UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

EVALUACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO COMO BIOMARCADOR

TEMPRANO DE TOXICIDAD EN PLASMA DE ENFERMERAS
OCUPACIONALMENTE EXPUESTAS Y NO EXPUESTAS A
MEDICAMENTOS ANTINEOPLÁSICOS: ESTUDIO DE CASOS Y
CONTROLES.

TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS QUÍMICAS
P R E S E N T A:
Q. F. B. GERARDO DANIEL MIRANDA MENDOZA

DIRIGIDO POR:

DR. LEOBARDO MANUEL GÓMEZ OLIVÁN

DRA. MARCELA GALAR MARTÍNEZ

DR. JORGE JAVIER RAMÍREZ GARCÍA

TOLUCA, ESTADO DE MÉXICO. SEPTIEMBRE 2014.

1
2
 DEDICATORIAS Y AGRADECIMIENTOS

A DIOS
Por siempre estar conmigo, por su infinita bondad y amor.

A MI HIJA, MIA YISZEL

Por tu presencia en mi mente y en mi vida, por ser mi infinita motivación y mi alegría.

A MIS PADRES, ESTHER Y JOSE LUIS

Por ser mis guías, por sus bendiciones infinitas y por su valiosa compañía.
Un peldaño más hacia nuestro el éxito.

A MI HERMANA, JANET
Por ser mí apoyo y por todos tus excelentes deseos.
¡Venga….vamos por más!

A MI ABUELITA, MAMÁ ONE

Por su ejemplo de constancia y fortaleza para lograr mi superación y mis éxitos, en especial
por mantenerme presente en todas sus oraciones.

A MIS DIRECTORES DE TESIS,

DR LEOBARDO MANUEL GÓMEZ OLIVÁN
DRA. PAULA ANEL CABRERA GALEANA
Por su apoyo, ejemplo y constante motivación.
Siempre van a ser mi modelo a seguir.

A MI HERMANO MAYOR,
DR. RICARDO DAVID GALICIA SAMANO
Por su apoyo y filosofía, por su manera de ver y vivir la vida.
Por ser para mí, un ejemplo y un guía.

3
 A MIS AMIGOS
ANGEL, HECTOR, ISRAEL, JOSE, JUAN CARLOS, LUIS Y OCTAVIO
Porque sin compartir la sangre, cada día se fortalece nuestra hermandad.
Por lo que ha sido y por lo que será.

A TODOS Y CADA UNA DE LAS PERSONAS QUE HAN COMPARTIDO

CONMIGO SU AMOR, CARIÑO, AMISTAD, BENDICIONES E INCONDICIONAL
APOYO, A QUIENES SE HAN IDO Y A QUIENES ESTÁN.

AL CONACyT Y COMECyT
Por el apoyo otorgado a través de los programas de becas de los que fui beneficiado.

4
 INDICE
Contenido Pagina
Índice de figuras…………………………………………………………………. 7

CAPITULO 1.”Antecedentes”
1.1 Resumen……………………………………………….………………………… 10
1.2 Abstract…………………………………………………………….……………. 11
1.3 Introducción………………………………………………………..………….. 14
1.4 Marco conceptual.……………………………………………………………. 15
1.4.1 Cáncer……………………………………………………………………………………………… 15
1.4.2 Medicamentos antineoplásicos………………………………………………………. 15
1.4.2.1 Clasificación de los medicamentos antineoplásicos……………………… 16
1.4.2.1.1 Alquilantes polifuncionales………………………………………………………… 16
1.4.2.1.2 Antimetabolitos………………………………………………………………………….. 16
1.4.2.1.3 Alcoloides vegetales…………………………………………………………………… 17
1.4.2.1.4 Antibióticos………………………………………………………………………………… 17
1.4.2.1.5 Antraciclinas……………………………………………………………………………….. 17
1.4.2.1.6 Agentes hormonales…………………………………………………………………... 19
1.4.3 Biomarcadores…………………………………………………………………………………. 19
1.4.3.1 Clasificación de biomarcadores………………………………………………….… 19
1.4.3.1.1 Biomarcadores de exposición o de dosis interna…………………….... 19
1.4.3.1.2 Biomarcadores de susceptibilidad………………..…………………………… 21
1.4.3.1.3 Biomarcadores de efecto (o respuesta)……………………………………… 21
1.4.3.2 Estrés oxidativo…………………..………………………………………………………… 22
1.4.3.2.1 Radicales libres………………………………………………………….……………….. 22
1.4.3.2.2 Especies reactivas de oxígeno……………………………………………………. 23
1.4.3.2.3 Efectos del estrés oxidativo sobre biomoléculas…...……………….... 24
1.4.3.2.3.1 Lipoperoxidación…………………………………………..................................... 24
1.4.3.2.3.2.1 Etapas de la lipoperoxidación……………………………………………….. 24
1.4.3.2.3.2.2 Efectos de la lipoperoxidación………………………………………………. 26
1.4.3.2.3.2 Daño a proteínas………………………………………………………..……………. 26

5
1.4.3.2.3.3 Defensa antioxidante…..………………..…………………………………………. 26
1.4.3.2.3.3.1 Enzimas antioxidantes…………………………………………………………… 27
1.4.3.2.3.3.1.1 Superóxido dismutasa………………………………………………………… 27
1.4.3.2.3.3.1.2 Catalasa………………………………………………………………………………. 28
1.4.3.2.3.3.1.3 Glutatión peroxidasa…………………………………………………….…….. 28
1.4.3.3 Estrés oxidativo en enfermeras ocupacionalmente expuestas…….... 30
1.4.4 Los medicamentos citostáticos y estrés oxidativo………………….… 31

1.5 Justificación…………………………………………………………………….. 33
1.6 Hipótesis…………………………………………………………………………. 34
1.7 Objetivos………………………………………………………………………… 35
1.7.1 Objetivo general……………………………………………………………………………. 35
1.7.2 Objetivos específicos……………………………………………………………………….. 35
1.8 Metodología……………..………..…………………………………………… 36
1.8.1 Universo de estudio……..………………………………………………… 36
1.8.2 Procedimiento…...………………………………………………………… 36
1.8.3 Criterios de inclusión…….………………………………….…………….. 36
1.8.4 Criterios de exclusión……..………………………………………………. 36
1.8.5 Evaluación del estrés oxidativo………………………..………………….. 37
1.8.5.1 Determinación del grado de lipoperoxidación………………………….. 37
1.8.5.2 Determinación de los niveles de oxidación de proteínas……………….. 37
1.8.5.3 Determinación de la actividad de la súper oxido dismutasa……………. 38
1.8.5.4 Determinación de la actividad de la catalasa…………………………… 38
1.8.5.5 Determinación de la glutatión peroxidasa……………………………… 39
1.9 Análisis estadístico……………………….……………..………..………… 39
CAPITULO 2. “DISCUCIÓN DE RESULTADOS”
2.1 Resultados……………………………………………………………………….. 41
2.1.1 Carta de recepción del artículo………………………………………………………… 41
2.1.2 Artículo…………………………………………………………………………………………….. 42
3. Conclusiones……………………………………………………………………… 68
4. Referentes bibliográficos…………………………………………………….. 68

6
Índice de figuras

Contenido Pagina

Figura 1.1 Doxorrubicina………………………………………………………… 18

Figura 1.2 Progresión de la acción de los biomarcadores de dosis interna al nivel
molecular de dosis efectiva………………………………………………………. 20
Figura 1.3 Estrés oxidativo………………………………………………………. 22
Figura 1.4 Iniciación de la lipoperoxidación…………………………………….. 25
Figura 1.5 Propagación de la lipoperoxidación………………………………….. 25
Figura 1.6 Tipos de antioxidantes……………………………………………….. 27
Figura 1.7 Reacción de Superóxido Dismutasa…………………………………. 27
Figura 1.8 Reacción de la Catalasa……………………………………………… 28
Figura 1.9 Reacción de Glutatión Peroxidasa…………………………………… 29
Figura 1.10 Reacciones de las enzimas antioxidantes…………………………... 30
Figura 1.11 Preparación de medicamentos antineoplásicos…………………….. 31
Figura 1.12 Ciclo celular y cáncer………………………………………………. 32
Figure 1 LPX in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug
preparation………………………………………………………………………. 59
Figure 2 PCC in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug
preparation………………………………………………………………………. 60
Figure 3 SOD activity in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug
preparation………………………………………………………………………. 61
Figure 4 CAT activity in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug
preparation………………………………………………………………………. 62
Figure 5 GPx activity in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug
preparation……………………………………………………………………….. 63

7
8
CAPITULO 1.”Antecedentes”

9
 1.1 Resumen

Los medicamentos antineoplásicos empleados en el tratamiento de pacientes con cáncer;

debido a sus mecanismos farmacodinámicos y a los procesos farmacocinéticos que
experimentan, pueden generar radicales libres que provocan estrés oxidativo, tanto en los
pacientes que son tratados con estos fármacos como en las personas que los manipulan
(preparación y administración).
El personal de enfermería que se encarga de la preparación y la administración de los
fármacos citotóxicos se encuentra expuesto a ellos y a los efectos que pueden causar en el
organismo. La formación de radicales libres (especies reactivas de oxígeno, nitrógeno y
especies no radicalarias) que pueden unirse a las principales biomoléculas del organismo como
los lípidos, proteínas y ADN, alterando la homeostasis del organismo, la cual ha sido
relacionada con diversas manifestaciones patológicas, entre las que se puede mencionar:
enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer y Parkinson, padecimientos crónicos,
inflamatorios, del tracto gastrointestinal, diabetes, envejecimiento de la piel, asma, necrosis
tubular aguda, anemia hemolítica, isquemia, cataratas, ateroesclerosis y enfermedades
neoplásicas.
El presente trabajo evaluó el grado de estrés oxidativo en células sanguíneas de enfermeras
ocupacionalmente expuestas y no expuestas a medicamentos antineoplásicos mediante los
siguientes biomarcadores de estrés oxidativo: grado de lipoperoxidación (LPX), contenido de
proteínas carboniladas (PCC), y la actividad de las enzimas antioxidantes: superóxido
dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutation peroxidasa (GPx).
Los resultados obtenidos de la población analizada de enfermeras expuestas y no expuestas
a la preparación, manipulación y administración de medicamentos antineoplásicos son: Para el
caso del personal de enfermería expuesto (n=15), 100 % fueron mujeres, con un promedio de
edad de 32 años (rango de 25 a 35 años). Para el grupo control (n=15), 100% fueron mujeres,
con un promedio de edad de 34 años (rango de 25 a 35 años).
Además, se observó qué el grado de lipoperoxidación en enfermeras expuestas muestra un
aumento significativo (p ≤ 0.05) de 237.3% comparado con el grupo control; los niveles de
proteínas carboniladas en enfermeras expuestas es de 173% mayor que en las enfermeras no
expuestas (p ≤ 0.05); La actividad de las enzimas antioxidantes es la siguiente; para SOD en
expuestas de 149.5% comparado con las no expuestas; De CAT, en las enfermeras expuestas
tiene un decremento de 25.5% en comparación con las no expuestas. Finalmente, en el caso

10
de GPx, para las enfermeras expuestas, el valor aumento en un 220.6% en contraste con el caso
de el grupo control.
La información obtenida por el estudio permitió determinar que la valoración del estrés
oxidativo puede considerarse como un biomarcador de toxicidad temprano en enfermeras
ocupacionalmente expuestas a la preparación y administración de medicamentos
antineoplásicos, comparados con enfermeras no ocupacionalmente expuestas. Así mismo, se
realizó una contribución a la vigilancia epidemiológica para minimizar los daños potenciales a
la salud del personal de enfermería en el área de quimioterapia y central de mezclas de los
departamentos oncológicos dentro de cada hospital del estudio.

1.2 Abstract

Antineoplastic drugs are used in the treatment of cancer patients, because of their
mechanisms pharmacodynamic and pharmacokinetic processes that experience can generate
free radicals which cause oxidative stress, in patients treated with these drugs such as people
handling these (preparation and administration).

The nursing staff is responsible for the preparation and administration of cytotoxic drugs,
they are exposed to them and the effects that they can have on the body. The free radicals
formation (both reactive oxygen and nitrogen) can join to the main body biomolecules such as
lipids, proteins and DNA. They also alter the homeostasis of the organism that has been
associated with various pathological conditions the neurodegenerative diseases such as
Alzheimer and Parkinson, chronic diseases, inflammation of gastrointestinal tract, diabetes,
aging skin, asthma, acute tubular necrosis, hemolytic anemia, ischemia, cataracts,
atherosclerosis and neoplastic diseases.
This study aimed the degree of oxidative stress in blood cells from nurses always exposed
and not exposed to antineoplastic drugs, through the following oxidative stress biomarkers:
lipid peroxidation level (Buege and Aust, 1979), protein carbonyl content (Levine et al, 1994
),and the activity of the antioxidant enzymes: superoxide dismutase (Misra and Fridovich,
1972), catalase (Radi et al, 1991) and glutathione peroxidase (Gunzler and Flohe, 1986).

The results of the population study (30 individuals) both exposed and unexposed nurses to

11
the preparation, handling and administration of anticancer drugs are: in the case of nurses
exposed, 100% were women, with an average age of 32 years (range 25-35 years). For the
control group, 100% were women, with an average age of 34 years (range 25-35 years).
Furthermore, it was observed that the degree of lipid peroxidation in exposed nurses shows a
significant increase (p ≤ 0.05) of 237.3% compared with the control group; the levels of protein
carbonyl content in exposed nurses was 173% higher than in unexposed nurses ( p ≤ 0.05). The
activity of antioxidant enzymes was as follows: SOD exposed to 149.5% compared to the
unexposed, CAT in exposed nurses have a decrease of 25.5% compared to the unexposed;
Finally, GPx case for nurses exposed, the value in a 220.6% increase in contrast with the case
of the control group.
Data obtained by the study determined that oxidative stress evaluation can be considered as
a biomarker for early toxicity in nurses occupationally exposed to the preparation and
administration of antineoplastic drugs, compared with nurses not occupationally exposed. In
addition, an epidemiological surveillance was made to minimize potential damage to the health
of nurses in the area of chemotherapy and mixtures central departments within each hospital
oncology study.

12
1.3 Introducción

Las células de mamíferos producen energía a través de la respiración aeróbica mediante

la reducción del oxígeno molecular a agua. Durante este proceso se forman especies reactivas
de oxígeno (ERO): anión superóxido, radicales hidroxilo y peróxido de hidrógeno; siendo este
último no propiamente una ERO, sino una sustancia con alto poder oxidante. En situaciones de
homeostasis estas moléculas intervienen en la regulación de la función celular, siendo la
función antioxidante esencial para mantener el estado de equilibrio. Debido a que las ERO son
biológicamente reactivas, tienen la posibilidad de interactuar con proteínas, lípidos y ácido
desoxirribonucleico. Cuando las ERO se producen en exceso pueden estar involucradas en
diversos estados patológicos como daño por reperfusión, demencia y ateroesclerosis.
El origen principal de las ERO en la vasculatura, esencialmente del superóxido, es el
complejo enzimático de la nicotinamida dinucléotido fosfato -NADH/NADPH- que cataliza la
reducción del oxígeno molecular usando NADPH como dador de electrones con la formación
de superóxido. En neutrófilos activados, la enzima da lugar a la formación de grandes
cantidades de anión superóxido y a otras ERO con fuerte actividad bactericida, tales como el
peróxido de hidrógeno (H2O2). Las oxidasas NADH/NADPH también funcionan en las
membranas del endotelio vascular, de las células de músculo liso y de fibroblastos. La
angiotensina II, trombina, factor de necrosis tumoral alfa y factor de crecimiento derivado de
plaquetas son citoquinas y hormonas que aumentan la actividad de este complejo enzimático
y, por ende, la producción de superóxido. La actividad de la NADH/NADPH oxidasa tiene un
importante papel en la hipertensión inducida por angiotensina II. Aunado a esto, se sabe que
los efectos acumulativos de los radicales libres están implicados en enfermedades
neurodegenerativas como Alzheimer y Parkinson, además de padecimientos crónicos,
inflamatorios, del tracto gastrointestinal, diabetes, envejecimiento dérmico, asma, necrosis
tubular aguda, arterosclerosis, anemia hemolítica, isquemia, cataratas, ateroesclerosis y
enfermedades neoplásicas.
Estudios referentes a enfermedades neoplásicas han reportado que el tratamiento con
quimioterapia aumenta el estrés oxidativo y disminuye los niveles de vitamina C, vitamina E y
glutatión peroxidasa en plasma.
De forma paradójica, el estrés oxidativo interfiere con el crecimiento del tumor ya que
uno de los indicadores de este proceso, el incremento de lipoperóxidos, favorece la
prolongación de un estado quiescente celular (fase G0). El problema es que los agentes

13
quimioterapeúticos o citostáticos actúan cuando las células malignas se están replicando de
forma constante, no cuando se encuentran en un estado quiescente.
También ha sido reportado que las células tumorales poseen una mayor capacidad
antioxidante que las células normales; sin embargo, este efecto es superado por el estrés
oxidativo inducido por medicamentos citostáticos. Las células con un recambio mayor o de
vida corta y que se regeneran constantemente son las más afectadas, empero, existen otros
efectos indeseables relacionados con la generación de radicales libres, tal es el caso del efecto
tóxico al corazón que induce la doxorrubicina (taquicardia, insuficiencia cardiaca), la fibrosis
pulmonar causada por la bleomicina y el efecto ototóxico del cisplatino.
Los agentes antineoplásicos producen estrés oxidativo como un mecanismo de toxicidad.
En este proceso se generan radicales libres que al interaccionar con macromoléculas celulares
afectan las funciones en el organismo. El resultado de esta situación, es la lipoperoxidación,
oxidación de proteínas, la formación de aductos de ADN, mutaciones y alteraciones genéticas.
Los procesos en cuyo daño se implican los radicales libres son muy variados, podemos citar la
desnaturalización de las cadenas de ADN; la liberación de factores quimiotácticos que
provocan la llegada de leucocitos activados, los cuales inducen la formación de radicales libres;
el inicio de la peroxidación lipídica con alteración de la membrana celular que genera
hidroperóxidos, aldehídos y endoperóxidos que dañan a las proteínas y al DNA; y la
desnaturalización de proteínas citosólicas y enzimas de membrana.
En la actualidad, se maneja un número relativamente pequeño de fármacos
antineoplásicos, por lo que se podría suponerse que el riesgo de cometer errores en su uso sería
menor que en otras patologías. Sin embargo, este tipo de terapia entraña una gran complejidad.
La preparación de citostáticos debe realizarse en una cabina de seguridad biológica cuyo diseño
y funcionamiento garantice la protección del producto manipulado así como la del trabajador
y del medio ambiente. En todos los casos debe procederse a capacitar a los trabajadores para
que además de conocer el riesgo, lo minimicen con métodos de trabajo adecuados. La
exposición del profesional a este tipo de fármacos no sólo depende del número de
preparaciones por día que realice, sino también de la técnica personal de trabajo y precauciones
que se tomen durante su manipulación. La inexistencia de una unidad centralizada de
capacitación para la preparación y manejo de citostáticos, supone una menor protección frente
sus efectos potencialmente tóxicos, además de una baja calidad asistencial a los pacientes.
Cabe mencionar que el cáncer ocupa una de las principales causas de morbilidad a nivel
mundial, por tal motivo, gran cantidad de hospitales dan asistencia a pacientes con este

14
padecimiento, a pesar de, no todos ellos cuentan con equipo adecuado y personal capacitado
para la preparación y manipulación de citostáticos.
Diversos síntomas y patologías han sido asociadas al manejo y preparación de citostáticos
como son: leucemias, daño de la actividad reproductiva, abortos espontáneos, genotoxicidad,
citotoxicidad, carcinogenicidad, además de daño del DNA de los linfocitos. Sin embargo, solo
un estudio realizado en Brasil se enfocó a la investigación del estrés oxidativo y reportó que
los niveles de catalasa estaban aumentados en sujetos ocupacionalmente expuestos a
citostáticos y dichos niveles se incrementaban según transcurría su jornada laboral semanal .
Actualmente, no hay más estudios reportados al respecto a pesar de su gran importancia y
trascendencia.

1.4 Marco conceptual

1.4.1 Cáncer
El cáncer es un conjunto de enfermedades de origen multifactorial donde se pierde el equilibrio
entre proliferación y apoptosis, que se caracteriza por la destrucción del órgano que lo origina,
invasión a órganos cercanos y metástasis en puntos distantes del organismo ya que las células
pueden diseminarse en el cuerpo por el sistema linfático y sanguíneo (DeVita VT, 2010).

1.4.2 Medicamentos antineoplásicos

Por tres decenios se ha hecho un gran esfuerzo por desarrollar medicamentos
antineoplásicos a través de pruebas de selección empíricas y síntesis racional de los nuevos
compuestos. Los avances recientes en este campo han incluido la síntesis de péptidos y
proteínas con la tecnología del ADN recombinante y de anticuerpos monoclonales.
Los fármacos anticancerosos idóneos podrían erradicar las células cancerosas sin poner en
riesgo los tejidos normales, desafortunadamente, hoy en día no se dispone de agentes que
reúnan estos criterios y el uso clínico requiere una evaluación de los beneficios frente a su
toxicidad.
Las clases de medicamentos que recientemente se han estudiado incluyen los inductores de
diferenciación, cuya intención es forzar a las células neoplásicas a pasar por una etapa de
maduración para formar células en estado terminal con poco o ningún potencial proliferativo;
antimetastásicos, diseñados para alterar las propiedades de superficie de las células malignas y
modificar así su potencial invasivo y metastásico; agentes antiangiogénicos diseñados para

15
inhibir la formación de la vasculatura tumoral; agentes hipóxicos específicos de células madre,
preparados para explotar la gran capacidad de reacciones reductivas en estas células
terapéuticamente resistentes creadas por la deficiencia de oxígeno de los tumores sólidos;
fármacos radiosensibilizantes tumorales y radioprotectores de tejido normal, dirigidos hacia
una mayor efectividad terapéutica de la radioterapia, y modificadores de la respuesta biológica
que alteran las relaciones metabólicas e inmunológicas tumor-huesped (Chabner BA, 2006;
Hoppe R, 2010).

1.4.2.1. Clasificación de los medicamentos antineoplásicos

Los agentes antineoplásicos se pueden clasificar de la siguiente manera de acuerdo a su
mecanismo de acción:
1.4.2.1.1. Alquilantes polifuncionales: ejercen efectos citotóxicos mediante la
transferencia de grupos alquilo a diversos constituyentes celulares. Las alquilaciones de ADN
dentro del núcleo probablemente representan las principales interacciones que conducen a la
muerte celular. Sin embargo, estos fármacos también reaccionan con los grupos sulfhidrilo,
amino, hidroxilo, carboxilo y fosfato de todos los nucleófilos celulares. El mecanismo general
de acción implica la ciclización intramolecular para formar un ion etilenoimonio que puede
transferir directamente, o mediante la formación de un ion carbonio, un grupo alquilo a un
constituyente celular. Además de la alquilación, un mecanismo secundario que se presenta con
las nitrosoureas implica la carbamoxilación de los residuos de lisina de proteínas a través de la
formación de isocianatos. El principal sitio de alquilación dentro del ADN es la posición N7
de la guanina. Sin embargo, de igual modo son alquiladas otras bases en menor grado,
incluyendo N1 y N3 de la adenina, N3 de la citosina y O6 de la guanina, así como los átomos
de fosfato y proteínas relacionadas con el ADN. Las células son más susceptibles a la
alquilación en las fases G1 tardía y S del ciclo celular y expresan bloqueo en G2. Entre estos
medicamentos encontramos a la ciclofosfamida, mecloretamina, melfalán y clorambucilo. El
cisplatino y carboplatino se cree que actúan de manera similar a los agentes alquilantes,
eliminan a las células en todas las etapas del ciclo celular, inhiben la biosíntesis de ADN por
formación de entrecruzamientos intercadena, su sitio de fijación es el N7 de la guanina
(Katzung B, et al, 2010).

1.4.2.1.2. Antimetabolitos (Análogos estructurales): las vías bioquímicas que han

probado ser explotables con estos medicamentos han sido aquellas relacionadas con la síntesis

16
de nucleótidos y ácidos nucleicos. Algunos casos, cuando se sabe que una enzima tiene un
importante efecto sobre las vías que llevan a la replicación celular, los inhibidores de la
reacción que la catalizan han probado ser medicamentos útiles. El metotrexato es un
antagonista del ácido fólico que se fija al sitio catalítico activo de la dihidrofolato reductasa
(DHFR) interfiriendo con la síntesis de la forma reducida que acepta unidades de un carbono.
La falta de este cofactor interrumpe la síntesis de timidilato, nucleótidos de purina, y los
aminoácidos de serina y metionina, interrumpiendo así la formación de ADN, ARN y proteínas.
Dentro de estos medicamentos se encuentran capecitabina, cladribina, citarabina, fluorouracilo,
gemcitabina, mercaptopurina y tioguanina (antagonista de la purina) (Chu E, DeVita VT,
2010).

1.4.2.1.3. Alcaloides vegetales: su mecanismo implica despolimerización de los

microtúbulos, que son parte importante del citoesqueleto y del huso mitótico. Se fija
específicamente a la proteína microtubular tubulina en forma dimérica; el complejo fármaco-
tubulina se adhiere al extremo en formación de los microtubulos. Esto produce la detención del
proceso mitótico en la metafase, la disolución del huso mitótico y la interferencia con la
segregación de cromosomas. Dentro de este grupo se encuentra la vinblastina, vincristina,
vinorelbine, etopósido, tenipósido, topotecan, irinotecan, paclitaxel y docetaxel (Katzung B, et
al, 2010).

1.4.2.1.4. Antibióticos: el escrutinio de microbianos ha llevado al descubrimiento de

una cantidad de inhibidores del desarrollo que han probado ser clínicamente útiles en la
quimioterapia del cáncer. Muchos se fijan al ADN mediante la intercalación entre las bases
específicas y el bloqueo de la síntesis de nuevo ARN o ADN (o ambos), producen la división
de la cadena de ADN e interfieren con la replicación celular. Todos los antibióticos útiles de
los que se dispone en la actualidad son productos de diversas cepas de microorganismos
terrestres como Streptomyces. Estos incluyen las antraciclinas, actinomicina, bleomicina,
mitomicina y plicamicina (Kufe D, 2006).

1.4.2.1.5. Antraciclinas: son la doxorrubicina y daunorrubicina, aislados de

Streptomyces peucetius variante caesius, se encuentran entre los citotóxicos más útiles. Los
dos representantes son aprobados por la FDA. Sus estructuras se muestran en seguida.

17
 Figura 1.1 Doxorrubicina.
Su mecanismo de acción es por medio de tres principales acciones para las toxicidades
orgánicas y tumorales de las antraciclinas. Estas incluyen:
1) Fijación de alta afinidad al ADN a través de la intercalación con el bloqueo
consecuente de la síntesis de ADN y ARN y la división de la cadena de ADN a
través de efectos de la topoisomerasa II,

2) Fijación a las membranas para alterar la permeabilidad y el transporte de iones y,

3) Generación del radical libre semiquinona y de radicales de oxígeno a través de

procesos reductivos mediados por enzimas. Esta última acción puede ser
responsable de la toxicidad cardiaca a través del daño mediado por radicales de
oxígeno a las membranas.

La doxorubicina es un antineoplásico muy importante, con mayor aplicación clínica en

carcinomas de mama, endometrio, ovario, testículos, tiroides y pulmón; así como en el
tratamiento de muchos otros sarcomas, incluyendo el neuroblastoma, sarcoma de Ewing,
osteosarcoma y rabdomiosarcoma. De igual manera es útil en las patologías oncológicas
hematológicas incluyendo leucemia aguda, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin y los
linfomas no Hodgkin. Es utilizado en el tratamiento adyuvante en el sarcoma osteogénico y el
cáncer de mama.
El principal uso de la daunorrubicina es en el tratamiento de la leucemia aguda y para este
propósito el fármaco puede tener una actividad ligeramente mayor que la doxorrubicina. No
obstante la daunorrubicina de hecho parece tener un espectro de utilidad más estrecho; su
eficacia en tumores sólidos parece ser limitada (Katzung B, et al, 2010).
Las bleomicinas son una serie de antibióticos antineoplásicos producidos por Streptomyces
verticillus. El material es clínicamente utilizado de 11 diferentes glucopéptidos siendo los
principales componentes la bleomicina A2 y la bleomicina B2. Al parecer este fármaco actúa
18
mediante la fijación a ADN, que resulta en el rompimiento de la cadena sencilla y doble con la
siguiente formación de radicales libres y la inhibición de la biosíntesis de ADN. La
fragmentación del ADN se debe a la oxidación de un complejo ADN-bleomicina-Fe(II) que
produce aberraciones cromosomales. La bleomicina produce acumulación en las células en fase
G2. Por otra parte, parece tener una interacción de sinergismo con otros medicamentos como
la vinblastina y el cisplatino en el tratamiento de cáncer de testículo (Chu E, et al, 2010).

1.4.2.1.6. Agentes hormonales: los mecanismos de acción de las hormonas esteroides

en los cánceres linfoide, mamario o prostático han sido parcialmente esclarecidos. Las
hormonas esteroides se fijan a las proteínas receptoras en las células cancerosas, por lo que son
predecibles altos valores de proteínas receptoras durante la respuesta al tratamiento endocrino.
Se han identificado proteínas receptoras altamente específicas para los estrógenos,
progesterona, corticosteroides y andrógenos en algunas células neoplásicas. Dentro de estos
medicamentos están los inhibidores de estrógenos y andrógenos como son el tamoxifeno y
flutamida; los agonistas de la hormona liberadora de gonadotropina como es el leuprolide y
goserelina; y los inhibidores de aromatasa como son aminoglutetimida y anastrazol (Kantoff
PW, 2001).

1.4.3. Biomarcadores

Se define como Biomarcador a los cambios medibles, ya sean bioquímicos, fisiológicos o

morfológicos, asociado a la exposición a un tóxico, ya sean de naturaleza química, física o de
otro tipo (Van der Oost et al, 2003). Se emplean para identificar la presencia y consecuencias
biológicas de una exposición, la localización de los estados iniciales e intermedios de un
proceso patológico, y detectar la sensibilidad de una población.

1.4.3.1 Clasificación de biomarcadores

1.4.3.1.1 Biomarcadores de exposición o de dosis interna

Es un compuesto exógeno (o un metabolito) dentro del organismo que se refleja tras la

exposición de éste a un xenobiótico. El análisis se realiza en fluidos corporales (sangre y orina,

19
fundamentalmente) o incluso aire espirado (Repetto, 1997). En el caso de tóxicos acumulativos,
la dosis interna refleja la cifra de agente tóxico almacenado en uno o varios compartimentos
corporales.

Como se muestra en la figura 4, la progresión de la acción de los biomarcadores de dosis interna

al nivel molecular de dosis efectiva, se valora por la exposición externa a cualquier compuesto
o contaminante, lo cual genera una dosis interna en el organismo en estudio, dando con esto
respuesta cuantificable mediante, la cantidad absorbida, la cantidad en tejido, células,
macromoléculas y estado crítico ocasionado por el compuesto en cuestión (Christiani, 1996).

EXPOSICIÓN EXTERNA

Dosis interna
RELACIÓN CON EFECTOS

RELACIÓN CON EXPOSICIÓN

Cantidad total
absorbida

Cantidad en tejido

Cantidad en
células

Cantidad en las
macromoléculas

Cantidad en
estado critico

DOSIS BIOLOGICAMENTE EFECTIVAS

Figura 1.2. Progresión de la acción de los biomarcadores de dosis interna al nivel molecular
de dosis efectiva. FUENTE: Modificado de WHO, IPCS Environmental Health Criteria 155
Biomarkers and Risk Assessment Geneva, 1993.

20
Bernard y Lauwerys (2004), dividen los biomarcadores de exposición en dos subgrupos,
basándose en la especificidad de las pruebas de detección: a) Los biomarcadores selectivos se
basan en la medida directa del tóxico o sus metabolitos en fluidos biológicos (plomo en sangre);
b) Los no selectivos constituyen un grupo de indicadores inespecíficos de exposición (tioéteres
en orina como indicadores de exposición a sustancias electrófilas y, por tanto, reflejo de la
absorción de sustancias mutagénicas y carcinogénicas).

1.4.3.1.2 Biomarcadores de susceptibilidad.

Sirven como indicadores de sensibilidad individual al efecto de un xenobiótico o grupo de

compuestos tóxicos. Se deben generalmente a factores genéticos, reconocibles por estudios de
ADN y sus fragmentos de restricción, clonado de genes e investigación de polimorfismos de
actividades enzimáticas (Repetto, 1997).
Siendo reportados los polimorfismos de sistemas activadores y polimorfismos de sistemas
detoxificadores (Van Counteren et al., 1996).

1.4.3.1.3 Biomarcadores de efecto (o respuesta)

Son indicativos de cambios bioquímicos en un organismo como resultado de la exposición a

xenobióticos. Incluyen modificaciones en la composición celular sanguínea, alteraciones en
actividades enzimáticas, aparición de aductos del ADN, incrementos localizados de ARN-m,
aumento de determinadas proteínas, e incluso aparición de anticuerpos específicos
(autoanticuerpos) contra un xenobiótico o frente a fracciones celulares (núcleo y membrana)
(Repetto, 1997).

Siendo importante resaltar a los biomarcadores de estrés oxidativo, debido a que algunos
contaminantes (hidrocarburos aromáticos policíclicos y halogenados, metales pesados,
herbicidas y disolventes) son capaces de originar daño oxidativo en el organismo, en respuesta
a un mecanismo adaptativo, siendo desencadenados mecanismos adaptativos por los sistemas
de protección, encontrando afectadas las moléculas de los lípidos, proteínas y ácidos nucléicos
(Di Guilio et al., 1989; Levine, 1994)

21
1.4.3.2 Estrés oxidativo.
El estrés oxidativo es el desbalance entre la producción de especies reactivas de oxigeno (ERO)
y la defensa antioxidante (figura 6), que lleva a una variedad de cambios fisiológicos y
bioquímicos los cuales ocasionan deterioro y muerte (Rodríguez et al., 2001,).

DETERIORO Y
MUERTE

CAMBIOS
FUNCIONALES
Y

ERO

Antioxidantes

Figura 1.3. Estrés oxidativo

1.4.3.2.1 Radicales libres

Los radicales libres (RL) son moléculas que en su estructura atómica presentan un electrón
desapareado o impar en el orbital externo, dándole una configuración espacial que genera una
inestabilidad, alta reactividad y una gran capacidad de combinarse inespecíficamente con
biomoléculas como carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucléicos y derivados de cada uno
de ellos. Son producidos continuamente como parte del metabolismo normal de la célula e
inactivados por un conjunto de mecanismos (unos enzimáticos y otros de captura). Durante el
proceso metabólico una pequeña parte (2-3%) de los radicales libres pueden evadir el

22
mecanismo redox y causar daño oxidativo a los componentes celulares (Rodríguez et al., 2001;
Hangsber, 2002; Valavanidis et al., 2006).

1.4.4.2.2 Especies reactivas de oxígeno

Se consideran especies reactivas de oxigeno (ERO) al oxígeno atómico (O), al ozono (O3), al
oxígeno singulete (1O2) que se produce con la excitación de uno de los electrones desapareados
del O2, al superóxido (O2-.), al peróxido de hidrógeno (H2O2) y al radical hidroxilo (.OH), estas
últimas consideradas especies parcialmente reducidas. Las ERO en bajas concentraciones
estimulan el crecimiento de las células, de algunas bacterias y otros microorganismos, además
de que son indispensables para diferenciación celular y la muerte celular programada
(Konigsberg, 2008).

El O2 reacciona con la mayoría de los compuestos celulares, con la membrana plasmática, los
ácidos nucleicos, las proteínas, los lípidos y los carbohidratos muy cerca del sitio donde se
forma. Interacciona con las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos siendo el producto
principal la 8-hidroxiguanidina (Konigsberg , 2008).

El O2-. es a la vez un anión y un radical, se produce principalmente en la cadena respiratoria.

Es tóxico para la célula por que a partir de él se puede originar el 1O2 y el H2O2 (Valavanidis
et al., 2006; Konigsberg, 2008).

El H2O2 se forma cuando uno de los dos electrones de O2 se ha apareado con un electrón de
giro contrario. Puede formar aductos con algunos carbohidratos, aminoácidos y bases
nitrogenadas. Es tóxico ya que puede formar 1O2 y .OH, aunado a la reacción con algunos
metales de transición con los que se produce el radical .OH el cual interacciona de forma
irreversible con proteínas y DNA (Konigsberg, 2008).

El .OH se produce principalmente por la reacción de Fenton. Es uno de los compuestos más
reactivos que existen, puede oxidar tanto las bases púricas como las pirimídicas y también la
desoxirribosa, además puede producir rupturas en el DNA. También reacciona con cualquier
aminoácido en el sitio que se origina, incluso con los ácidos grasos poliinsaturados
(Valavanidis et al., 2006).

23
Otras fuentes endógenas de ERO dentro de las células son las enzimas oxidativas como
triptófano dioxigenasa, xantino oxidasa y citocromo P450 reductasa, que pueden producir O2-
.
, mientras que las enzimas guanidilciclasa y glucosa oxidasa generan peróxido de hidrógeno.
Los contaminantes químicos son una fuente importante para la generación de ERO en los
organismos, tal es el caso de los metales de transición, los herbicidas, las quinolonas y los
componentes nitroaromáticos, ampliamente conocidos por su potencial para causar estrés
oxidativo (Valavanidis et al., 2006).

1.4.3.2.3 Efectos del estrés oxidativo sobre biomoléculas

1.4.3.2.3.1 Lipoperoxidación

Es la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados que induce disfunción de los organelos, la
cual puede culminar en daño ultraestructural. Las membranas celulares contienen fosfolípidos
que contienen ácidos grasos con varias ligaduras dobles, estos ácidos grasos poliinsaturados
son más lábiles a la oxidación que los saturados y los monosaturados, ya que los metilenos
entre dos dobles ligaduras pueden perder fácilmente un hidrógeno (Hangsber, 2002).

La oxidación de los lípidos de membrana puede ocurrir tanto por la vía enzimática como por
la no enzimática. Durante la no enzimática las ERO inician el daño oxidativo en los lípidos de
membrana y los RL de los lípidos resultantes propagan el proceso de la peroxidación. En la
lipoperoxidación enzimática los ácidos grasos oxidados son liberados por la fosfolipasa A2, el
metabolismo de éste es una fuente de ERO que puede producir estrés oxidativo por tres vías:
por la de la lipooxigenasa, que hace posible la formación de prostaglandinas; por la vía de la
ciclooxigenasa que permite la formación de prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos y por
la vía catalizada por el citocromo P450, que interviene en los procesos de detoxificación de
diversas sustancias (Konigsberg , 2008).

1.4.3.2.3.1.1 Etapas de la lipoperoxidación

El proceso de la lipoperoxidación está compuesto por un conjunto de reacciones en cadena,

sobre los ácidos grasos poliinsaturados (Valavanidis et al., 2006).

24
a) Iniciación de la lipoperoxidación: comienza cuando un ácido graso poliinsaturados es
atacado por una ERO que es capaz de absorber o retirar un átomo de hidrógeno de un grupo
metileno. El metileno queda como radical libre que se estabiliza mediante un rearreglo
molecular que da origen a un dieno que no reacciona con el singulete de oxígeno, sino con
oxígeno molecular y forma el radical peroxilo como se muestra en la figura 7.

Figura 1.4 Iniciación de la lipoperoxidación

b) Propagación de la lipoperoxidación: la molécula a la que se le ha abstraído un hidrógeno,

hará lo mismo a la molécula de ácido graso poliinsaturados adyacente (figura 8), estableciendo
una reacción en cadena y de esta forma se propaga la lipoperoxidación a través de la membrana.

(Radical lípido peroxilo)

(Lípido hidroperoxilo)

Figura 1.5 Propagación de la lipoperoxidación

c) Terminación: en el proceso de lipoperoxidación es el resultado de la interacción de los

radicales lipídicos y/o la formación de especies no radicales por los radicales lipidoperoxilo.
El resultante –LOOH que puede descomponerse fácilmente a varias especies reactivas,
incluyendo radicales lípido-alcoxil (LO.), aldehído (malondialdehído, alcanos, epoxi-lípidos y
alcoholes (Valavanidis et al., 2006).

25
1.4.3.2.3.1.2 Efectos de la lipoperoxidación

Cuando reaccionan los radicales libres de ácidos grasos poliinsaturados entre sí se pueden
formar dímeros por entrecruzamiento o ciclación, creando aglomerados que conducen a la
disminución de la fluidez y de la permeabilidad de la membrana, modificando su estructura y
con ello la función de las células y de los tejidos. De manera indirecta los productos de
lipoperoxidación pueden reaccionar con otras moléculas (aminoácidos) y dañar a las célula
(Konigsberg , 2008).

1.4.3.2.3.2 Daño a proteínas

Diversas proteínas son capaces de tolerar una gran cantidad de oxidaciones sin que
aparentemente se vea afectada su función. La oxidación parcial y selectiva en algunos casos
produce proteínas modificadas que pueden actuar como moduladores en algunas reacciones,
favoreciendo la homeostasis celular, en este caso la oxidación tiene una finalidad fisiológica.
Por otro lado, existe una gran cantidad de agentes oxidantes que pueden dañar a las proteínas.
Uno de los daños que es utilizado como marcador de la oxidación de las proteínas es su
carbonilación, la cual se puede llevar a cabo por la oxidación directa de los residuos de lisina,
arginina, prolina y treolina. También pueden ser introducidos por reacciones con aldehídos
(malondialdehído, 4-hidroxi-2-nonenal) producidos durante la lipoperoxidación o al incorporar
un grupo carbonilo a la proteína al reaccionar residuos de lisina con azúcares reductores o de
sus productos de oxidación (Hangsber, 2002; Konigsberg, 2008).

1.4.3.2.3.3 Defensa antioxidante

Los organismos cuentan con diversos sistemas de defensa que les permiten contrarrestar los
efectos del estrés oxidativo generado por RL y ERO. La defensa antioxidante puede
subdividirse en antioxidante enzimáticos y en no enzimáticos (Figura 1.6) (Gregus y Klassen,
2001).

26
 ANTIOXIDANTES
NO ENZIMATICOS:
ANTIOXIDANTES
VITAMINA C, ENZIMATICOS:
VITAMINA E,
SOD, CAT , GPX,
VITAMINA A,
GSH
FLAVONOIDES,
ÁCIDOS FENÓLICOS

Figura 1.6. Tipos de antioxidantes

1.4.3.2.3.3.1 Enzimas antioxidantes

1.4.3.2.3.3.1.1 Superóxido dismutasa

La superóxido dismutasa (SOD), cataliza la dismutación de O2-. en H2O2 y O2 (figura 1.7). Esta
familia de enzimas está formada por tres miembros: La SOD1 que tiene en su centro catalítico
Cu+2 y Zn+2 y se encuentra en el citoplasma y el núcleo; la SOD2 que se encuentra en la
membrana interna de la mitocondria y en su centro catalítico tiene Mn (lll) y finalmente la
SOD3 se encuentra en el exterior de la célula y también tiene Cu+2 y Zn+2 en su centro catalítico
(Hangsber, 2002; Konigsberg, 2008.).

O2_. SOD
HO
2 2
O2

Figura 1.7.Reacción de Superóxido Dismutasa

27
1.4.3.2.3.3.1.2 Catalasa

Las catalasas (CAT) son enzimas capaces de descomponer el H2O2 a H2O y O2 (figura 1.8) a
cualquier pH entre 4 y 11. Las monofuncionales tienen una sola actividad, pero existen otras
que también son capaces de oxidar algunas moléculas pequeñas como metanol y etanol. Están
formadas por cuatro subunidades asociadas a un grupo hemo cada una. Emplean dos moléculas
iguales de H2O2, una como agente reductor y otra como agente oxidante, el H2O2 al entrar en
el sitio activo de la enzima, toma un electrón del fierro y otro del hemo para generar una
molécula de agua, una segunda molécula de H2O2 cede un electrón al ferroxilo y otro al hemo,
restituyendo el estado inicial de la enzima y liberando una molécula de dioxígeno y otra de
agua (Hangsber, 2002).

HO
2

HO CAT
O2
2 2

HO
2

Figura 1.8 Reacción de la Catalasa

1.4.3.2.3.3.1.3 Glutatión peroxidasa

La glutatión peroxidasa (GPx) es una selenoproteína, que requiere al glutatión como agente
reductor del H2O2 (figura 1.9). Existen cuatro tipos de GPx, la citosólica (GPx 1), la
gastrointestinal (GPx2), la plasmática (GPx3) y la de fosfolípidos (GPx4). Son homotetrámeros,
con la excepción de la GPx4 que es un monómero de tamaño menor a las subunidades de las
otras glutatión peróxidasas. La GPx de hidroperóxidos de fosfolípidos es capaz de actuar sobre
los fosfolípidos de las membranas celulares y de las lipoproteínas, además de los

28
hidroperóxidos de timina y de ésteres de colesterol, son capaces de reducir el H2O2 y los
hidroperóxidos de ácidos grasos (Hangsber, 2002).

HO GPX HO GSSG
2 2 GSH 2

Figura 1.9 Reacción de Glutatión Peroxidasa

En resumen, la figura 1.10 describe la reducción del oxígeno de electrón único que produce la
formación de radical anión superóxido (O2-.) que se mantiene a concentraciones intracelulares
bajas por medio de dismutación espontánea o rompimiento catalítico por la enzima SOD para
forma peróxido de hidrógeno. Pueden ocurrir tres fenómenos con el peróxido de hidrógeno: en
presencia de O2-. o metales de transición, como el hierro o cobre, se reduce hacia el radical
hidroxilo (HO.); puede catalizarse por la CAT para formar agua y oxígeno y puede
detoxificarse mediante la GPx en presencia de glutatión (GSH) para formar agua y glutatión
oxidado (GSSG) (Gregus y Klassen, 2001).

29
 _
O2 O O2
+
2H

SOD
-
O
2

GPX
GSSG HO
2 GSH HO
2 2
O2

HO
2
O2
HO
2

Figura 1.10 Reacciones de las enzimas antioxidantes.

1.4.3.3 Estrés oxidativo en enfermeras ocupacionalmente expuestas

El personal de enfermería encargado de manipular medicamentos citotóxicos debe ser

informado acerca de todos los riesgos a los que se va a exponer para que tome una decisión

30
individual. Si el manejo, preparación (Figura 1.11) y administración de los medicamentos
antineoplásicos se realiza con normas de seguridad adecuadas se reducirá el riesgo potencial
por exposición.

Figura 1.11. Preparación de medicamentos antineoplásicos.

La preocupación por los riesgos laborales asociados con la manipulación de los agentes
quimioterapéuticos aumenta día a día. Los citostáticos se manejan a menudo en condiciones
inadecuadas con el riesgo de inhalación o contacto cutáneo. Las normas de seguridad deben
cumplirse para evitar y minimizar los riesgos que conlleva la manipulación de estos
medicamentos, estandarizar su preparación, administración y deposición final. Sin embargo no
siempre se observan de manera adecuada estas normas y es cuando el personal de enfermería
se encuentra expuesto a los efectos que estos agentes producen.

1.4.4 Los medicamentos citostáticos y estrés oxidativo

El balance de las especies oxidantes y antioxidantes, puede ser un factor clave para
aumentar los efectos de los agentes antineoplásicos, así como también para prevenir ciertos
efectos secundarios de la quimioterapia (Andreadou I, et al, 2007).
Durante el tratamiento con quimioterapia el estrés oxidativo aumenta de forma muy
marcada, y los niveles de vitamina C, vitamina E y glutatión disminuyen considerablemente en
el plasma (Gao S, et al, 2008).
De forma paradójica el estrés oxidativo interfiere con el crecimiento del tumor. Uno de los
indicadores de este proceso, los lipoperóxidos, al incrementarse conllevan a una prolongación
de las células a un estado quiescente (fase G1 o G0 (Figura 1.12)), y los agentes
quimioterapeúticos actúan cuando las células malignas se están replicando de forma constante,
no cuando se encuentran en un estado quiescente.
31
 Fugura 1.12 Ciclo celular y cáncer.
Las células malignas poseen una capacidad antioxidante mayor que las células normales;
sin embargo, este efecto es superado por el estrés oxidativo inducido por medicamentos
antineoplásicos, las células cancerosas en estado quiescente (fase G0) no son afectadas por
éstos. Los radicales libres interfieren directamente con los efectos citotóxicos, es decir con su
actividad antineoplásica (Katzung B, et al, 2010).
El uso de medicamentos antineoplásicos conlleva a una serie de efectos secundarios.
Algunos son esperados e indicativos de una respuesta adecuada. Tal es el caso de la supresión
de la médula ósea; la mielosupresión. Las células con un recambio mayor, es decir aquellas
con vida corta y que se regeneran constantemente son las más afectadas. Empero, existen otros
efectos indeseables que no necesariamente indican que el medicamento está llevando a cabo
su función. El efecto tóxico al corazón de la doxorubicina (taquicardia, insuficiencia cardiaca),
la fibrosis pulmonar causada por la bleomicina y el efecto ototóxico del cisplatino tiene que
ver, en mayor o menor grado, con la generación de radicales libres. La generación de radicales
libres durante la quimioterapia juegan un rol significativo en el desarrollo de cáncer secundario,
aparición de otro cáncer en años posteriores a la quimioterapia (DeVita, et al, 2010).
Los agentes antineoplásicos pueden producir estrés oxidativo como un mecanismo de
toxicidad. En este proceso se generan radicales libres que al interaccionar con las
macromoléculas celulares afectan las funciones en el organismo. El resultado de esta situación,
es la lipoperoxidación, oxidación de proteínas, la formación de aductos de ADN, mutaciones
y alteraciones genéticas. Los procesos en cuyo daño se implican los radicales libres son de
especie muy variada; no obstante pueden citarse algunas alteraciones como son:
32
desnaturalización de las cadenas de ADN, liberación de factores quimiotácticos que provocan
la llegada de leucocitos activados que a su vez generan más de estos radicales, inicio de la
peroxidación lipídica con alteración de la membrana celular, que genera hidroperóxidos,
aldehídos y endoperóxidos que dañan a las proteínas y al DNA; y la desnaturalización de
proteínas presentes en el citosol y las enzimas de membrana (Sohal R, 2002; Singh U, 2006).

1.5 Justificación

La manipulación de antineoplásicos (citostáticos) es una actividad con un riesgo potencial

asociado a estos medicamentos. Todas las operaciones de preparación de éstos deben realizarse
en una cabina de seguridad biológica cuyo diseño y funcionamiento garantice suficientemente
tanto la protección del producto manipulado como la del trabajador, sumándose a esta
necesidad la protección del medio ambiente laboral y comunitario. En todos los casos debe
procederse a una formación de los trabajadores para que además de conocer el riesgo, los
minimicen con métodos de trabajo adecuados.
La exposición del profesional a este tipo de fármacos no sólo depende del número de
preparaciones por día que se realicen sino, y, sobre todo, de la técnica personal de trabajo y de
las precauciones que se tomen durante su manipulación (Valanis V, et al, 1999).
La inexistencia de una unidad centralizada de capacitación para la preparación y manejo de
citostáticos supone una menor protección frente a sus efectos potencialmente tóxicos, como
para disminuir la calidad asistencial de los pacientes.
Se sabe que los agentes quimioterapéuticos pueden producir estrés oxidativo como un
mecanismo de toxicidad. En este proceso se generan radicales libres que al interaccionar con
los lípidos estructurales de las membranas celulares producen lipoperoxidación. El resultado
de esta situación, es la formación de aductos de ADN, mutaciones y alteraciones genéticas.
Así, los efectos acumulativos de los radicales libres están implicados en mecanismos de
producción de diferentes condiciones patológicas en humanos (Singh U, et al, 2006; Andreadou
I, et al, 2007; Gao S, et al, 2008).
Por lo anterior se hace necesario contar con biomarcadores tempranos eficaces, seguros,
confiables, rápidos, sensibles y asequibles, que puedan ser utilizados para apoyar a la vigilancia
epidemiológica para la prevención de los daños potenciales a la salud en los trabajadores
expuestos a estos medicamentos. El contar con estas herramientas permite: 1) Proporcionar
la máxima seguridad al personal sanitario frente a la exposición de citostáticos, 2) Aumentar
la calidad asistencial de los pacientes, verificando que se cumpla con las normas de preparación
33
de estos medicamentos por el personal de enfermería, 3) Permitir optimizar los recursos:
minimización de la contaminación y de los recursos materiales empleados y 4) Aportar
beneficios adicionales como asegurar la estabilidad y la esterilidad de los citostáticos
preparados.

1.6 Hipótesis
Si las enfermeras ocupacionalmente expuestas a la preparación y administración de
medicamentos antineoplásicos no observan las medidas necesarias para estas actividades
entonces se incrementará el grado de estrés oxidativo aumentándose el indicador a nivel
proteínas carboniladas y grado de lipoperoxidación, además en la defensa antioxidante por las
enzimas SOD, CAT y GPX se observarán variaciones significativas.

34
 1.7 Objetivos

1.7.1 Objetivo General

Evaluar el estrés oxidativo generado en enfermeras ocupacionalmente expuestas y no

expuestas a medicamentos citotóxicos, como biomarcador temprano de toxicidad.

1.7.2 Objetivos Específicos

O1. Determinar el grado de lipoperoxidación así como los contenidos de proteínas carboniladas
en plasma de personal ocupacionalmente expuesto y no expuesto a medicamentos
citostáticos.

O2. Determinar los niveles de enzimas antioxidantes (glutatión peroxidasa, catalasa y

superóxido dismutasa) en plasma de personal ocupacionalmente expuesto y no expuesto a
medicamentos citostáticos.

O3. Establecer la relación de los biomarcadores de estrés oxidativo analizados en personal

ocupacionalmente expuesto y no expuesto a medicamentos citostáticos.

35
1.7 Metodología

Tipo de Estudio: observacional

Diseño del Estudio: descriptivo, correlacional, prospectivo.
1.8.1 Universo de estudio
El estudio se llevará a cabo en enfermeras ocupacionalmente expuestas y no expuestas
a medicamentos citotóxicos que laboran en el Centro Oncológico Estatal ISSEMyM de la
Ciudad de Toluca en el Estado de México, Hospital Materno Infantil del ISSEMyM, en la
Clínica 220 del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) de la Ciudad de Toluca en el
Estado de México, En la Unidad de Medicina Familiar No. 231 del IMSS, en Metepec, Estado
de México y en el Hospital para el Niño DIF, en Toluca, Estado de México.
.
1.8.2 Procedimiento
La selección de la muestra no es probabilística, de oportunidad, secuencial y de grupos
intactos. El tamaño de muestra es de 30 enfermeras para cada grupo, pues se considerarán todas
las enfermeras ocupacionalmente expuestas y no expuestas a medicamentos antineoplásicos
bajo previo consentimiento informado. A las enfermeras se les invitó a participar en el
proyecto, se les informo de las características del estudio y la necesidad de tomarles una
muestra de sangre, aquellas que acepten firmaron una carta de consentimiento informado. Se
les tomarán dos muestras de sangre venosa utilizando heparina y EDTA como anticoagulante,
las cuales se transportarán bajo condiciones apropiadas al laboratorio de Toxicología en la
Facultad de Química de la Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) para su
análisis.

1.8.3 Criterios de inclusión 1.8.4 Criterios de exclusión

 Antigüedad laboral mayor de 2  Que cursen con enfermedades
años. crónicas degenerativas.
 Intervalo de edad de 18 a 35 años.  Fumadoras y alcohólicas.
 Que manifiesten estar sanos.  Que hayan tenido tratamientos
radiológicos.

36
1.8.5 Evaluación del estrés oxidativo
Para evaluar el grado de estrés oxidativo se utilizarón los siguientes biomarcadores:
lipoperoxidación que se determinó por la reacción del ácido tiobarbitúrico con el
malondialdehído formado por la peroxidación de los lípidos de las células (Buege J, et al,
1978), la oxidación de proteínas por el método de Levine (Levine RL, et al, 1994), la
actividad enzimática de la superóxido dismutasa (Aebi H, 1984) y la catalasa siguiendo los
métodos modificados de Misra HP, Fridovich I (1972) y Radi R (1991), respectivamente, así
como la glutatión peroxidasa (Gunzler y Flohe), se cuantifico la cantidad de proteína total
por lo método de Bradford (1976).

1.8.5.1 Determinación del grado de lipoperoxidación

A 500 µL del homogenizado celular (sin centrifugar) se adicionaron 1 mL de la
solución reguladora tris-HCl 150 mM a pH 7.4. Se incubará a 37°C por 30 minutos. Después
de la incubación se agregó 2 mL de la solución de ácido tiobarbitúrico al 0.375% (preparada
al momento) en ácido tricloroacético al 15% y se incubo a 37°C por 45 minutos. Concluido
el tiempo se centrifugo a 2500 rpm por 5 minutos y se determinó la absorbancia a 535 nm.
Los resultados se expresan en mM de malondialdehído /mg proteínas/g tejido usando el
coeficiente de extinción molecular (CEM) el cual es de 1.56 x 105 M-1cm-1 (Beuge J, et al,
1978).

1.8.5.2 Determinación de los niveles de oxidación de proteínas

A 100 µL de sobrenadante se le adicionarón 150 µL de 10mM de DNPH/2M HCl. Se
incubo durante 1 h a oscuridad. Después de la incubación se le adicionarón 500 µL de
tricloroacético al 20% y se dejó reposar durante 15 minutos a 4º C. El precipitado se
centrifugo a 11,000 rpm durante 5 minutos. El botón se lavó dos veces con etanol-acetato de
etilo 1:1 y posteriormente se disolvió en 1 mL de una solución de 6M guanidina pH 2.3 y se
incubo a 37ºC durante 30 minutos. La absorbancia se determinó a 366 nm. Los resultados se
expresan en mM o nM de carbonilos reactivos (C=O) /mg proteínas, se utiliza el coeficiente
de extinción molecular (CEM) el cual es de 21,000 M-1 cm-1 (Levine RL, et al, 1994).

33
1.8.5.3 Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa
Se adicionaron 20 µL del homogenizado celular a la celda y se completa a 150 µL
con la solución amortiguadora de carbonatos (50 mM de carbonato de sodio y 0.1 mM
EDTA) a pH 10.2. Se agregaron 100 µL de adrenalina 30 mM, y se determino la absorbancia
a 480 nm, a los 30 segundos y 5 minutos (Aebi H, 1984; Misra HP, et al, 1972). Las lecturas
de las muestras se extrapolaron en la curva tipo que se obtiene utilizando los datos de la
siguiente tabla.
Curva tipo para la determinación de la SOD.
Buffer de
Unidades SOD SOD (µl)* Adrenalina (µl)** Carbonatos
(µl)***
18.65 5 100 145
37.3 10 100 140
55.95 15 100 135
74.6 20 100 130
93.25 25 100 125

*De una solución de 375 U SOD. ** De una solución de 30 mM adrenalina. ***De una
solución de 50 mM de NaCO3, 0.1 mM EDTA, pH 10.2.

1.8.5.4 Determinación de la actividad de la catalasa

A 20 µL del sobrenadante del homogenizado celular se le agrego 1 mL de la solución
amortiguadora de aislamiento (0.3 M sucrosa, 1 mM EDTA, 5 mM HEPES y 5 mM KH2PO4)
y 0.2 mL de la solución de H2O2 20 mM. Posteriormente se determino la absorbancia a 240
nm, a 0 y 60 segundos (Radi R, et al, 1991). Los resultados se obtuvieron sustituyendo la
absorbancia de ambos tiempos en la siguiente formula:
Concentración de catalasa = (A0- A60)/CEM
Donde el CEM del H2O2 = 0.093 mM-1 cm-1; los datos son expresados en mM de
H2O2/min/g tejido.

34
1.8.5.5 Determinación de glutatión peroxidasa (Paglia DE, et al, 1967) con
modificaciones
Se tomó 0.1 mL de sobrenadante (fracción S9 obtenido por centrifugación diferencial)
en una celda de cuarzo de 1.0 cm y se agregó 1.0 mL de sol buffer (50 mM de fosfato de
potasio pH 7.0; 3.5 mM de GSH, 1.0 mM de NaN3, 2 U de glutation reductasa, y 0.12 mM
NADPH / 1.0 ml), posteriormente se mezcló. Se agregaron 0.1 mL de H2O2 y se registraron
las lecturas inicial y a los 5 minutos. Para calcular la actividad de la GPX por minuto se
utilizó del coeficiente de extinción molar del NADPH de 6.22 mM-1 cm-1.

1.9 Análisis estadístico

Se construyó una base de datos en donde se agrupo a la población ocupacionalmente

expuesta y no expuesta, se realizó un análisis estadístico descriptivo y posteriormente un
análisis multivariado para conocer el grado de asociación entre las variables estudiadas y el
nivel de estrés oxidativo empleando el programa estadístico SPSS versión 11 para windows.
Así mismo se determinó la sensibilidad, especificidad y valor predictivo de los
biomarcadores empleados.

35
CAPITULO 2. “DISCUCIÓN DE RESULTADOS”

36
 2.1 Resultados

2.1.1. Carta de recepción del artículo.

Environment International <r.alcock@lancaster.ac.uk> 9 de octubre de 2013 15:48 Para:

Leobardo Manuel Gomez Olivan <lmgomezo@uaemex.mx>, "lgolivan74@gmail.com"
<lgolivan74@gmail.com>
Submission Confirmation

Dear Leobardo,

Your submission entitled "Oxidative stress induced in nurses by exposure to preparation

and handling of antineoplastic drugs in Mexican hospitals: a multicentric study" has been
received by Environment International

You may check on the progress of your paper by logging on to the Elsevier Editorial
System as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/envint/.

Your username is: lmgomezo@uaemex.mx
If you need to retrieve password details, please
go to: http://ees.elsevier.com/envint/automail_query.asp

Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned. Thank
you for submitting your work to this journal.
Kind regards,

Elsevier Editorial System Environment International

37
 2.1.2 Artículo: Oxidative stress induced in nurses by exposure to preparation and
handling of antineoplastic drugs in Mexican hospitals: a multicentric study

Gerardo Daniel Miranda-Mendoza1, Leobardo Manuel Gómez-Oliván1*, Paula Anel

Cabrera-Galeana2, Marcela Galar-Martínez3, Hariz Islas-Flores1, Jorge J Ramírez-García1,

Enrique Morales-Ávila1, Nadia Neri-Cruz1, Sandra García-Medina3

1
Laboratorio de Toxicología Ambiental, Facultad de Química, Universidad Autónoma del

Estado de México. Toluca, México, México.

2
Centro Oncológico Estatal del Instituto de Seguridad Social del Estado de México y

Municipios. Toluca, México, México.

3
Laboratorio de Toxicología Acuática, Departamento de Farmacia. Escuela Nacional de

Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. México, DF, México.

*CORRESPONDING AUTHOR:

Dr. Leobardo Manuel Gómez-Oliván

Laboratorio de Toxicología Ambiental. Departamento de Farmacia. Universidad Autónoma

del Estado de México, Paseo Colón intersección Paseo Tollocan, s/n. Col. Residencial

Colón, Toluca, Estado de México, C.P. 50120 México

Tel + (52) 7222173890

Fax + (52) 7222173890

E-mail address: lmgomezo@uaemex.mx (L.M. Gómez-Oliván)

38
 leobardo_gomez_olivan@yahoo.com.mx

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate oxidative stress in nurses occupationally exposed to

the preparation and handling of antineoplastic drugs in diverse hospitals in Mexico. Lipid

peroxidation (LPX), protein carbonyl content (PCC) and activity of the antioxidant

enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx)

were evaluated in blood of study participants. The group of occupationally exposed (OE)

nurses consisted of 30 individuals ranging in age from 25 to 35 years. The control group

included 30 nurses who were not occupationally exposed to the preparation and handling of

antineoplastic drugs and whose sociodemographic characteristics were similar to those of

the OE group. All biomarkers evaluated were significantly increased (p < 0.5) in OE nurses

compared to the control group. Results show that the assessment of oxidative stress

biomarkers is advisable in order to evaluate exposure to antineoplastic drugs in nurses.

Keywords: oxidative stress, nurse, antineoplastic drugs, biomarkers

1. INTRODUCTION

Antineoplastic drugs have been reported to induce oxidative stress as a mechanism of

toxicity. Free radicals (FRs) formed during this process interact with macromolecules to

induce lipid peroxidation (LPX), as well as oxidation of proteins and of puric and

pyrimidine bases of DNA. However, there is a group of antioxidant enzymes such as

39
superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and

glutathione reductase (GR) which inhibit oxyradical formation, thus aiding in the process of

detoxification of these substances in the body (Singh and Jialal 2006; Sohal 2002).

An increase in the levels of FRs has a long-term impact on formation of DNA adducts,

mutations and genetic alterations. Thus, the cumulative effects of FRs are involved in the

mechanisms of production of diverse pathologies including neurodegenerative diseases

such as Alzheimer’s and Parkinson’s, as well as chronic inflammatory disorders of the

gastrointestinal tract, diabetes, aging of the skin, asthma, acute tubular necrosis,

arteriosclerosis, hemolytic anemia, ischemia, cataracts, and neoplastic diseases (Ferri et al.

2008; Krzystek-Korpacka et al. 2008; Abdilla et al. 2007; Millar et al. 2007; Seal and

Gewertz 2005).

At present, only a relatively small number of antineoplastic drugs are used. It might

therefore be assumed that there is a lower risk of mistakes being made during their

preparation and handling than with other pathologies. However, this type of therapy is

highly complex. Antineoplastic drugs should be prepared in a biological safety cabinet

designed and operated to ensure protection of the product being handled as well as of

nurses and the environment. In all cases, health care workers should receive formal training

so that, besides being aware of the risk involved, they can minimize it with appropriate

work methods. Exposure of health professionals to this type of pharmaceuticals depends

not only on the number of preparations performed each day, but also on individual work

procedures as well as the precautions taken in handling these agents. The lack of a

centralized unit for formal training in the preparation and handling of antineoplastic

40
medications implies a lower level of protection against the potential toxicity of these

agents.

Diverse pathologies have been reported in nurses and pharmacy personnel who handle and

prepare antineoplastic drugs, among others, leukemia, impaired reproductive activity,

spontaneous abortion, genotoxicity, cytotoxicity, carcinogenicity, and lymphocyte DNA

damage (Marczak and Józwiak 2009; Rombaldi et al. 2009; Gan et al. 2008; Zhang et al.

2008; Ryhak et al. 2007; Scheibmeir et al. 2005; Turci et al. 2002; Mucci et al. 2000;

Valanis et al. 1999; Fuchs et al. 1995; McDiarmid and Egan 1988).

It is important to mention that health professionals in Mexico in charge of preparing and

handling antineoplastic drugs do not for the most part receive formal training nor are they

provided special areas equipped for handling these agents. Therefore, the goal of this study

was to evaluate oxidative stress in nurses occupationally exposed (OE) to the preparation

and handling of antineoplastic drugs in different hospitals in Mexico, and to determine if

occupational exposure is a potentially reliable early warning biomarker for toxicity

assessment in these health care professionals.

2. MATERIAL AND METHODS

2.1 Study population

The research protocol used complies with ethical principles in the Declaration of Helsinki

and was approved by the Ethics in Research Committee of the Centro Oncológico Estatal

ISSEMyM , the hospital where the project for the present study was submitted for

41
evaluation and to which nurses from the various hospitals and clinics participating in the

study were directed.

A multicentric study was carried out on nurses occupationally exposed to preparation and

handling of antineoplastic drugs and nurses unexposed to these conditions, who work in

different hospitals in the State of Mexico including the Centro Oncológico Estatal

ISSEMyM, DIF Children’s Hospital, Clinic 220 of the Instituto Mexicano del Seguro

Social (IMSS), and ISSEMyM Mother and Child Hospital in the city of Toluca, as well as

the IMSS Family Medicine Unit 231 in Metepec.

Sampling was non-probabilistic, opportunistic, sequential and by intact groups. The sample

size for each group was 30 individuals, taking into account nurses occupationally exposed

to antineoplastic drug preparation and handling and nurses unexposed to these conditions

for a total study population of 60 nurses.

Nurses evaluated were invited to participate in the study. They were informed of the

characteristics of the study and of the need to take a blood sample from each. Individuals

agreeing to take part in the study signed an informed consent letter and answered a

questionnaire on their lifestyle (age, place of residence, birthplace, sleep and rest habits,

diet, and physical activities) and employment history (years in an antineoplastic drug

preparation-related job, and use of protective equipment).

2.2 Study groups

Based on questionnaire responses, study participants were divided into two groups:

occupationally exposed (OE) and unexposed or control.

42
Nurses in the OE group were selected according to the following criteria: more than two

years in an antineoplastic drug preparation-related job and 25 to 35 years in age.

Individuals receiving medical treatment or who had chronic degenerative disease

(cardiovascular disease, hypertension, diabetes), were smokers or alcoholics, or were

receiving radiation treatment or chemotherapy were excluded from the study.

The control group was formed by nurses who did not come into contact with antineoplastic

agents, were similar in socioeconomic characteristics and age to OE participants, and

whose work activity did not involve the preparation or handling of antineoplastic drugs.

These volunteers were initially contacted at the Centro Oncológico Estatal ISSEMyM.

2.3 Sampling

Blood samples taken from study participants following a 12-h fast were obtained in two

collection tubes: one containing heparin as an anticoagulant and the other with EDTA for

use in hemoglobin determination. Samples were placed in an ice bath for transport to the

laboratory and immediate analysis. The following biomarkers were evaluated: LPX, protein

carbonyl content (PCC) in order to evaluate oxidized protein content, and activity of the

antioxidant enzymes SOD, CAT and GPx. Hemoglobin levels and total protein content

were used to express results.

43
2.4 Determination of oxidative stress status

2.4.1 Determination of LPX

LPX was determined by the Büege and Aust (1978) method which is based on

quantification of malondialdehyde (MDA), the end product of lipid peroxidation. To 500

µL blood was added Tris-HCl buffer pH 7.4 to attain a 1-mL volume, plus 2 mL TCA-TBA

reagent [15% trichloroacetic acid and 0.375% thiobarbituric acid (w/v)]. The sample was

heated to boiling for 45 min, allowed to cool and the precipitate removed by centrifugation

at 3,000 rpm for 5 min. Absorbance was read at 535 nm against a reagent blank. Results

were expressed as mmol MDA/g hemoglobin, and determination was made using a molar

extinction coefficient (MEC) of 1.56 x 105/mol/cm.

2.4.2 Determination of PCC

PCC was determined using the Levine et al. method (1994). Soluble proteins were obtained

by centrifugation of samples at 10,500 rpm for 30 min. To 100 µL of this supernatant was

added 150 µL of 10 mM dinitrophenylhydrazine in 2 M HCl (Sigma), prior to incubation at

room temperature for 1 h in the dark. Next, 500 µL of 20% TCA was added and the sample

was allowed to rest for 15 min at 4 °C. It was then centrifuged at 16,000 rpm for 5 min. The

bud was rinsed three times in 1:1 ethanol:ethyl acetate (Baker), dissolved in 150 µL of 6 M

guanidine (Sigma) pH 2.3, and incubated at 37 °C for 30 min. Absorbance was read at 366

nm and results were expressed as nmol of protein carbonyls (C=O) formed/g hemoglobin

based on the MEC of 21000/M/cm for these chemical groups.

44
2.4.3 Determination of SOD activity

SOD activity was determined by the modified Misra and Fridovich method (1972) which is

based on inhibition of adrenaline autoxidation at pH 10.2 in erythrocyte lysates free of

hemoglobin and other proteins. In a quartz cuvette were placed 150-μL aliquots of

homogenate (obtained from 500 μL total blood in 2 mL distilled water, sonicated for 15

min, then supplemented with 2.5 mL of 1:1 ethanol:chloroform). Addition was then made

of 750 μL of carbonate buffer solution pH 10.2 (50 mM sodium bicarbonate, 0.1 mM

EDTA, adjusted to pH 10.2 with Na2CO3 in powdered form) and 600 μL adrenaline (30

mM) in 0.05% acetic acid. Absorbance was read at 0 s, 30 s and 5 min, at 480 nm. Results

were expressed as µmol SOD/g hemoglobin. Estimates were derived by the formula [SOD]

= (A30s – A5min)* (A0/MEC), where the MEC of adrenaline is 21/M/cm.

2.4.4 Determination of CAT activity

CAT activity was quantified by the Radi et al. method (1991), which is based on

disappearance of H2O2 as a result of CAT action through change in absorbance per minute.

To 20 μL erythrocyte homogenate plus 1 mL of isolation buffer solution (0.3 M sucrose; 1

mM HEPES; 5 mM KH2PO4 adjusted to pH 7.4) was added 200 µL H2O2 (20 mM), reading

absorbance at 0 and 60 s, at 240 nm in quartz cuvettes. Results were expressed as µmol

H2O2/mg hemoglobin. Estimates were obtained using the formula [H2O2] = (A0s - A60s)/

MEC, where the MEC of H2O2 is 0.043/mM/cm.

45
2.4.5 Determination of GPx activity

GPx activity was determined by the Gunzler and Flohe-Clairborne method (1985). To 100

μL of supernatant was added 10 μL glutathione reductase (2 U glutathione reductase,

Sigma-Aldrich) plus 290 μL reaction buffer [50 mM K2HPO4 (Vetec), 50 mM KH2PO4

(Vetec) pH 7.0, 3.5 mM reduced glutathione (Sigma-Aldrich), 1 mM sodium azide (Sigma-

Aldrich) and 0.12 mM NADPH (Sigma-Aldrich)] and 100 µL H2O2 (0.8 mM, Vetec), prior

to reading absorbance at 340 nm at 0 and 60 s. Enzyme activity was estimated using the

equation: GPx concentration = (A0 - A60)/MEC), where the MEC of NADPH is 6.2

mM/cm. Results were expressed as mM NADPH/g hemoglobin.

2.4.6 Determination of total protein content

Total protein content was quantified by the Bradford method (1976). To 25 µL of sample

(blood or erythrocyte homogenate) was added distilled water until a 100-µL volume was

attained. Next, 2.5 mL was added of Bradford’s reagent (100 mg Coomassie Blue dye, 50

mL of 95% ethanol, 100 mL H2PO4) plus distilled water to attain a final volume of 1 L. The

sample was shaken and then allowed to rest for 5 min. Absorbance was read at 595 nm and

results were interpolated on a standard bovine serum albumin (BSA) curve at a

concentration range of 10 to 200 µg/mL.

2.4.7 Determination of hemoglobin

Hemoglobin was determined using a Beckman Coulter AcT Diff hematology analyzer.

46
2.5 Statistical analysis

Descriptive analysis was performed and measures of central tendency were determined,

subsequently testing the normality and homoscedasticity of the values obtained. To find

significant differences between study group variables, Kruskal-Wallis one-way analysis

was performed, followed by Dunn’s multiple comparisons test. The level of significance

was set at p ≤ 0.05.

3. RESULTS

3.1 General characteristics of the study population

The total number of OE individuals was 30; 100% were women, with a mean age of 32

years (range 25-35 years). Control group individuals numbered 30; 100% were women,

with a mean age of 34 years (range 25-35 years).

Mean time in an antineoplastic drug-related job for OE participants was 4 years (range 2-9

years), suggesting chronic exposure to a wide spectrum of antineoplastic medications

including cisplatin, etoposide, gemcitabine, doxorubicin, docetaxel, paclitaxel, vinorelbine

and carboplatin. As regards the use of protective equipment during work, 100% of OE

participants said they did not use face masks, gloves, surgical caps, protective eyewear or lab

coats.

Since none of the nurses in the OE group use protective equipment, they come in greater

contact with diverse antineoplastic agents via any one of the potential absorption routes

47
(dermal, inhalatory, digestive, or through the mucosa) which, combined with different

temperature gradients and lack of adequate ventilation, poses increased risks to their health.

It is worth noting that in the lifestyle questionnaire, 16 OE group nurses reported working a

second shift in private hospitals, where they performed similar activities but with fewer

safety measures.

The control group did not carry out any activities associated with antineoplastic drug

preparation or handling.

3.2 Oxidative stress markers

3.2.1 LPX determination

LPX results obtained in blood samples of the study population (Fig. 1) show a significant

increase (p ≤ 0.05) in the OE group (244.8%) compared to the control group.

3.2.2 PCC

PCC results (Fig. 2) in the OE group show a significant 215.9% increase compared to the

control group (p ≤ 0.05).

3.2.3 SOD activity

A marked increase in SOD activity was found in nurses in the OE group (176.4%)

compared to control group individuals (*p < 0.05) (Fig. 3).

48
3.2.4 CAT activity

A 170.5% increase in CAT activity occurred in the OE group with respect to the control

group (p < 0.05) and was statistically significant (Fig. 4).

3.2.5 GPx activity

GPx results (Fig. 5) in the group of OE nurses show a significant 371.3% increase

compared to the control group (p ≤ 0.05).

4. DISCUSSION

Results of the present study show increases in LPX and PCC in the group of nurses

occupationally exposed to the preparation and handing of antineoplastic drugs, with respect

to the control group (p < 0.05). Neoplastic disease studies reveal that treatment with

antineoplastic medications increases oxidative stress and reduces plasma levels of vitamins

C and E as well as of glutathione peroxidase. (25)

Diverse antineoplastic agents have been associated with oxidative stress. For example,

cisplatin induces formation of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria, eliciting

oxidative alterations in lipids, proteins and DNA of this organelle (Santadreu et al. 2010),

while doxorubicin-induced cytotoxicity has been associated with ROS production and in

particular to presence of the superoxide anion radical and of hydrogen peroxide (Deng et al.

2007; Wagner et al. 2005). This pharmaceutical is also able to produce reactive nitrogen

49
species (RNS) such as peroxynitrite (Stuehr et al. 2001). It is worth noting that both

medications are prepared, handled and administered by nursing personnel in hospitals

participating in the present study.

The increases in LPX and PCC found in our study may be explained by an increase in the

number of radical species produced by the biotransformation of antineoplastic drugs in OE

nurses, such as superoxide anion and hydrogen peroxide which are known to attach to

membrane lipids, inducing their lipid peroxidation. Similarly, increased peroxynitrite

concentrations may oxidize directly the prosthetic protein group or else react directly with

the peptide chain, leading to conformational and functional changes with severe biological

consequences for the individual (Denicola and Radi 2005).

Paradoxically, oxidative stress induced by oxidative metabolism of antineoplastic drugs

interferes with the tumoral growth produced in different types of cancer, since one of the

indicators of this process ̶ increased lipid peroxides ̶ favors the prolongation of cell

quiescence (G 0 phase). The problem lies in the fact that cytostatic or chemotherapeutic

agents act while malignant cells are in constant replication, not when they are quiescent

(Bernuzzi et al. 2009; Quiles et al 2002; Kimura et al. 2000; Gewirtz 1999).

Likewise, antioxidant capability has been reported to be greater in tumoral cells than in

normal cells (Gewirtz 1999), but this effect is surpassed by the oxidative stress induced by

antineoplastic agents. Short-lived cells or cells with higher renewal rates which are

constantly being regenerated are the most affected, in addition to the fact that there are

other undesirable effects associated with FR generation, such as doxorubicin-induced

cardiac toxicity (rapid heartbeat, heart failure), bleomycin-induced pulmonary fibrosis and

50
cisplatin-induced ototoxicity (Lu and Cederbaum 2005; Lu et al. 2005; Sugihara and

Gemha 1986).

During a person’s lifetime, a sophisticated antioxidant network counteracts the deleterious

action of ROS on macromolecules (Tilman 2005). Cells synthesize some of their own

antioxidants, as do also SOD, CAT and GPx as well as peptides with thiol groups, such as

glutathione (GSH) and the thioredoxin (TRX) family. These systems play a major role in

the ability of the body to respond to the oxidative challenge of using molecular oxygen to

drive reactions that yield the necessary energy.

Increased ROS production is known to be associated with increases in antioxidant enzyme

activity. A marked increase in SOD activity occurred in our study in the OE group

(176.4%) compared to the control group (*p < 0.05) (Fig. 3). Comparison of CAT activity

results between study groups found a 170.5% increase of this activity in the OE group,

which differed significantly from activity in the control group (p < 0.05) (Fig. 4). Finally,

GPx results (Fig. 5) in the OE group showed a significant 371.3% increase compared to the

control group (p ≤ 0.05).

SOD is the first mechanism of antioxidant defense and the main enzyme responsible for

offsetting toxic effects induced by the presence of ROS, particularly the superoxide ion,

which is formed as a minor product of mitochondrial respiration. Increased SOD activity in

our study may be explained by high levels of the superoxide anion radical, which can

stimulate this activity. It is well known that the enzyme SOD is known to transform O2* to

H2O2.

51
Subsequently, the enzyme CAT takes part in the catalytic reaction that decomposes two

molecules of the hydrogen peroxide ̶ formed by dismutation of superoxide ̶ into water

and oxygen, without the use of cofactors. This function is shared with GPx which uses

GSH as a reducing agent (Newman and Unger 2003).

The increase in CAT and GPx may be due to higher levels of hydrogen peroxide, since the

oxidative metabolism of pharmaceutical agents such as doxorubicin, to which nurses in our

study were exposed, is known to increase the levels of peroxide, which is a specific

substrate of GPx.

5. CONCLUSIONS

Nurses occupationally exposed to preparation and handling of antineoplastic drugs are at

potential risk of increasing their levels of oxidative stress by not taking preventive and

protective measures. Determination of a set of oxidative stress biomarkers is important for

early detection of their toxic effects in order to prevent health damage in the exposed

population.

ACKNOWLEDGMENTS

This study was made possible by financial support provided by the Research and Advanced

Studies Division of the Universidad Autónoma del Estado de México (UAEM, project

3086/2011).

52
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58
 Figure captions

Figure 1 LPX in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug preparation.

The mean for the total number of individuals in each study group is shown. Error bars

indicate standard deviation. *Significantly different from the control group at p ≤

0.05.

59
Figure 2 PCC in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug preparation.

The mean for the total number of individuals in each study group is shown. Error bars

indicate standard deviation. *Significantly different from the control group at p ≤

0.05.

60
Figure 3 SOD activity in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug

preparation. The mean for the total number of individuals in each study group is

shown. Error bars indicate standard deviation. *Significantly different from the

control group at p ≤ 0.05.

61
Figure 4 CAT activity in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug

preparation. The mean for the total number of individuals in each study group is

shown. Error bars indicate standard deviation. *Significantly different from the

control group at p ≤ 0.05.

62
Figure 5 GPx activity in nurses occupationally exposed to antineoplastic drug

preparation. The mean for the total number of individuals in each study group is

shown. Error bars indicate standard deviation. *Significantly different from the

control group at p ≤ 0.05.

63
 3. Conclusiones

El personal de enfermería ocupacionalmente expuesto a la preparación y manejo de

medicamentos antineoplásicos están en un riego potencial en el incremento de sus niveles de
estrés oxidativo por no tener las medidas preventivas y de protección necesarias.

La determinación de una batería de Biomarcadores de estrés oxidativo es importante para la

detección temprana de los efectos tóxicos para prevenir daño a la salud en el personal
expuesto.

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