UNIVERSIDAD DEL MAGDALENA

FACULTAD DE INGENIERÍA
PROGRAMA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
CURSO: Bioquímica General
DOCENTE: Juan Diego Rios-Díez

Laboratorio 2 Espectrofotometría, Concentración de Aminoácidos y Proteínas

1) OBJETIVO:
- Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro.
- Determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia de una proteína por espectrofotometría

2) CONCEPTUALIZACIÓN:

La espectrofotometría es un método de análisis que hace uso entre la materia y la energía radiante la cual se
refiere a como las ondas electromagnéticas se propagan y transportan sin interferencia de materia. La
absorbancia es una medida cuantitativa útil y está relacionada con la concentración a través de la ley de Beer-
Lambert, la cual establece lo siguiente:
A = εCl

Donde A es la absorbancia de la muestra a una longitud de onda dada, ε es el coeficiente de extinción del
compuesto a esa longitud de onda y sus unidades son (M∙cm)-1, c es la concentración molar de la especie que
absorbe, y l es la longitud de paso de la celda que contiene la solución donde se realiza la medición y está dada
en cm. Así, si el coeficiente de extinción es conocido, la absorbancia de la solución puede ser usada para calcular
la concentración de la especie en solución (asumiendo que la única especie que absorbe es el compuesto de
interés).
La explicación anterior de por qué medimos la absorbancia no explica lo que significa la absorbancia en sí.

Los espectrofotómetros tienen entonces la habilidad de medir absorbancia a valores específicos de longitud de
onda. El método usado más comúnmente involucra un monocromador que permite descomponer la luz incidente
en sus componentes con diferentes longitudes de onda y de esta forma escoger una longitud de onda a la cual
una muestra dada absorbe con mayor intensidad. La habilidad para medir la absorbancia a diferentes longitudes
de onda es muy útil porque el coeficiente de extinción varía al variar la longitud de onda. Además, el espectro
de absorbancia puede variar dependiendo de la composición química del compuesto y el ambiente (solvente)
alrededor de este.
Bourguer, Lambert y Beer, a través de sus observaciones establecieron relaciones de la variación de la
intensidad de luz transmitida por una muestra con el espesor de ella o con la concentración de la sustancia, para
materiales translúcidos. Estas relaciones se conocen como la ley de Bourguer-Lambert-Beer o ley general de la
espectrofotometría que permite hallar la concentración de una especie química a partir de la medida de la
intensidad de luz absorbida por la muestra. La ley de Bourguer-Lambert-Beer se puede entonces escribir de las
siguientes formas.
Siendo C la concentración del soluto molar (M = moles / Litro),  una constante denominada coeficiente de
absortividad molar ( = hc/) cuyas unidades son: cm-1 litro / mol y “l” distancia recorrida por la onda en cm,
se llega, entonces, a que la absorbancia es adimensional.
Una de las múltiples aplicaciones que tiene esta herramienta, es medir la concentración de una molécula en una
solución, por ejemplo, la concentración de un aminoácido o una proteína en una muestra de tejido vivo.

Los Aminoácidos.
Un aminoácido es una molécula orgánica que en su estructura contiene un grupo amino (NH2) y un grupo
carboxilo (COOH). Los aminoácidos son los monómeros a partir de los cuales se forman las proteínas, en cuyo
caso pasan a denominarse residuos de aminoácidos debido a la perdida de los elementos del agua al unirse dos
aminoácidos.
•En la mayoría de los seres vivos solamente 20 aminoácidos son codificados por el DNA para formar las
proteínas (proteinogénicos). Además, existen selenocisteína y pirrolisina (arqueobacterias).
• Muchas proteínas contienen aminoácidos modificados y partes no proteicas (grupos prostéticos).

Clasificación.
Existen diversas formas de clasificar los aminoácidos: biológicamente (esenciales y no esenciales),
químicamente (ácidos, básicos y neutros), bioquímica (glucogénicos, cetogénicos, cataboligénicos,
hematógenos y anabolígenos) y por la naturaleza de sus grupos R (Apolares o alifáticos, aromáticos y polares
con carga positiva o negativa).

Métodos de detección:
Existen deferentes métodos espectrofotómetricos, analíticos y bioquímicos, este último conocido como pruebas,
por ejemplo: prueba de de Folin, Prueba de Sullivan, Prueba del azufre, etc. A continuación de explica en qué
consiste algunas de ellas.

Prueba con acetato de plomo: En un tubo de ensayo se coloca 2 ml de una solución de proteína. Se añada 2 ml
de solución de acetato de plomo y 1 ml de solución de hidróxido de sodio al 5%. Se calienta el tubo hasta
ebullición formándose un precipitado.

Prueba xantoproteica: La reacción es positiva para muestras que contienen aminoácidos con anillos aromáticos
al adicionárseles con mucho cuidado gotas de ácido nítrico concentrado en caliente (HNO3). En la reacción
estos anillos se nitran, por lo que aparece el color amarillo intenso de sus derivados nitrados.

Reaccion de Sakaguchi: Se realiza vertiendo 0.5 mL de una solución de arginina en un tubo de ensayo como
control positivo. Agregar 5 gotas de la solución de hidroxido de sodio 2N, 5 gotas de la solución de alfa naftol
y 3 gotas de hipoclorito de sodio al 1% en agua destilada. Debe hacerse una buena mezcla para observar el
cambio de color.

Método de Bradford: Es una técnica de laboratorio ampliamente utilizada para determinar la concentración de
proteínas en una muestra. Se basa en la interacción entre una tinta de colorante (Coomassie Brilliant Blue G-
250) y las proteínas presentes en la muestra. La cantidad de proteínas presentes se determina midiendo la
absorbancia del complejo tinta-proteína a una longitud de onda específica (generalmente alrededor de 595nm).

3) MATERIALES:

ESTUDIANTE: UNIMAG:
Mapa mental o diagrama de flujo Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Soluciones de aminoácidos
de la práctica. 0.5 M
Libreta de laboratorio Tubos de ensayos Reactivo de Nihidrina*
Cinta o marcador Gradillas Reactivo de millón**
 Guantes de látex Beacker de 100ml Solución de hidróxido de
sodio 2N
Aprox. 100 mg de la fruta elegida Espectrofotómetro Rojo de fenol
Clara de huevo Cámara de extracción de gases Solución de acetato de plomo
(10%)
Papel absorbente Micropipetas de 20 y 200 µL Ácido nítrico concentrado
Etanol al 70% Solución de hipoclorito de Solución de alfa naftol al 1%
sodio al 1% en agua destilada en alcohol del 95%
Solución de CuSO4 NaOH 5 y 40%
1,2-naftoquinon-4-sulfonato Ácido sulfanilico 0.5% en
sódico al 0,2% ácido clorhidrico 2%
Albúmina de Suero Bovino Carbonato de sodio al 10%
(BSA)
Nitrito de sodio al 0.5% Ácido pícrico
Azul de Coomassie G-250
*El reactivo se prepara disolviendo 100 mg en 10 ml de etanol al 95%, y completando con 100ml de agua.
** debe prepararse 24 horas antes de usarse.

4) PROCEDIMIENTO

1° Parte. Determinación del espectro de absorción para un colorante

Marque cuatro tubos de ensayos (A, B, A-control y B-control) a los dos primeros adicione 3 ml de una solución
de colorante (rojo de fenol) ya preparada, más 3mL de agua destilada, además en el tubo A adicione 0,1ml
NaOH y en el tubo B adicione 0,1ml HCL.
En los tubos A-control y B-control agregue 6mL de agua destilada más 0,1mL de NaOH para el primero y
0,1mL de HCL para el segundo respectivamente.

Luego transfiera una porción de cada solución obtenida a la cubeta del espectrofotómetro. Calibre el
espectrofotómetro en una absorbancia igual a cero (100% de tramitancia) con tubo blanco de cada muestra. A
continuación, mida la absorbancia desde los intervalos de 380 hasta 680 nanómetros y registre en la siguiente
tabla los valores obtenidos:
Longitud de onda Absorbancia
Longitud de onda AbsorbanciaAbsorbancia Absorbancia
380 540

400 560

420 580

440 600

460 620

480 640

500 680

520

Grafique la longitud de onda vs Absorbancia, determine el pico de mayor absorbancia y calcule el coeficiente
de absortividad molar () tomando en cuenta que el peso molecular del rojo de fenol es 354,38 g/mol.
Nota: use la relación V1C1 = V2C2 para calcular la concentración del cromóforo (rojo de fenol) en la
cubeta del espectrofotómetro.

2° Parte. Determinación de la concentración de aminoácidos con una prueba espectrofotomética.

Aplicando lo visto en el ensayo anterior, siga los siguientes pasos. Lo primero es preparar una dilución de clara
de huevo 1:1000. Aparte haga un extracto de la fruta que llevó, para ello tome 10mg de la fruta, macérelo y
diluya en 100mL de agua que contenga 0.02% SDS o 0.2% de Tryton X-100, centrifugue 80g o deje reposar y
tome 10mL del sobrenadante y lleve a un tubo de ensayo nuevo.

En seis tubos de ensayo añadir 2ml de las siguientes soluciones: Tubo 1 agua; tubo 2 Lisina 0,5%; tubo 3 Prolina
0,5%; tubo 4 Tirosina 0,5% o Glutámico 0,5%; tubo 5 clara de huevo 0,1% (1:1000) y tubo 6 extracto de fruta.
Incorporar en todos los tubos 2 ml de ninhidrina 0,2% calentar al baño maría, una vez frío llevar al
espectrofotómetro una muestra de todos los tubos, calibrar el equipo a 570nm, si el coeficiente de extinción
molar para la púrpura de Ruhemann es 22000 L.mol-1.cm-1 determine la concentración de aminoácidos en
todos los tubos.

3° Parte. Determinación cualitativa y cuantitativa de la presencia de proteínas

A continuación, por medio de dos de las siguientes pruebas (prepárese para realizar cualquiera de ellas el día
de la práctica), determine cualitativa y cuantitativamente la presencia de proteínas en los seis tubos que trabajó
previamente. Recuerde son 2ml de: agua en el tubo 1; Lisina 0,5% en el tubo 2; Prolina 0,5% tubo 3; Tirosina
0,5% o Glutámico 0,5% tubo 4; clara de huevo 0,1% (1:1000) tubo 5 y extracto de fruta tubo 6.

1. Prueba de Biuret: Agregue a cada tubo 1 ml de solución de Biuret (1ml de solución de NaOH 20%
con 3 - 5 gotas de CuSO4). En cada tubo debe agitarse vigorosamente el contenido y observar la coloración
presentada. El color violeta o rojo-morado indica la reacción positiva. El color desarrollado se debe a la
formación de un complejo de coordinación con el Cu++.
2. Prueba de Millón: Agregue 0.5 ml de reactivo de millón a cada tubo, observe y compare la coloración
en cada tubo. La coloración roja indica la presencia de tirosina, si es incolora hay fenilalanina.
3. Prueba del azufre: Tomar 3 mL de la sustancia a evaluar, incorporar 1 mL de NaOH al 40%, agregar
2 ó 3 gotas de una solución de acetato de plomo, calentar al baño maría durante 3 minutos a 90°C. Si aparece
una coloración negra en el precipitado, la reacción será positiva, indicando la presencia de azufre, en tal caso el
azufre proviene de la cisteína.
4. Prueba de Folin: Adicione a los tubos de ensayo 0,5 mL de 1,2-naftoquinon-4-sulfonato sódico al
0,2% junto con 1 mL de hidróxido sódico al 10%. Calentar al baño maría a 70-80º C durante 5 minutos y si
aparece un color anaranjado o rojo es indicativo de la presencia de aminoácidos.
5. Prueba del ácido nitroso: A los tubos de ensayo, adicione 0,5 ml de ácido clorhídrico concentrado.
Añadir 1 ml de nitrito sódico al 5% y si se desprenden burbujas indica presencia de grupos amino libres y por
lo tanto, la reacción es positiva.
6. Prueba de Sakaguchi: Esta prueba es positiva para compuestos que contengan el grupo guanidinio
como la arginina. El reactivo que se utiliza contiene α-naftol e hipoclorito sódico, en medio alcalino. La
aparición de una coloración roja es indicativa de una reacción positiva. Tomar 5mL de las muestras problemas
y añadir 1 mL de NaOH 2M más 1 mL de α-naftol al 0,02% en etanol. Enfriar en hielo para luego añadir 1mL
de disolución alcalina de hipoclorito sódico, esperar 30 segundos y añadir 1mL de disolución de urea.
7. Prueba de Jaffé: Poner en los tubos a evaluar 1 ml de ácido pícrico (preparado inmediatamente antes
de ser utilizado mezclando 5:1 de solución acuosa saturada de ácido pícrico e hidróxido sódico al 10%). Si
acontece la aparición de una coloración roja, se tratará de una prueba positiva para la creatinina.
8. Método de Bradford: Lo primero que debe hacer es preparar el estándar que puede ser BSA 0,2 mg/ml
(pesar 10 mg de BSA y disolverlo en 50 ml de H2O destilada).
Una vez que tenga el estándar y la solución de Bradford (se prepara a partir del colorante Azul de coomasie
G250), proceda a realizar la curva de calibración de acuerdo con la siguiente tabla.
Amostra BSA (µL) µg BSA aprox H2O (µL) Bradford (µL)
Branco ---------- 0 2400 600
Curva-1 60 12 ug 2340 600
Curva-2 120 24 2280 600
Curva-3 240 48 2160 600
Curva-4 360 72 2040 600
Curva-5 480 96 1920 600
Curva-6 600 120 1800 600
Problema X -------- 2400-X 600

Antes de hacer las lecturas en el espectrofotómetro mezcle por inversión todos los tubos y deje reposar entre 10
y 15 minutos. Luego mida la absorbancia a 595 nm, guarde los datos para graficar la curva, obtenga la ecuación
de la recta (recuerde considerar el valor R) y tome el dato de la absorbancia de su muestra.
Nota: Recuerde que la prueba debe permanecer lineal y seguir la ley de Lambert Beer Si la absorbancia es
mayor que 1.3 unidades PARA, ¡diluya más la muestra(s) tomando nota de la dilución para volver al contenido
de proteína inicial y repita la medida!

Análisis
Una vez ya tenga la ecuación de la recta (Y = m*X + b) y los datos de su muestra problema, use la curva
estándar de absorbancia (eje “Y”) frente a microgramos de proteína (eje “X”) y determine la cantidad de
proteína(s) en su muestra problema con la curva. Determine las concentraciones de las muestras originales a
partir de la cantidad de proteína, volumen / muestra, y factor de dilución, recuerda multiplicar el contenido de
proteína obtenido por el factor de dilución. (es decir. 1, 10, 100, 1000) al final del análisis para determinar el
contenido real de proteína.

5) Preguntas orientadoras:

1° ¿Cuál es el principio bioquímico de los dos métodos que usó en esta práctica para determinar la presencia de
aminoácidos y/o proteínas?
2° Según la tercera parte de esta práctica ¿Cuáles aminoácidos abundan en su muestra problema? explique
3° ¿Cuál es el porcentaje de proteína por gramo que contiene su muestra problema?

6) REFERENCIA:

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2022). Princípios de bioquímica de Lehninger. Artmed Editora.