demasiados mo y las últimas suelen presentar colonias separadas, a partir de las cuales
se podrá obtener un cultivo puro, sembrando en un medio apropiado.
Diseminación o extensión en placa (siembra en superficie): Se emplea un distribuidor
estéril que consiste en una varilla de vidrio (espátula de Drigalsky) de 3 mm de diámetro,
doblada en ángulo recto y esterilizada. Se coloca en el medio 0,1 ml de la dilución sobre el agar
solidificado estéril y se esparce sobre la totalidad de la superficie empleando la varilla.
Placa de Petri: Por difusión (varilla de vidrio) o
espatula Drigalzky
 Diluciones

10 1
= = 1𝑋10−1 = 10−1
100 10

Factor de dilución: 101 102 103

Supongamos que cada ml de la muestra tiene 2500 UFC, al dividir entre 10, tendríamos
250 UFC/ml esa seria la dilución 10-1, al dividir esos 250 UFC/ml entre 10, tendríamos
25 UFC/ml esa seria la dilución 10-2, al dividir esos 25 UFC/ml entre 10, tendríamos 2.5
UFC/ ml esa seria la dilución 10-3.
Continuando con el ejemplo anterior, en las cajas de la dilución 10-1 Contariamos 250
colonias en cada una de las cajas o puede ser que en una encontremos 270 y en otra
230; 270+230 = 500; 500/2 = 250 como las cajas se siembran por duplicado se
suman los conteos y se divide entre 2 para sacar el promedio de la dilución.

Para calcular las UFC/ml se multiplica por el inverso de la dilución (factor de dilución),
el inverso de 10-1 es 10; entonces: 250*10 = 2500 es decir 2500 UFC/ml. Exactamente
la cantidad que tiene la muestra por cada ml.

En el caso de la dilución 10-2 esperaríamos un conteo de 25 colonias, entonces

multiplicaríamos por el inverso de la dilución: 25* 102 = 2500 UFC/ml, de nuevo
llegamos a la cantidad inicial que tiene la muestra.

Por ultimo en la dilución 10-3 tendríamos 2.5 colonias por caja, entonces multiplicamos
por el inverso de la dilución: 2.5 * 103 = 2500
Se reportaría como 2500 UFC/ml.

Es importante recalcar que si se tratara de un análisis real en el cual se esta

determinando las UFC/ml, se hubiera hecho con la dilución 10-1 puesto que se
recomienda considerar solo las diluciones en las cuales los conteos de colonias estén
en el rango 30 – 300 colonias.
Imagine que usted esta realizando un análisis de una muestra, en las cajas de la
dilución 10-1 cuenta mas de 300 colonias, en las cajas de la dilución 10-3 cuenta menos
de 30; sin embargo en las 2 cajas de la dilución 10-2 cuenta 72 colonias en una caja y
77 colonias en la otra.
¿Cómo reportaría los resultados?

Placa 1: 72
Placa 2: 77

72+77 = 149

149/2 = 74.5

74.5* 102 = 7450

Se reportan 7450 UFC/ml de muestra.

Imagine que usted esta realizando un análisis de una muestra, en las cajas de la
dilución 10-1 se observa un césped bacteriano, en las cajas de la dilución 10-2 cuenta
380 y 320 colonias respectivamente; en las 2 cajas de la dilución 10-3 cuenta 26 y 28
colonias respectivamente.
¿Cómo reportaría los resultados?

Cajas de la dilución 10-1:

No es posible contar, por lo tanto no Por ultimo se promedian los valores de
aplica ambas diluciones:

Cajas de la dilución 10-2: 35000+27000 = 62000

380+320 = 700 62000/2 = 31000
700/2 = 350
350*102 = 35000 Se reporta como 31000 UFC/ml de
35000 UFC/ml muestra.

Cajas de la dilución 10-3:

26+28 = 54
54/2 = 27
27*103 = 27000
27000 UFC/ml
Cultivo de microorganismos anaerobios estrictos
Siembra en tubo con capa de parafina: Inocular con asa un tubo
que contenga agar fundido a 45ºC, sin agitar para evitar la oxigenación del
medio. Esperar a que solidifique el agar y añadir una capa de parafina estéril

Jarra de anaerobiosis: Proporciona una atmósfera anaerobia

utilizando un sobre comercial (borohidrato sódico, bicarbonato sódico y
ácido cítrico). Acoplado a la tapa se coloca un catalizador de paladio.

 Medios PRAS: Empleo de medios sólidos pre-reducidos y esterilizados

anaeróbicamente (PRAS) en tubos que se enfrían en rotor con lo cual su
sup. interna queda recubierta con una fina capa de medio en forma espiral
einoculado con los mo. Requieren un agente reductor.

Cultivos profundos o batidos: Se utilizan tubos con medio sólido a

45ºC, se inoculan y se mezcla por rotación. Los mo. anaerobios crecen en
el fondo del tubo.

Técnica de la tapa de Brewer: Se utilizan medios de cultivo

reducidos. La tapa de la placa de Petri, es reemplazada por la tapa de
Brewer (atmósfera de CO2) .
Cultivo de microorganismos microaerófilos
Jarra de anaerobiosis: Los microaerófilos necesitan cierta concentración de CO2 y
O2 en la atmósfera. Esto se consigue en las "jarras de anaerobios" utilizando sobres
generadores especiales para atmósferas microaerófilas.
Estufas de cultivo: En las estufas de cultivo se consigue utilizando una "estufa de
anaerobiosis" en la que se regula convenientemente las concentraciones de CO2 y O2.

Cultivo de microorganismos fotosintéticos

Para el cultivo de microorganismos fotosintéticos (algas, bacterias fotosintéticas), la
luz es un requerimiento esencial.
Si se exponen los cultivos a la luz del día, será una iluminación relativamente
incontrolable y discontinua.
 Los mo fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación que no
debe plantear problemas de variación de temperatura: lámparas fluorescentes con un
desprendimiento mínimo de calor.
 ¿Qué es un medio de cultivo?
 Conjunto de sustancias nutritivas que se les proporciona a los mo. para
su desarrollo en el laboratorio.
 Emplean los nutrientes para producir energía y elaborar nuevos
componentes celulares.
 La composición precisa de un medio de cultivo adecuado dependerá de
la especie que se quiere cultivar.

Constituyentes básicos de los medios de cultivo

 Fuentes de energía: Orgánicas (carbohidratos, proteínas, polisacáridos, grasas,

ácidos orgánicos,...) e inorgánicas ( amonio, nitritos, azufre…)
 Componentes estructurales: macronutrientes, micronutrientes y factores de
crecimiento (aminoácidos, purinas, pirimidinas y vitaminas).
 Agua
 Requerimientos nutritivos de los microorganismos
Mo. tienen distintas necesidades nutritivas, basadas en mecanismos de síntesis propios y
rutas metabólicas, cada especie requiere condiciones particulares

La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los ingredientes químicos

necesarios para la síntesis de monómeros, componentes de las macromoléculas que a su
vez, constituyen las estructuras celulares.

Requerimientos nutritivos: macronutrientes, micronutrientes y factores de crecimiento.

Monómeros Macromoléculas Estructuras

celulares
Monosacáridos Polisacáridos Pared celular, glucocalix

Aminoácidos Proteínas Membrana, ribosonas, pilis

y fimbrias, enzimas
Ácidos grasos Lípidos Membrana
Bases nitrogenadas Ácidos nucleicos Cromosomas, ribosomas,
plásmidos
Los mo se dividen en categorías nutricionales con base a su naturaleza de la fuente de
energía, de la fuente de carbono y por la naturaleza de los donadores de e-

 Fotoautótrofos: dependen de la luz como fuente de energía y utilizan CO2 como

principal fuente de C inorgánico (archaeas, bacterias fotosintéticas, algas)

 Fotoheterótrofos: utilizan luz como fuente de energía y emplean compuestos orgánicos

como fuente de C (algunas bacterias fotosintéticas y algas eucarióticas)

 Quimioautótrofos: fuentes de energía química proveniente de compuestos inorgánicos

reducidos (H2, S2-, NH4+, entre otros) y utilizan CO2 como fuente de C.
 Quimioautolitótrofos: utilizan donadores de electrones inorgánicos como las
bacterias oxidantes del nitrito, del amonio, del azufre, del hierro, del hidrógeno
(aerobias) y bacterias denitrificantes (anaerobias).
 Quimioautoorganótrofos: utilizan donadores de electrones orgánicos (bacterias)

 Quimioheterótrofos: utilizan compuestos orgánicos como fuente de energía y carbono.

Los compuestos orgánicos también se comportan como fuente de donadores de electrones.
Todos los hongos, protozoos y la mayoría de las bacterias.
Macronutrientes
 Captados por los mo. en grandes cantidades. C, O, H, N, S y P. componentes de
carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. g/L de medio de cultivo.
 C. H y O: Las necesidades de CHO suelen cubrirse simultáneamente. C fuente de
energía. Necesario para construir el esqueleto de todas las moléculas orgánicas. Las
moléculas que son fuente de C aportan también átomos de H y O.
 N y S: Se encuentran en las células en forma reducida como grupos amino y sulfhidrilo;
algunos mo. los asimilan en forma oxidada. Sulfatos, nitratos, peptonas (N y S) y
cisteina. Fijación de N2
 N, P y S: Se deben incorporar a los medios, en grandes cantidades. Pueden adquirirse
a partir de los mismos nutrientes que aportan C, los mo. suelen emplear también
fuentes inorgánicas.
 N: necesario para sintetizar a.a., purinas, pirimidinas, ácidos nucleicos y
coenzimas.
 P: constituyente de ácidos nucleicos, fosfolípidos, nucleótidos como ATP, varios
cofactores, algunas proteínas y otros componentes celulares.
 S: necesario para la síntesis de a.a. cisteína y metionina (constituyentes de
proteínas) y CoA (coenzimas)
Micronutrientes
 Se encuentran en la célula en forma de cationes, desempeñando varias funciones. Se
utilizan en mg/l en medios de cultivo.
 K+: necesario para actividad de enzimas, entre ellas algunas que participan en la
síntesis de proteínas.
 Ca2+: contribuye a la termorresistencia de endosporas.
 Mg2+: actúa como cofactor de muchas enzimas, forma complejos con el ATP y
estabiliza los ribosomas y las membranas celulares.
 Fe2+ y Fe3+: Forma parte de los citocromos y es cofactor de enzimas y de proteínas
transportadoras de electrones.

 Algunos se requieren en cantidades muy pequeñas. Son parte de enzimas y cofactores;

facilitan la catálisis de reacciones y mantenimiento de la estructura de proteínas. Deben
estar disponibles en cantidades de g.: Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, Cu2+. .

Factores de crecimiento
 Componentes orgánicos que los mo. son incapaces de sintetizar y son suministrados en
pequeñas concentraciones. Existen tres clases principales:
 Aminoácidos : síntesis de proteínas
 Purinas y pirimidinas: síntesis de ácidos nucleicos
 Vitaminas: forman parte de los cofactores enzimáticos; constituyen grupos
prostéticos o centros activos de ciertas enzimas.
 Clasificación de los medios de cultivo
De acuerdo al estado físico
 Sólidos: Adición de un agente solidificante como el agar (polisacárido producido por
algas rojas), que gelifica por debajo de 45ºC. El agar se usa a una concentración del
1,5%.
 semi-sólidos que contienen de 0,3-0,5% de agar, usados para evaluar motilidad.
 Líquidos: Caldos. No contienen agar.

De acuerdo a la naturaleza química de sus componentes

 Sintéticos o químicamente definidos: Composición química definida cuali y
cuantitativamente (comerciales)
 Complejos o químicamente indefinidos. peptona, extracto de levadura, extracto
de carne, macerado de maíz… Se desconocen los componentes y las cantidades
De acuerdo a sus uso
 Selectivos. Favorecen el crecimiento de un mo o grupo de éstos, en particular. Útil
para el aislamiento de mo a partir de una población mixta. Ej. agar SS
 Diferenciales: Contienen indicadores que diferencian unos mo de otros. Ej. Mac-
Conkey, EMB…distingue a los mo que fermentan de los que no fermentan la lactosa.
 Enriquecidos: Empleados para el cultivo de mo delicados que no crecerían en un
medio básico. Se les añaden nutrientes como sangre, suero, chocolate, entre otros.
 Medios líquidos a los que se incorpora sustancias que inhiben el crecimiento de mo
para los cuales eran anteriormente adecuado. Ej. selenita F.
 De mantenimiento: utilizados para preservar las características fisiológicas y la
viabilidad de un cultivo. Ej. Suprimir a glucosa (exacerba el crecimiento)
 De prueba: Usados para el ensayo de vitaminas, amiinoácidos, antibióticos…
 Diseño y formulación de los medios de cultivo
 Diseño: Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento.
 Formulación: Aspectos cuantitativos de los medios de cultivo considerando los
requerimientos nutricionales del mo y la disponibilidad real de los componentes.

La definición química del medio de cultivo ha de vincularse con los tipos microbianos:
Heterótrofos : glucosa, sulfato de amonio , fosfato monobásico de K, NaCl, CaCl
Autotótrofo: Amoniaco, sales de sulfato, sales de fosfato, NaCl, cationes (Cu, Mo…)

Los nutrientes además de estar presentes en el medio de cultivo, deben estar disueltos para estar
disponibles para los microorganismos

¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR DISPONIBLES?

Reacciones entre componentes antes, durante o después de la esterilización.

 Los aa y factores de crecimiento son muy lábiles al calor. Estererilización por filtración.
 Las sales de NH4 + se volatilizan. Esterilizar a pH 7 o menor.
 Los azúcares pueden descomponerse por la acción del calor en presencia de sales
inorgánicas.
 Preparación y esterilización de los medios de cultivo

 Prepararlos sólo a partir de productos de calidad. Leer las instrucciones de preparación

 Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado según el volumen requerido.
 Disolver la porción pesada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en agua
destilada o desmineralizada.
 Cuando se prepara un medio líquido, en ocasiones se requiere de calentamiento, pero
generalmente no es necesario para disolver sus componentes.
 La preparación de los medios de cultivo sólidos requiere el calentamiento (el agar es
insoluble en agua) a 100ºC. NO sobrecalentar ya que el medio puede derramarse:
recomendable utilizar un matraz de una capacidad mayor al volumen del medio.
 Ajustar el pH de cada lote de medio preparado a temperatura ambiente (25ºC),tomando
una alícuota de 50 ml, medir el pH y de ser necesario ajustarlo con HCl o NaOH 0,1 N.
Luego hacer el ajuste de pH al resto del medio utilizando las soluciones 1N.
 Los medios líquidos son vertidos en tubos de cultivo o matraces; los sólidos son vertidos
ya sea en tubo de cultivo que una vez estériles se dejan solidificar rectos o en plano
inclinado. Si el medio va a ser vertido en placa, se esteriliza en matraz Erlenmeyer con
tapa de algodón envuelto en gasa y sobre éste, se coloca un trozo de papel metálico.
 Identificar el lote de medio preparado indicando nombre y fecha de preparación.
 Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Mayoría:
calor húmedo en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Existen medios que requieren
esterilizarse en baño María a temperaturas de pasteurización (60ºC) durante 15-20
minutos, Algunos otros medios no requieren esterilización.
 Conservación de los medios de cultivo

 Medios de cultivo deshidratados

 Se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el
fabricante.
 Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25ºC), con poca
humedad y protegidos de la luz solar directa.
 Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o
vapor. Sufren hidratación.
 Deben ser descartados cuando se hidraten o decoloren.

 Medios de cultivo preparados

 Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe
almacenar entre 2 y 8ºC, a menos que el medio requiera alguna condición
diferente.
 Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación.
 Cuando se usa tapón de algodón para cerrar el matraz que contiene el medio de
cultivo, se debe colocar por encima, una envoltura de papel metálico.
 Técnica empleada para producir imágenes visibles de estructuras
o detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple
vista. Consiste en el aumento del objeto a observar, dado que el
Imagen
ojo en retina
ojo humano tiene un poder de resolución de 0,1 mm (100 µm), y
los mo tienen tamaños inferiores (0.5 µm) Lentes del ojo
Lentes del
ocular
Imagen de
la muestra

Microscopía Lentes del

objetivo

Muestra
Lentes del
condensador

Fuente de luz
 Microscopía óptica
Microscopía de campo claro

 Utiliza luz visible y lentes ópticas para aumentar

la imagen. Su poder de resolución puede llegar a
0,2 nm , con lo que un objeto puede ser ampliado
un máximo de 1500 veces. Implica el paso de luz
transmitida o reflejada desde el objeto de
estudio mediante una serie de lentes, para ser
detectada directamente por el ojo.
 Microscopía de campo oscuro Microscopía de contraste de fases

Las células tienen un índice de refracción distinto

del medio que las rodea.

Volvox
CLARO CONTRASTE OSCURO

Spirogyra

Se utiliza para visualizar mo vivos sin teñir,

se ven refringentes en un fondo oscuro Saccharomyces cerevisiae
 Microscopía de fluorescencia
Microscopía electrónica
Lámpara de arco de
vapor de mercurio Utiliza haces de electrones y como lentes
funcionan unos electroimanes.
Filtro de calor

Filtro excitador
De transmisión: dirige el haz de electrones
Condensador de
Campo oscuro Filtro de hacia el objeto que se desea aumentar. Aumento
Barrera hasta 1 millón veces
Muestra
teñida

Lentes del Ocular

Espejo objetivo

De barrido: produce imágenes tridimensionales

realistas de la superficie del objeto

La sustancia fluorescente se une a un

anticuerpo específico del mo y éste emite
fluorescencia y se puede identificar.
 Preparación de muestras para su observación al
microscopio óptico

Preparaciones adecuadas, mediante 2 técnicas generales en las que los mo. pueden ser
examinados sin teñir ó teñidos.

 Preparaciones en fresco: hace posible la observación de los mo vivos

suspendidos en un líquido.
 Cuando: 1) La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen. 2)
Las bacterias se observan para determinar movilidad. 3) Se requiere observar los
cambios citológicos que ocurren durante la división celular. 4) Se requiere
observar algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa.

 Preparación de frotis desecados, fijos y teñidos de los mo.

 Para observar las características morfológicas de los mo.
 Identificación y diferenciación de mo. entre especie y dentro de la misma especie
(tinción diferencial o selectiva).
 Diferenciar estructuras microbianas.
 Procedimiento para la preparaciones en fresco

1. Colocar una gota de SSF o agua en 2. Tomar la muestra con el asa de

un porta siembra o un gotero

Muestra

Porta objeto
Preparación en fresco con modificaciones
 Hongos filamentosos
 NaOH 10% (hifas)
 Azul de lactofenol
(micelio, hifas y esporas)
Procedimiento para una preparación en fresco en gota
pendiente
Procedimiento para la preparación de frotis
Procedimiento para la preparación de frotis teñido
 Técnicas de tinción

 Colorante: compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún
componente, usados para aumentar el contraste.

 Algunos pueden utilizarse a concentraciones que permiten observar mo vivos

(colorantes vitales). La mayoría sólo son efectivos después de fijar los mo.

 Los colorantes básicos (azul de metileno, fucsina básica, cristal violeta, safranina,
verde malaquita) son cationicos o tiene grupos con carga + y se unen a moléculas
cargadas -, como ácidos nucleicos y proteínas.

 Los colorantes ácidos (eosina, rojo congo, fucsina ácida) son aniónicos o poseen
grupos con carga -, y se unen a estructuras celulares con carga + .

 Mordiente: sustancias que aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Se añaden

después del colorante en determinadas tinciones diferenciales. Ej. lugol.
 Tinciones: Simples, diferenciales y específicas

 Simples: En las tinciones simples se usa un único colorante de carácter básico. Todas
las células de la preparación quedan teñidas y se observan del mismo color.

 Diferenciales: Para distinguir entre tipos de mo. Se basan en el uso de 2 colorantes.

Se realiza una tinción primaria, con la misma técnica de la tinción simple y
posteriormente una tinción de contraste para teñir las células que no se hayan teñido
previamente. La tinciones diferenciales más importantes son la de Gram y la tinción de
Ácido-Alcohol Resistencte.

 Específicas: Revelan estructuras

celulares. Se pueden teñir selectivamente
las esporas, los flagelos o las cápsulas.
 Lunes

Tinción simple
Frotis y fijación

1.- Poner una gota de agua 2.- Tomar la muestra con el 3.-Extender sobre el agua y
en un porta asa de siembra fijar a la llama del mechero
Tinción

1.- Cubrir la preparación 2.- Lavar con agua, dejar secar y Micrococcus luteus
con Azul de Metileno 1-2 observar al microscopio
minutos.
 Lunes

Tinción diferencial: Utiliza dos o

más colorantes para distinguir entre tipos de
mo. Etapas: tinción primaria y tinción de
contraste. Ej. Tinción de Gram y Ziehl -
Neelsen

1. Cubrir la preparación con 2. Añadir lugol

Tinción de Gram cristal violeta 2’, retirar el (mordiente)
colorante NO lavar durante 1’

3. Decolorar con 6. Lavar con agua,

Alcohol-acetona 20 4. Escurrir el alcohol 5. Teñir con safranina secar y observar al
seg 30 seg microscopio
Tinción de Gram

Diferencias en la pared
celular

Bacterias Grampositivas: Gruesa

capa de peptidoglucano, ácidos
teicoicos y ipoteicoicos, proteínas,
espacio periplásmico pequeño.

Bacterias Gramnegativas:
Delgada capa de peptidoglucano,
lipopolisacáridos y lipoproteínas,
proteínas (pórinas), espacio
periplasmático grande.
 Miercoles

Tinción de Ziehl-Neelsen: Diferencia micobacterias, bacterias con ácidos

micólicos en su pared celular pertenecientes a los géneros Mycobacterium y Nocardia. Los
ácidos micólicos hacen que las microbacterias resistan la decoloración con una mezcla de
ácido y alcohol .

3. Calentar con un hisopo de

algodón empapado en alcohol y 4.Lavar con agua y
1. Hacer un frotis a 2. Cubrir la
prendido con la llama del decolorar con
partir de un cultivo preparación con
mechero hasta la emisión de alcohol ácido 30 seg
de M ycobacterium Fuchina fenicada
vapores. Mantener 5 min

6. Lavar con agua,

5.Teñir con Azul dejar secar y
Ácido-alcohol resistente: rosa
de Metileno 1’ observar al
microscopio No ácido-alcohol resistente: azul
 Miercoles
Tinciones específicas
Tinción
Frotis y fijación
Tinción de esporas (Wirtz-Conklin)

2. Tomar la muestra de 3.Extender sobre el agua y 1.Cubrir la preparación

1.Poner una gota de fijar a la llama del mechero
agua en un porta un cultivo de Bacillus con Verde Malaquita

5. Lavar con agua, dejar

2.Calentar, con un
secar y observar al
hisopo de algodón 3.Lavar con agua 4.. eñir con Safranina 1’
microscopio
empapado en
alcohol y prendido Esporas
con la llama del
mechero, hasta la
emisión de vapores.
Mantener caliente Bacterias
durante 5 minutos.
Tinción de flagelos de Leifson
Se fija químicamente la suspensión bacteriana con formol y se hace la
extensión en un portaobjetos. Se deja secar al aire. Se cubre con una
mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina. El ácido tánico
engruesa los flagelos y la rosanilina los tiñe. Se retira el exceso de
colorante con agua. Se deja secar al aire y se observa al microscopio.

Tinción negativa para cápsulas: Para visulizar cápsulas. Las

partículas del colorante no pueden penetrar a la cápsula, que se observa
como una zona clara y transparente, alrededor de la célula, que aparece
refráctil sobre un fondo oscuro. Se coloca una gota de nigrosina al 10%
en un porta; tomar muestra del mo y mezclar con la nigrosina
extendiendo ; dejar secar al aire y observar.

Tinción para fluorescencia: Se utilizan sustancias simples

fluorescentes o anticuerpos unidos a sustancias fluorescentes
que deben observarse en microscopios especiales de
fluorescencia
 Métodos y técnicas para la identificación microbiana
Establecer la identidad de un microorganismo, implica la combinación de varios métodos

Métodos basados en criterios morfológicos

 Morfología microscópica: Forma y agrupación celular; características
de las hifas y micelio, tipo de esporas; aspecto de células vegetativas…
Preparaciones en fresco utilizadas para la observación.

 Morfología macroscópica: aspectos del crecimiento en los diferentes

medios (morfología colonial, producción de pigmentos, crecimiento en
forma de película en la superficie de los medios líquidos (levaduras
formadoras de película), o crecimiento en toda el medio.

Métodos basados en tinción diferencial

 Tinción de Gram bacterias Gram positivas o negativas
 Tinciones fluorescentes (naranja de acridina, rodamina)
 Tinción de Ziehl-Neelsen para diferenciar micobacterias
 Métodos basados en pruebas bioquímicas

 Se fundamentan en demostrar si el mo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de

enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados.
 Las bacterias muy relacionadas pueden separase en dos especies diferentes con base a
pruebas bioquímicas.
 Las bacterias entéricas Gram – forman un grupo grande y heterogéneo. La familia
Enterobacteriaceae incluye a varios patógenos como los géneros Escherichia,
Salmonella, Shigella, Citrobacter, Enterobacter...
 Los géneros Escherichia, Enterobacter y Citrobacter, fermentan la lactosa con producción
de ácido y gas a diferencia de los géneros Salmonella y Shigella que no fermentan la
lactosa.
Existen flujogramas, como el que se describe a continuación para la identificación
bacteriana, mediante pruebas bioquímicas. Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo
Gram (-), facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, indica la presencia de una
enterobacteria, para determinar su género se puede seguir el siguiente esquema.
 Sistemas comerciales para pruebas bioquímicas
 Sistemas miniaturizados de identificación en los que, en un solo paso, se examinan
varias pruebas bioquímicas. API, Enterotube, Minitek, MicroID…
 BBL, ENTEROTUBE II. Sistema para la identificación de Enterobacterias. Consiste en un
tubo de plástico con 12 medios de cultivo que se inoculan simultáneamente y permiten la
detección de 15 características bioquímicas.

 API20E. Sistema estandarizado que consiste en una plantilla con microtubos conteniendo
medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión
bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia
 Métodos basados en tipificación con fagos
 El uso de fagos específicos para identificar y subclasificar bacterias
dentro de una misma especie. La interacción entre un virus bacteriano
(fago) y su célula bacteriana es específica, ya que el proceso de
adsorción se encuentra mediado por receptores específicos
 .A una placa con medio de cultivo sólido inoculado con un cultivo puro
de la bacteria, se le añade una alícuota de un fago específico; éste
puede ocasionar la lisis de las bacterias, que se evidencia en el cultivo
como zonas claras definidas, denominadas placas o zonas de muerte.

Métodos basados en Biología Molecular

 Detectan determinadas secuencias de DNA propias de un determinado mo. PCR (Polymerase
Chain Reaction) para la identificación de mo que no pueden ser cultivados por los métodos
convencionales. Puede aumentarse la cantidad de DNA mediante electroforesis o sondas de
DNA. Proceso exponencial,en cada ciclo se duplica la región de DNA. Termociclador.

Métodos basados en ensayos serológicos

 Se basan en la reacción de un antígeno introducido en el mo provocando su anticuerpo
correspondiente. Los serotipos permiten diferenciar mo a nivel de subespecie.
 Inmunofluorescencia: Usa sustancias fluorescentes (rodamina o fluoresceína) y una vez
efectuada la reacción antígeno-anticuerpo, se expone a la radiación uv para visualizarla.
 Inmunoensayos: ELISA (Enzyme-linked immunoabsorbent assay). Utiliza anticuerpos
marcados con una enzima. Detección e identificación de virus, E. coli…
 Sistema miniaturizado de antisueros.
 Objetivos
Mantener los cultivos viables a lo largo del tiempo, puros sin contaminaciones, además,
sin cambios en sus características genéticas, es decir estables genéticamente.

¿Qué son las colecciones de cultivo? ATCC… agrupadas en World Federation for
Culture Collection (WFCC)

Congelación: Disminuye la actividad metabólica de una célula a muy bajas temperaturas

por la disminución del agua disponible. Garantiza la estabilidad genética manteniendo la
pureza. Se usan temperaturas de -70°C: nieve carbónica (CO2 sólido) y -196°C: nitrógeno
líquido (algas y virus). Tiempo de conservación hasta 25 años.

Liofilización: Se basa en la paralización del metabolismo celular por falta de agua: Primera
etapa congela el agua libre de las células y segunda etapa la elimina por sublimación.
Método útil para conservar la mayoría de los mo excepto para algas. Reduce la variabilidad
genética. A mayor tamaño celular, menor eficiencia del método (25-30 años). Muy costoso.

Subcultivos: los mo permanecen activos durante el proceso. Consiste en la inoculación de

mo en un medio de cultivo adecuado e incubación a una T adecuada para obtener
crecimiento y finalmente el almacenamiento al mantenerlos a 4°C se conservan de 1- 3
meses. bajo unas condiciones adecuadas. El proceso es repetido a intervalos que
garanticen la obtención de un cultivo fresco antes de la pérdida del viejo.
Desecación: Se basan en detener el crecimiento celular al eliminar el agua disponible. La
eliminación del agua reduce drásticamente el metabolismo. Necesario añadir agentes
protectores (leche descremada, glutamato sódico%). Soportes: arena, suelo, sílica gel o
sal (halobacterias), previamente secados y esterilizados por calor seco. Útil para conservar
mo productores de esporas, ej. Actinomicetos y hongos; además de mo que no resisten la
liofilización o la congelación (Spirillum).

G
E
R Desecación en
M suelo
I
20 minutos Tierra esteril N
121ºC 4ºC Microorganismos
P A
R en fase de latencia
C
O
T I
E 4-5días Ó Agotamiento
C 25ºC de
T
N
O nutrientes
Almacenamiento
R
a 18ºC
Cultivo Suspensión de
esporulado esporas

Aceite mineral:
 Crecimiento: Aumento ordenado de todos los
componentes químicos que llevan a un incremento
de los constituyentes y estructuras celulares, a la
división celular y al crecimiento de la población.
 Individual: los eventos de crecimiento hacen
referencia al ciclo celular. La duración del ciclo
celular coincide con el tiempo de generación

 Poblacional: Cinética del crecimiento, factores

que afectan al tiempo de generación (g) y los
factores ambientales que afectan al crecimiento.
 Cuando se siembra un mo en un medio de cultivo,
se divide empleando los nutrientes que el medio
les aporta para multiplicarse hasta agotarse algún
nutriente (sustrato limitante) o por acumulación de
desechos tóxicos: el crecimiento se detiene.

 Estequiométrico: La concentración final de mo

dependerá de la concentración y composición del
 La célula crece en tamaño medio de cultivo. Cinético: el que dirá con qué
 Duplica el cromosoma y se repararte velocidad se lleva a cabo el proceso.
 Se forma el tabique y surgen 2 células
El crecimiento de poblaciones
 El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos sus
individuos.
 Crecimiento asincrónico: cada mo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular
(células que acaban de dividirse, otras que están duplicando su DNA y otras que están
iniciando la división celular)
 En un crecimiento sincrónico todas las células se encuentran simultáneamente en la
misma fase del crecimiento celular.
 Las poblaciones de mo pueden crecer de una forma exponencial, incrementando la
población en un periodo de tiempo muy corto. El aumento de masa, por sí sólo, podría
no indicar un crecimiento real, ya que las células pueden estar incrementando
únicamente su contenido de productos de reserva

1•
2 ••
4 ••••
8 ••••••••
16 ••••••••••••••••
32 ••••••••••••••••••••••••••••••••
 Pluricelulares: aumento del tamaño del individuo.
 Unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, ocurre un aumento de la población:
aumento del nº de individuos
 En los mo cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se acompaña de división
celular): aumento del tamaño de la colonia cenocítica.
Crecimiento en un cultivo cerrado en medio líquido
En los cultivos cerrados o discontinuos (líquidos o sólidos), la fase exponencial de crecimiento
equilibrado o balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al
agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos. Se desarrolla a través de una
curva de crecimiento en la que se pueden diferenciar 4 fases. Si la bacteria crece en un medio
líquido, las células que se producen en cada división forman una suspensión de células libres.
Es el numero de generaciones que ocurren por unidad de tiempo
Es el numero de generaciones que ocurren por unidad de tiempo
Crecimiento en un cultivo cerrado en medio sólido
 Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso del cultivo
cerrado en medio líquido, se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de
crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células
viables por unidad de superficie o por unidad de masa.
 Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un sustrato sólido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina
unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada .
 Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de
las colonias da lugar a lo que se llama un césped cuando se realizan los cultivos en placas
de Petri.
 En el caso de mo móviles o en el de los hongos filamentosos no se producen colonias
aisladas sino formaciones más difusas o miceliales.
Crecimiento en un cultivo continuo (sistema abierto)
Cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo. A la cámara
de cultivo se le hace llegar un suministro de nutrientes, y de la que se eliminan los productos
tóxicos de desecho. Nutriente limitante (control del crecimiento microbiano). Condiciones
ambientales constantes. Cultivo en fase exponencial

En el quimiostato se
puede controlar de modo
independiente, la
densidad de la población
celular en equilibrio
(ajustando el factor de
dilución) y la velocidad de
crecimiento del cultivo
(variando la concentración
del nutriente limitante)

mo capaces de producir productos de interés (biomasa, metabolitos secundarios….).

  Determinación de componentes celulares (proteínas, ácidos nucl…)

Métodos indirectos para medir la masa celular

 Medida de consumo del nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad
de tiempo.
Contadores electrónicos: Se pasa una suspensión de
mo por un orificio a través del cual circula una corriente
eléctrica que detecta cada mo que pasa.
Placas Petrifilm
2. Determinación de coliformes fecales
Escala de Mc Farland
Determinación del crecimiento mediante una Curva de
crecimiento Bacteriano de una especie en particular.
Las cajas inoculadas en cada uno de los tiempos se incuban por un tiempo de 24-48
hrs, para posteriormente hacer el conteo respectivo.

Con los datos obtenidos de crecimiento en cada uno de los tiempos se construye una
recta patron en el espectrofotometro relacionando cada crecimiento con su DO
respectiva.
Una vez introducidos los datos en el
espectrofotometro , este puede indicarnos
el crecimiento que presenta una muestra
desconocida en base a su DO.
 NO. DE TUBOS POSITIVOS LÍMITES DE CONFIANZA (95%)

3 3 3 NMP/100
(10ml) (1 ml) (0,1 ml) ML Mínimo Máximo
0 0 1 3 0.5 9
0 1 0 3 0.5 13
1 0 0 4 0.5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
Se basa en la determinación de presencia o ausencia 3 1 0 43 7 210
(positivo o negativo) en réplicas de diluciones 3 1 3 75 14 230
3 1 2 120 30 380
consecutivas de atributos particulares de mo 3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
presentes en la muestra; las bacterias coliformes 3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
totales fermentan la lactosa con producción de ácido y 3 3 1 460 71 2400
gas, incubadas a 35  0.5C durante 24 a 48 horas y 3 3 2 1100 150 4800

las coliformes fecales y E. coli fermentan la lactosa

con producción de ácido y gas incubadas a 44.5ºC 
2C durante 24 h. La producción de gas se manifiesta
en las campanas de fermentación de Durham.
 Muchas gracias por su
atención

Se sabe más del camino por haber viajado en él que por

todas las conjeturas y descripciones del mundo.
William Hazlitt