UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CLAVE DE LA
CARRERA PLAN DE ESTUDIOS NOMBRE DE LA ASIGNATURA
ASIGNATURA
QFB 2009 BIOQUÍMICA

PRÁCTICA FECHA Y
NOMBRE DE LA PRÁCTICA
NÚMERO DURACIÓN
Revisión de métodos espectroscópicos y elaboración de
2 curva patrón de proteína. 1 sesión

1 INTRODUCCIÓN
El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de
moléculas biológicas. Esto quiere decir que este instrumento nos ayuda a determinar cuáles sustancias
(proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, entre otras), están presentes en una disolución y en
qué cantidad. Los espectrofotómetros pueden emitir radiaciones de diferentes longitudes de onda tanto
en el ultravioleta como en el visible.

Muchas sustancias absorben radiación a diferente longitud de onda (puede ser en el espectro visible o
en el ultravioleta), por tanto, cuando determinamos a qué longitud de onda absorbe una sustancia
desconocida, podemos tener idea de qué tipo de molécula se trata. Esta misma propiedad se utiliza para
cuantificar la sustancia: a mayor cantidad de radiación absorbida, mayor concentración de ésta. Si la
sustancia no absorbe radiación en el ultravioleta o el visible, puede modificarse químicamente para
producir un compuesto que sí absorba en estas longitudes de onda. A este tipo de mediciones se les
conoce como indirectas.

Leyes que rigen la espectrofotometría.

Cuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a través de una solución, parte de éste se absorbe, por
lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es menor al incidente P0. La relación entre ambos se
denomina transmitancia, T:

T= P/P0 ……………………….(1)

La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas capaces de absorber

energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentración aumenta.

Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la solución
en pequeñas secciones, en cada una de ellas se absorberá una pequeña cantidad de radiación P, que
es proporcional a N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentración y si la
longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuación
general:

-log P/ P0= abc …………………. (2)

donde:


c es la concentración

b es la longitud de la celda o paso óptico

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a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad o coeficiente de extinción

La absortividad o coeficiente de extinción mide qué tanto una sustancia absorbe la radiación a una
longitud de onda determinada. Es una característica propia de cada especie química y depende de su
estructura. El valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud de onda.

A la relación -log P/ P0 se le denomina absorbancia de la solución (A) y es específica para una longitud
de onda dada (𝜆). Por tanto, la ecuación final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera:

A𝛌=a𝛌bc……………………………(3)

Es importante mencionar que se le coloca el superíndice 𝜆 a la absorbancia A y a la constante de

proporcionalidad a porque dependen de la longitud de onda (ec. 3). Si la concentración se expresa en
molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o
coeficiente de extinción (𝛆). Convencionalmente, el paso de la luz en las celdas de laboratorio es de 1
-1 -1
cm, por lo que las unidades de 𝛆 son cm mol L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por
definición es un índice.

Podemos construir una gráfica para observar cómo varía la absorbancia de una especie en solución a
una longitud de onda dada en función de su concentración. A esta gráfica se le llama curva de
calibración o curva estándar o curva patrón y para construirla se mide la absorbancia de varias
soluciones de concentración conocida, llamadas disoluciones estándar. Es una línea recta y de acuerdo
con la ecuación 3 la pendiente es 𝛆b.

Concentración

Fig. 1. Curva Estándar

Conociendo 𝛆 y la longitud del paso de la luz b, la concentración de la sustancia en cualquier otra

muestra puede ser determinada usando la Ley de Lambert-Beer. La cuantificación de la especie debe
realizarse a la longitud de máxima absorción.

La ley de Lambert-Beer para cuantificar compuestos se utiliza de manera rutinaria en el laboratorio de

bioquímica. Una de sus aplicaciones principales es para determinar la concentración de proteínas en
una solución.

Métodos para la cuantificación de proteínas.

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Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica
cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la
actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para
otros muchos propósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en:
a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados
químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

2 OBJETIVOS
Realizar la una curva patrón de albúmina mediante el método de Biuret..

3 FUNDAMENTO
Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su identificación,
destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los
aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los
aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente
alcalino, se une con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya
intensidad de color depende de la concentración de proteínas.

4 PROCEDIMIENTO
A EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIOS MATERIAL DE APOYO
Material común de laboratorio.
REACTIVOS:

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado

analítico, cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada.

− Reactivo de Biuret (Fórmula de Rosenthal y Cundiff)

− Agua destilada.

MATERIALES:

− Tubos de ensaye de 13X100.

− Pipeta automática de 10-100 μL.
− Pipeta automática de 100-1000 μL.
− Puntas amarillas para pipeta automática.
− Puntas azules para pipeta automática.
− Celdas para espectrofotómetro.

MATERIAL BIOLÓGICO:

− Solución de albúmina al 22%

APARATOS E INSTRUMENTOS

Los aparatos que a continuación se indican deben estar

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calibrados y ser ajustados antes de su operación:

− Espectrofotómetro.

B DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE ALBÚMINA.

1. Preparación de la solución estándar.

a. A partir de una solución de albúmina al 22% preparar 10 mL de una solución de
concentración final 10 mg/mL

PROCEDIMIENTO.

Preparación del reactivo de trabajo.

2. El reactivo de Biuret viene listo para su uso.

Determinación de absorbancias para albúmina.

3. Rotular 7 tubos de ensaye y pipetear en cada uno de ellos el volumen de muestras que se
indica.

Número de tubo 1 2 3 4 5 6 7
Volumen en µL de
solución estándar de 0 25 50 125 250 375 500
albúmina 10.0 mg/dL
Volumen en µL de agua
500 475 450 375 250 125 0
destilada

4. Enseguida, adicionar a todos los tubos 2 mL de reactivo de Biuret, mezclar e incubar 15 min a
temperatura ambiente.

5. Leer la absorbancia (A) a 540 nm contra el blanco de reactivo. El color es estable durante una
hora. Anotar las lecturas.

6. Graficar los resultados en una hoja de papel milimétrico.

C EXPRESIÓN DE RESULTADOS E INFORME DE LA PRUEBA.

INFORME DE LA PRUEBA

1. Elaborar una tabla con los datos obtenidos por su equipo

2. Elaborar la curva de calibración realizando la regresión lineal de los datos.

5 INTERPRETACIÓN Y CONCLUSIONES
Se elaboraran de acuerdo a los resultados obtenidos y la importancia diagnóstica de la prueba.
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6 ANEXOS
CUESTIONARIO.
1. Define con tus propias palabras que es una curva patrón.
2. Explica por qué en el método de BiureT la absorbancia de una proteína se lee a una longitud de
onda de 540 nm.
3. Define exactitud y precisión.

7 REFERENCIAS
1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). “Principles of Biochemistry”, Worth Publishers, 2o edición.
2. D. Voet, JG Voet, CW Pratt. “Fundamentos de Bioquímica”. Editorial Médica Panamericana. 2a Ed.
Bioquímica, Madrid, 2007.

8 MECANISMO DE EVALUACIÓN
Puntualidad y asistencia 40%
Bitácora 20%
Reporte 20%
Conocimientos previos 20%

9 MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

1. Se deberá utilizar antifaz de seguridad, guantes, cubrebocas y gorro.
2. Se deberá tener el cuidado respectivo al manejo de material a altas temperaturas.
3. Al pesar o medir reactivos evite tirarlo o derramarlos en el sitio donde se encuentre, en caso de
hacerlo limpiar perfectamente el lugar.
4. Al medir las muestras biológicas evite tirarlas o derramarlas y sigue los procedimientos
generales de manipulación para evitar cualquier riesgo biológico.
5. Cubrir las medidas de seguridad básicas para el laboratorio.

En caso de accidente (por pequeño que este sea) debe comunicarse de inmediato al maestro
responsable del laboratorio.

10 DISPOSICIÓN DE DESECHOS QUÍMICOS, FÍSICOS Y BIOLÓGICOS.

1. Los recipientes que tengan residuos de naturaleza lipídica, se limpiarán con papel absorbente
antes de lavarlos en la tarja y estos papeles se tirarán en el bote de basura del laboratorio.
2. Los RPBI se desecharán en los contenedores destinados para ello.

Elaboró: M.C. Juan Antonio Ambrosio Girón.