TEMA 18

INGENIERÍA GENÉTICA
 1. TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN DEL ADN

La ingeniería genética consiste en la manipulación

artificial y deliberada del genoma de un ser vivo
para modificar su ADN.
1. Hibridación de ácidos nucleicos
2. Reacción en cadena de la polimerasa PCR
3. Métodos de secuenciación del ADN:
1. Sanger
2. Secuenciación masiva
4. Proyecto Genoma Humano
5. Mutagénesis dirigida
6. Tecnología del ADN recombinante
1. Formación de moléculas de ADN recombinante.
2. Corte fragmentos de ADN
3. Separación de los fragmentos de ADN
4. Unión al vector
5. Introducción en un organismo hospedador
7. Aplicaciones: terapia génica y clonación
 Hibridación de ácidos nucleicos
 Basadas en la capacidad de
apareamiento entre secuencias
complementarias de cadenas de
ácidos nucleicos. A mayor grado
homología entre dos cadenas,
mayor porcentaje de hibridación.
 Se pueden llevar a cabo dos tipos de
hibridación:
 • Hibridación ADN-ADN.
Transferencia de tipo Southern.
 • Hibridación ADN-ARN. La sonda es
una molécula de ARN, que puede
ser un ARNm. Transferencia de tipo
Northern.
NORTHERN BLOT
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA:
PCR

La PCR (polymerase chain reaction) permite obtener múltiples

copias de un fragmento determinado de ADN.

La secuencia de la PCR es:

1. Separación de una molécula de ADNbc en dos moléculas de
ADN monocatenario complementarias de la doble hélice.
2. Una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP).
3. Cebadores: fragmentos de ADN monocatenario cuya
secuencia de bases es complementaria a cada uno de los
extremos de la cadena molde.
4. DNA polimerasa
 1. Secuenciación de ácidos nucleicos:
Método de Sanger

•Se separa el ADN bc que se quiere secuenciar dos hebras

monocatenarias. Como molde se utiliza una hebra sencilla de
ADN, a la que se une un cebador y se añaden ADN
polimerasa y los cuatro desoxirribonucleósidos trifostato
normales (dNTP) y otros modificados (ddNTP), que carecen del
extremo 3'-hidroxilo (detienen la síntesis).
La reacción se lleva a cabo en cuatro recipientes diferentes,
añadiendo en cada uno un ddNTP marcado
(radiactivamente). En cada mezcla de incubación se
obtienen fragmentos de longitud variable, dependiendo de
las posiciones en las que se haya incorporado un ddNTP.
Hood modificó el método añadiendo ddNTPs fluorescentes por
lo que se pudo utilizar una mezcla única y se automatizó el
proceso.
Métodos de secuenciación masiva

Permite la secuenciación de genomas completos o de

conjuntos de genomas de una comunidad. Etapas :
1. Fragmentación al azar de todo el genoma (ADN) y
clonación de los fragmentos en plásmidos. Se obtiene así
una genoteca.

2. Secuenciación de los fragmentos en secuenciadores

automáticos, utilizando cebadores que se marcan con
diferentes colorantes fluorescentes (diseñados para las
zonas del plásmido adyacentes al lugar de inserción

3. Alineación de las diferentes secuencias, que se comparan

utilizando programas informáticos y corrección y revisión de la
secuencia.
Proyecto Genoma humano

Gracias a la secuenciación masiva se pudo secuenciar todo el

genoma humano
1999; Secuencia completa del cromosoma 22
2004 genoma completo humano:
• Datos interesantes obtenidos: tan solo 20% del genoma es
codificante, el 90% desempeña una función bastante
desconocida.
 DATOS DERIVADOS DEL
PROYECTO GENOMA HUMANO
 El ADN está formado por 3000 millones de pares de bases
distribuidas en 23 cromosomas de forma proporcional a su
tamaño
 El genoma humano contiene aproximadamente 20.000
genes que codifican proteínas
 Los genomas de dos personas solo se diferencian en el 0,1%
de sus nucleótidos
 Entre los genomas de dos individuos la principal fuente de
variabilidad son los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
o variantes de una única base en una secuencia de ADN
 Los exones ocupan únicamente el 1,1% del genoma, los
intrones el 24%
 A nivel científico se ha conseguido identificar y secuenciar
muchos genes causantes de enfermedades humanas.
 A nivel social, la genética humana tiene repercusiones en
campos como el derecho, la psicología, la sociología…
 Genómica: conjunto de ciencias y de
tecnologías (biología molecular, bioquímica,
informática..) dedicadas al estudio integral de
la secuenciación y el funcionamiento de los
genomas.

 Proteómica: es el conjunto de ciencias y

tecnologías que estudian el conjunto de
proteínas que se expresan a partir de un
genoma.
 MUTAGENESIS DIRIGIDA
Se pueden provocar cambios en la secuencia de nucleótidos de un
gen mediante mutagénesis dirigida, y de este modo obtener
proteínas modificadas en aminoácidos concretos de su secuencia.
OBJETIVO: conocer su función por ausencia de esta
Para realizar una mutagénesis dirigida se utiliza un oligonucleótido
sintético que contiene la secuencia mutada de interés.

n alterado

gen diana

ADN polímera» transform acton

T CT'oCG riHR dGTft
y donación
oUgonuckúHw
dCIRdTTP
sintético
con LTiñ bU4
 Tecnología de ADN
recombinante.
Consiste en introducir un gen exógeno en el genoma de un
organismo.

Fases:

1. Aislar y obtener el gen de interés a estudiar. Ej: PCR

2. Selección del vector de clonación (donde se va a colocar
ese gen exógeno). Ej: plásmido bacteriano o DNA viral.
3. Insertar el gen de interés en el vector de clonación. Se
forma un ADN recombinante. Se utilizan enzimas de
restricción y ligasas.
4. Inclusión del ADN recombinante con el gen exógeno
dentro de una célula hospedadora.
5. Selección de las células clonadas y expresión de los genes
exógenos en el organismo hospedador.
 Fragmento de ADN /XXXXXXXJOCOOCÍXXXXXXXXXXXXXXV

Fragmentación del ADN con

enzimas de restricción

Plásmido

Formación con ADN ligasa

de una molécula de ADN
recombinante
Aislamiento y corte del
plásmido con la misma
enzima de restricción
Selección del clon deseado y
producción de células

Replicación

Introducción en la célula huésped

Formación de moléculas de ADN recombinante.
1. Corte fragmentos de ADN
2. Separación de los fragmentos de ADN
3. Unión al vector
Corte de fragmentos de ADN: Endonucleasas de restricción
Las endonucleasas de restricción son un tipo de enzimas que
reconocen secuencias específicas del ADN y producen cortes
dentro de las mismas, creando extremos romos o
complementarios.

Nos sirven para extraer el gen de interés y para cortar el vector

final donde lo queremos introducir.
Formación de moléculas de ADN recombinante.
1. Corte fragmentos de ADN
2. Separación de los fragmentos de ADN

2. Separación de los fragmentos de ADN

Separación de los fragmentos de ADN en función de su
masa al aplicarles un campo eléctrico.
Electroforesis en gel de agarosa (nucleótidos).
 1. Formación de moléculas de ADN recombinante.
1. Corte fragmentos de ADN
2. Separación de los fragmentos de ADN
3. Unión al vector

3. Unión al vector
Vectores de clonación: plásmidos,
virus, cromosomas bacterianos
artificiales
Los vectores de clonación son
pequeñas moléculas de ADN
que tienen capacidad para
autorreplicarse dentro de las
células hospedadoras,
independientemente del
cromosoma o cromosomas
principales.
Los vectores de clonación
se tratan con la misma
endonucleasa de
restricción que el
fragmento de ADN
recombinante. Los
extremos de ambos
pueden aparearse y unirse
mediante la enzima ADN
ligasa. Con endonucleasas
de restricción que
producen extremos romos,
pueden unirse la unión se
produce mediante
adaptadores específicos.
Introducción en un organismo hospedador:
CLONACIÓN
El ADN recombinante se introduce en una célula
hospedadora, la cual proporciona la maquinaria necesaria
para la replicación de las moléculas recombinantes.

Requisitos de la célula hospedadora:

• Crecimiento rápido
• No ser patógenas o peligrosas
• Ser capaces de captar moléculas de ADN del medio
externo e incorporarlas a la célula

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Selección de las células clonadas. Clonación en células
procariotas
• Los genes clonados pueden proceder de otra bacteria y
expresarse en la bacteria hospedadora, pues la maquinaria de
transcripción y traducción es semejante.
• Las células clonadas pueden detectarse por genes marcadores
del vector de clonación o mediante una sonda radiactiva de
ADN complementaria de una de las hebras de ADN del gen
clonado.
• Cuando se emplean bacterias como células hospedadoras
para clonar genes eucariotas, los vectores de clonación deben
contener las secuencias reguladoras de transcripción y
traducción adecuadas para la expresión génica en procariotas.
Estos vectores se llaman vectores de expresión.
Clonación en células eucariotas
• Genomas de virus. El genoma del virus se modifica artificialmente, para eliminar los
genes de virulencia y introduce el gen que se desea clonar.

• Cromosomas artificiales de levadura, YAC (yeast artificial chromosomes) son

moléculas de ADN recombinante que poseen todas las características necesarias
para mantenerse de forma estable en el núcleo de la levadura y comportarse como
un cromosoma más.
• Clonación en células vegetales de plásmidos Ti modificados de Agrobacterium
tumefaciens.
• Introducción en las células recombinantes,
mediante diferentes técnicas: electroporación, microinyección, pistolas de genes,
liposomas con ADN foráneo.
APLICACIONES. INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA

 Estudios evolutivos. Detección de genes de microorganismos no

cultivable y aplicación a estudios filogenéticos.
 • Estudios históricos y arqueológicos. Datación, detección de
enfermedades de origen genético o infecciosos en restos fósiles.
 • Huellas dactilares de ADN. Comparación de muestras de ADN para
la identificación de relaciones de parentesco y aplicación a la
medicina forense.
 • Obtención de productos de interés sanitario (insulina, vacunas
recombinantes (Hepatitis B) hormonas , interferón, etc)

 • Diagnóstico de enfermedades genéticas: distrofia muscular

Duchenne, fibrosis quística.

 Terapia génica. Introducción de fragmentos génicos en seres humanos

que los tienen defectuosos con fines terapéuticos, ej: enfermedades
neurodegenerativas y cáncer.
APLICACIONES. INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA

 Organismos transgénicos: organismos vivos que llevan en su genoma

genes extraños introducidos artificialmente y que no proceden por
herencia. Ej: investigación biomédica (vacunas), producción de
proteínas humanas y medicamentos (insulina), factor coagulación VIII
(leche ovejas)
 La clonación de seres vivos permite obtener organismos
genéticamente idénticos entre sí, es decir, morfológica y
fisiológicamente idénticos. Se pueden conseguir animales clónicos por
dos vías diferentes:

1-Por disgregación de células
embrionarias.

2-Por transferencia del núcleo desde

una célula embrionaria a un
ovocito al que se ha extraído el
núcleo.
APLICACIONES. INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA

Aplicaciones en agricultura:

• Tomates MacGregor: mejor sabor y se almacenan

más tiempo (ver video de los tomates transgénicos
de Joaquin Reyes)
• Arroz dorado: provitamina A
• Maiz Bt: proteína tóxica que mata los insectos
 EJERCICIOS PAU RELACIONADOS
BIOTECNOLOGIA

En relación con la Biotecnología:

a) Defina Ingeniería genética (0,5 puntos).
b) Defina organismo transgénico (0,5 puntos).
c) Explique brevemente el proceso de introducción de un fragmento de ADN
en un vector durante la formación de moléculas recombinantes (1 punto).

Referente a la Ingeniería Genética:

a) Explique qué es un ADN recombinante y cuál es la función de las enzimas de
restricción (0,5 puntos).
b) Indique las etapas necesarias para producir clonación génica (1 punto).
c) ¿Qué es una planta transgénica? Cite una de sus aplicaciones (0,5 puntos).
En relación con la Ingeniería Genética:
a) ¿Qué es una molécula de ADN recombinante?, ¿qué es un plásmido
bacteriano? Explique con qué finalidad se introduce una molécula de ADN
recombinante fabricada "in vitro" dentro de un organismo huésped (por ejemplo
E. coli) (0,75 puntos).
b) Indique los pasos necesarios para construir "in vitro" una molécula de ADN
recombinante (0,5 puntos).
c) Explique qué es un organismo transgénico y cite dos aplicaciones de la
ingeniería genética (0,75 puntos).