Guia Lab 6 Extracción y Cuantificación de Proteínas

HOMOGENIZACIÓN Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS.
Los tejidos son ricos en proteínas que cumplen diferentes funciones y por lo tanto con diferentes
características , y según estas es posible solubilizarlas, separarlas y purificarlas mediante diversos métodos.
El primer paso en la extracción de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de

los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la
estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando
procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la
rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular, dentro de los que se
encuentran: shock osmótico, mortero (fricción) y sonicación.
Las proteínas obtenidas deben ser solubilizadas en buffer para ayudar a extraerlas de las células y además
mantenerlas para su posterior utilización.
El objetivo de este práctico es realizar un protocolo para la homogenización de tejido y obtención

de proteínas totales, para su posterior cuantificación y caracterización
Objetivos
 Establecer criterios para la elaboración de un protocolo

 Conocer la función de los componentes de los buffer
 Aplicar los conocimientos de los componentes para la elaboración de los buffer
Actividades
 Realización de un protocolo para la homogenización de tejido y solubilización de proteínas

 Preparación de buffer a utilizar y determinar la función de sus componentes
 Homogenización de tejido
Materiales:
 Mortero de porcelana
 Tubos Falcon 15 y 50 ml.
 Tubos eppendorff.
 Espátula.
 Inhibidor de proteasas (PMSF)
 Tris
 Triton.
 Vortex
 Centrifuga
Buffer Lisis (para 20 ml)
 18 ml. de Tris HCl (20 mM)

 2 ml. de NaCl(1 M)
 10 μl Tritón x-100
Cada un ml. de la preparación anterior:
 10 μl de EDTA (0,5M).
 50 μl de PMSF (100 mM)
Procedimiento:
1) Poner su muestra en un mortero y homogenizar

2) Mezclar con el buffer en un tubo falcón en una relación 1:5
3) Homogenizar con vortex de forma horizontal
4) Centrifugar a 12000 rpm por 15 minutos
5) Rescatar sobrenadante.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
MÉTODO DE BRADFORD
Se han descrito muchos métodos diferentes para la determinación cuantitativa de proteínas. Estos
métodos difieren entre si en cuanto a su sensibilidad, exactitud, precisión, interferentes, estabilidad y sencillez.
La selección del método a utilizar se realiza considerando las características de las muestras que se desean
analizar, las cuales pueden ser desde extractos crudos de tejidos animales o vegetales, fluidos biológicos de
interés en bioquímica clínica (suero, plasma u orina), muestras obtenidas desde la purificación de proteínas,
fracciones cromatograficas hasta muestras de una proteína pura. En general los métodos utilizados para la
determinación cuantitativa de proteínas consisten en la determinación absorciométrica directa o ensayos de
tipo colorimétrico, turbidimétrico o fluorométrico.
La mayoría de la proteínas presentan un máximo de absorbancia a 280 nm aproximadamente,
debido principalmente a la presencia de residuos de triptófano y tirosina, y en mucha menor proporción
fenilalanina. Los residuos de histidina, cisteína y cistina también presentan bandas de absorbancia en el
ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores longitudes de onda y son de menor intensidad.
Método de Bradford
Este método utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G-250 de unirse a las proteínas. El
colorante libre presenta un máximo de absorción a 465 nm mientras que cuando está unido a proteínas éste se
encuentra a 595 nm. El ensayo estándar posee una sensibilidad desde 0,1 aq 1,4 mg/mL. Esta unión se debe a
la estabilización de la forma aniónica del colorante mediante interacciones hidrofóbicas y iónicas, causando un
cambio visible de color.
Interferencias: Detergentes y álcalis reducen el color. Se recomienda medir en el tiempo asignado,

debido a que el color no es estable en el tiempo, ya que la proteína y el complejo colorante-proteína comienza
a precipitar debido al medio ácido. Este efecto es especialmente significativo a las concentraciones de
proteínas mayores. Por otra parte, el complejo proteína colorante tiende a unirse a las cubetas teniéndolas,
por lo cual se recomienda un lavado final con etanol.
Este ensayo requiere además la realización de una curva de calibración para la determinación de la
concentración de proteínas de una muestra, utilizándose comúnmente BSA como proteína patrón.
OBJETIVOS
 Realizar una curva de calibrado utilizando BSA como proteína patrón.

 Calcular la concentración de proteínas de una muestra problema mediante el método de Bradford.
 Determinar la concentración de proteína total en una muestra considerando los factores de dilución.
ACTIVIDAD PRÁCTICA
Determinación de proteínas de la extracción anterior.
REFERENCIAS
 H. Lodish, A. Berk, L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore , J. Darnerll, 2002. “Biología Celular y
Molecular”. Editorial Médica Panamericana. Madrid-España.
 B. Albert, D. Bray, J. Lewis, 2000. “Biología Molecular de la Célula. Ediciones Omega S.A., Barcelona.
 Farmacología Molecular: Receptores, transducción de señales y activación de genes, 2000. Marcelo
Kazanietz. Ed. Universidad Nacional de Quilmes – Argentina.
 J. Kurjan y B. Taylor, 1993. “Signal Transduction”. Academic Press Inc. N.Y.
 Abbas Abul K., A. H. Lichtman & Pober J. Inmunología Celular y Molecular. 4º Edición, 2002. Ed.
McGraw-Hill-Interamericana, Madrid, España

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HOMOGENIZACIÓN Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS.

El primer paso en la extracción de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de

El objetivo de este práctico es realizar un protocolo para la homogenización de tejido y obtención

 Establecer criterios para la elaboración de un protocolo

 Realización de un protocolo para la homogenización de tejido y solubilización de proteínas

 18 ml. de Tris HCl (20 mM)

Cada un ml. de la preparación anterior:

1) Poner su muestra en un mortero y homogenizar

Interferencias: Detergentes y álcalis reducen el color. Se recomienda medir en el tiempo asignado,

 Realizar una curva de calibrado utilizando BSA como proteína patrón.

Determinación de proteínas de la extracción anterior.

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