Departamento de Química

Unidad VIII.
Tecnología del ADN
recombinante
IBQ 5°A
Profesor: M en C. María Fernanda Prado Fernández

1
Recombinación
del ADN
Recombinación del ADN
• El intercambio de información genética entre cromosomas ocurre en
una variedad de organismos y bajo diversas circunstancias

• A nivel molecular, esto implica intercambiar segmentos de moléculas

de ADN mediante un mecanismo conocido como recombinación
Recombinación del ADN
• En todos los casos de recombinación, dos
moléculas de ADN se rompen y se vuelven
a unir formando un cruce

• Un único cruce suele formar moléculas de

ADN híbridas de corta duración. Si se
producen dos cruces, el segmento de
ADN entre ellos se transferirá de una
molécula de ADN a la otra. Esto es
recombinación.
Recombinación del ADN
• La tecnología de ADN recombinante, también conocida como
ingeniería genética, es el conjunto de técnicas que permiten localizar,
aislar, preparar y estudiar segmentos de ADN

• Esta tecnología ha abierto una amplia gama de posibilidades en

diversas disciplinas, desde la agricultura, medicina, ecología, ciencias
forenses, evolución, entre otras
Clonación del
ADN
Clonación del ADN
• La clonación del ADN se refiere a los procedimientos para separar un
segmento específico de ADN, insertarlo en una pequeña molécula y
replicar esta ADN recombinante miles o millones de veces, resultando
en la amplificación selectiva de una porción de ADN
Clonación del ADN
• Los pasos para una clonación son:
• 1. Cortar el ADN en sitios específicos.
• 2. Unir dos fragmentos de ADN, provenientes de distintos orígenes
(ADN recombinante).
• 3. Seleccionar una pequeña molécula de ADN capaz de auto-
replicarse.
• 4. Transferir esta molécula de ADN recombinante a una célula, la
cual proveerá de la batería enzimática necesaria para llevar a
cabo la replicación del ADN.
• 5. Seleccionar o identificar a las células hospederas que contienen
ADN recombinante.
Clonación del ADN
Puede ser
obtenido de
PCR
Clonación del ADN
Clonación del ADN
Clonación del ADN:
Clonación del ADN
Proteínas recombinantes
Productos (hormona del crecimiento
biofarmacéuticos: humana, y el activador tisular
del plasminógeno (tPA))

Intenta proporcionar una copia

Terapia génica: normal del gen a las células del
cuerpo del paciente

Usos de la clonación
de ADN Crear versiones recombinantes
artificiales de genes que les
Análisis genético e ayudan a entender cómo
investigación: funcionan los genes normales
de un organismo

Actualmente usado en plantas

para mejorar sus características
Transformación (resistentes a plagas, crecen
genética: más u obtención de productos
de interes)
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN

Las nucleasas son enzimas

que degradan o cortan el
ADN en sitios específicos. Hay
dos tipos:

Endonucleasas:
Exonucleasas:
cortan en
cortan en los
secciones
extremos
internas
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN
• Endonucleasas o enzimas de restricción: se encuentran de manera
natural en bacterias, y su fin es degradar ADN extraño que ingrese a la
célula bacteriana; así pues, son un sistema de defensa. Hay tres tipos
de endonucleasas:

•I
• II
• III
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN
Endonucleasas tipo I y tipo III
• Tipo I: Reconocen secuencias específicas, y cortan en
sitios aleatorios a más de 1000 pb del sitio de restricción

• Tipo III: Reconocen secuencias específicas, y cortan en

sitios adyacentes al sitio de restricción (a menos de
25pb)

• Ambas son grandes enzimas que requieren de ATP

Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN

Endonucleasas tipo II

•Reconocen secuencias específicas de

entre 4 y 8 pb, y realizan cortes dentro de
la propia secuencia reconocida. Son más
pequeñas y simples que las tipo I y III, y no
requieren de ATP.
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN
• Endonucleasas tipo II
• Los cortes pueden producir extremos:
• ROMOS: corte a la misma altura en
ambas hebras, y los extremos tienen
bases apareadas.

• COHESIVOS: corte en cada una de las

cadenas en posiciones distintas, donde
los extremos tienen bases no
apareadas, que fácilmente se unen
con otras moléculas de ADN cortadas
con la misma enzima.
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN
• A las secuencias reconocidas por las endonucleasas se les
llama sitios de restricción. Muchas de estas secuencias son
palindrómicas

• Las enzimas de restricción se nombran con la primera letra

del género y las dos primeras letras de la bacteria de la que
son aisladas, y los números romanos indican el orden en que
fueron descubiertas.
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN
Enzimas de restricción y digestión enzimática
de una muestra de ADN
Vectores de clonación
• Se trata de moléculas de ADN de tamaño relativamente pequeño, que
son capaces de recibir ADN extraño; luego son introducidas a las
células apropiadas y se replican, generando al mismo tiempo copias
del ADN foráneo.

• Plásmidos
• Bacteriófagos
• Cósmidos
• Cromosomas bacterianos artificiales (BAC´s)
• Cromosomas de levadura articiales (YAC´s)
Vectores de clonación
• Plásmidos
• Segmentos de ADN circular, bicatenario de replicación autónoma,
presentes en bacterias de manera natural, así como en levaduras y en
algunas células eucariontes.
• Los más comunes son los provenientes de E. coli

Algunos han sido modificados

para hacerlos más eficientes y
fáciles de manipular, en términos
de ing. genética. A estos se les ha
llamado plásmidos artificiales
Vectores de clonación
• Características de los plásmidos

• Tamaño relativamente pequeño, de alrededor de 3kb (más

pequeños que los plásmidos presentes de manera natural).
• Un ORI que permita la replicación del plásmido.
• Un poli-linker, el cual es un sitio que contiene varias secuencias de
restricción contiguas para diferentes endonucleasas.
• Un gen de selección, que permita distinguir entre células
hospederas que contienen al plásmido, de aquellas que no lo
presentan.
• Aceptan insertos de hasta 20 kb
• Son los más usados en transformación genética
Vectores de clonación
• Características de los plásmidos
• Para el gen de selección:
• Genes marcadores: los más comunes son los de resistencia a
antibióticos, como el gen amp que codifica para la enzima β-
lactamasa, la cual inactiva a la ampicilina.

• Genes reporteros: suelen brindar

colores a las células
portadoras del plásmido
(por ejemplo, el gen de la
proteína verde fluorescente gfp)
Vectores de clonación

pBR322
Primer vector de clonación
artificial creado en el laboratorio
por Francisco Bolívar y Raymond
L. Rodríguez.
Vectores de clonación

pUC19
Diseñado por Joachim Messing y
sus colaboradores. La
designación "pUC" se deriva del
prefijo clásico "p" (que denota
"plásmido") y la abreviatura de
la Universidad de California
Vectores de clonación
• Bacteriófagos
Vectores de clonación
• Bacteriófagos
• El más utilizado es el bacteriófago λ (lambda)

• En ingeniería genética se remueven genes involucrados

con la lisis, y se conservan las regiones para el ensamblaje
de la partícula viral.

• Los genes removidos son sustituidos por ADN de interés, y

este ADN recombinante forma partículas virales
completas, capaces de infectar células bacterianas.

• Acepta insertos de hasta 25 kb.

Vectores de clonación
• Bacteriófagos

• El bacteriófago λ posee dos secuencias

de 12 nucleótidos en sus extremos,
denominadas COS

• Estás son removidas para colocar el ADN

de interés
Vectores de clonación
• Cósmidos
• Combinación del plásmido y el bacteriófago
• Se produce al insertar la secuencia COS de un
fago en un plásmido de 5 kb.

• Estas partículas no expresan proteínas del

fago, por lo tanto no lisan, sino que
permanecen como plásmidos

• Aceptan insertos de hasta 45 kb.

• Son útiles para construir bibliotecas genómicas
y estudiar genes
Vectores de
clonación
• Cósmidos
Vectores de clonación
• Cromosomas bacterianos artificiales
(BAC´s)
• Se derivan del plásmido F de E. coli
• En una célula bacteriana solo puede haber uno
o dos BAC’s

• Aceptan insertos de gran tamaño (hasta 300kb)

• Se utilizaron en el Proyecto Genoma Humano
para la secuenciación del ADN

• Puede insertarse en células procariotas y

eucariotas pero solo mediante electroporación
Vectores de clonación
• Cromosomas de levadura articiales (YAC´s)
• Contienen todos los elementos necesarios para el funcionamiento de
un cromosoma eucarionte

• Imita las características de un cromosoma eucarionte

• Contiene telómeros y cetrómeros

• Se pueden insertar y replicar en células de levadura. Aceptan insertos

de hasta 1000 kb

• Se utiliza para la manipulación genética en eucariontes y construcción

de bibliotecas genómicas
Vectores de clonación
• Cromosomas de levadura
articiales (YAC´s)
 Aislamiento e
identificación de
genes
Bibliotecas genómicas o genoteca
• Población de vectores que contienen todo el genoma de un organismo.
El objetivo es contener todo el ADN del individuo de una especie, pero
fragmentado en segmentos cortos que faciliten su estudio y
manipulación.
2. Digestión del 3. Ligar los
1. Aislamiento y
ADN (tamaño fragmentos de ADN
purificación del
depende del con el vector de
ADN
vector) clonación

4. Introducir el vector de
clonación en la célula
hospedera adecuada (el
más utilizado es el fago λ).
Bancos de ADN complementario
• Algunas veces no es conveniente generar genotecas a partir de ADN
genómico, por ejemplo, cuando se desea aislar un gen en un organismo
con grandes cantidades de ADN no codificante
• En este caso, se generan bibliotecas de ADN complementario (cDNA)
Técnicas de identificación de genes:

Hibridación con sondas

Electroforesis
Northern blot
Southern blot
Western blot
ELISA
Técnicas de
identificación de genes:
• Hibridación con sondas o
hibridación in situ

• Son fragmentos de ADN o ARN

marcados radioactivamente o de
manera fluorescente que, por
apareamiento de bases, detectan
un fragmento de ADN o ARN

• Usa anticuerpos en el caso de

fluoresencia

• Se realiza en el mismo tejido

Técnicas de identificación de genes:

• Electroforesis
Técnicas de identificación de genes:
• Southern blot
• Edward Southern inventó esta técnica en los años 70’s, y sirve para
detectar fragmentos específicos de ADN.

• Se hace una extracción y digestión de ADN, después se corre una

electroforesis en gel en agarosa

• Las bandas se transfieren a un filtro de nitrocelulosa; este es

expuesto a una sonda radioactiva, que puede ser un fragmento
de ADN o ARN complementario al gen que se busca.

• Posteriormente se realiza una autorradiografía en la que se pueden

observar la banda o bandas complementarias a la sonda.
Técnicas de identificación de genes:
• Southern
blot
Técnicas de identificación de genes:
• Northern blot

• En lugar de detectar ADN detecta fragmentos específicos de ARN.

• El Southern blot permite identificar al gen que porta un organismo

• El Northern blot permite monitorear su expresión en tiempo (ej.

etapa del desarrollo de un organismo), circunstancias (ej. genes
expresados en respuesta a algún estímulo ambiental) o sitio (ej.
órgano específico donde se expresa el gen).
Técnicas de identificación de genes:
• Northern blot
Técnicas de identificación de genes:
• Western blot
• Sirve para detectar proteínas, y en lugar de sondas radioactivas se
utilizan anticuerpos (inmunoblotting)
• Se realiza una electroforesis de proteínas y se transfiere a un filtro de
nitrocelulosa.
• La membrana se bloquea con alguna proteína no relacionada con la
buscada; luego es incubada con el primer anticuerpo, el cual debe
unirse de manera específica con la proteína buscada.
• Se realiza otra incubación con un segundo anticuerpo, el cual
reconoce al primer anticuerpo y está conjugado con una enzima.
• Al incubar la membrana con un sustrato apropiado para la enzima
que forme un producto colorido, es posible identificar la banda
donde se encuentra la proteína deseada.
Técnicas de identificación de genes:
• Western blot
Técnicas de identificación de genes:
• Western blot
Técnicas de identificación de genes:
• ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
• Permite la identificación y cuantificación rápida de un antígeno en
una muestra.
• 1. Las proteínas de la muestra son adsorbidas en una superficie
inerte.
• 2. La superficie es bloqueada con una solución de proteínas
inespecíficas.
• 3. Incubación con el primer Ab; se lava para quitar el exceso de Ab
no adherido.
• 4. Incubación con el segundo Ab; se lava para quitarel exceso de
Ab.
• 5. Incubación con el sustrato; se forma un producto colorido, cuya
intensidad es proporcional a la concentración de la proteína.
Técnicas de identificación de genes:
• ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Técnicas de identificación de genes:
• PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

• Técnica inventada por Kary Mullis en 1985 que permite amplificar in vitro
un fragmento específico de ADN miles o millones de veces, incluso sin
que la fuente de ADN sea sometida a endonucleasas

• Es sumamente sensible; cada ciclo de amplificación duplica la cantidad

de moléculas de la secuencia de interés, y después de 20 ó 30 ciclos se
tienen cerca de un millón de copias.

• Cada ciclo toma aproximadamente 5 minutos, así que en pocas horas es

posible obtener una enorme cantidad de copias.
PCR

• Templado o ADN

• Primers (cebadores,
Para efectuar oligonucleótidos).

una PCR se • Deoxirribonucleótidos.

requiere:
• ADN polimerasa.

• Buffer que contenga Mg.

PCR
• Templado. ADN en el que se busca una secuencia específica
• Para ello se hace la extracción de ADN
PCR
• Primers (cebadores, oligonucleótidos). Pequeños fragmentos
de ADN complementarios a los dos extremos de la secuencia
blanco.
PCR
• Deoxirribonucleótidos. Bloques para ensamblar las copias de
ADN.
PCR
• ADN polimerasa.

• Actualmente se utilizan polimerasas

termoestables, especialmente la Taq
polimerasa, proveniente de la bacteria
termófila Thermus aquaticus.

• Esta polimerasa permanece estable, sin

desnaturalizarse, a temperaturas por
encima de los 100°C, y desarrolla su
actividad óptima alrededor de los 72°C.
PCR
• Buffer que contenga Mg+2. El Mg2 es cofactor de la ADN
polimerasa; si no está disponible, la enzima no es funcional.
PCR
PCR
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• Rasgos polimórficos

• Características que difieren entre individuos de la misma

especie.

• Pueden ser morfológicos (ej. color, tamaño o forma de una

estructura) o genéticos (regiones variables del ADN,
generadas por mutaciones).
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• Rasgos polimórficos

• Muchos rasgos polimórficos se presentan en ADN no codificante. Esto

hace que muchos rasgos polimórficos sean indetectables incluso por
análisis de expresión de proteínas, lo que hace necesario el análisis
directo del ADN

• Por otra parte, al tratarse de mutaciones silenciosas no repercuten en

la supervivencia de los organismos, así que tienden a acumularse
generación tras generación

• Estos cambios permiten identificar especies, cepas, híbridos,

establecer paternidad, etc.
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• RFLP’s (Restriction Fragment Length Polimorphism o Fragmentos de
restricción de longitud polimórfica )
• Mediante esta técnica los organismos pueden ser diferenciados por el
análisis de los patrones de bandas obtenidos de la digestión de su
ADN.
• Si dos organismos muestran polimorfismo en los sitios de clivaje para
una endonucleasa particular, la longitud de los fragmentos será
distinta.
• Para efectuar un RFLP se aisla el ADN de un organismo, se digiere con
una o más enzimas de restricción, realizar una electroforesis y Southern
blot.
• Se puede utilizar PCR para amplificar la cantidad de ADN, y en pocas
horas se puede tener suficiente material para realizar el RFLP.
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• RFLP’s
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• RFLP’s
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• RFLP’s
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• AFLP’s (Amplified Fragment Length Polimorphism o Polimorfismos en la
longitud de fragmentos amplificados)

• Combinación de los métodos de la PCR y análisis de los fragmentos

de restricción:
• 1. Se realiza una digestión parcial del genoma con dos enzimas de
restricción.
• 2. Los extremos de los fragmentos así obtenidos se unen a secuencias
de nucleótidos llamadas adaptadores.
• 3. Los fragmentos son sometidos a PCR.
• 4. Se realiza una electroforesis para observar el patrón de bandas
generado.
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• AFLP’s
• Se utilizan para analizar
pedigríes, tipificación
forense, análisis de
paternidad, medición de
variabilidad genética
entre diferentes
poblaciones, tipificación
microbiana, entre otros.
Aplicaciones de la PCR (marcadores moleculares)
• RAPDs(Random Amlified Polimorphic DNA o Amplificación aleatoria
de ADN polimórfico)

• Consiste en la amplificación por PCR de ADN genómico utilizando

primers arbitrarios

• Los primers son más cortos de

los usados habitualmente
(10 nucléotidos).

• Es muy útil para estudiar la

diversidad genética de una
colección.
Transformación
genética
Transformación genética
• Consiste en la introducción y expresión de ADN foráneo
dentro de una célula.

• Hay una gran cantidad de técnicas, y la elección de una de

ellas depende en gran medida del organismo a transformar.

• Se utilizan con el fin de obtener una respuesta específica

(fitomejoramiento, terapia génica, etc.).
Métodos físicos
Choque térmico

Electroporación

Microinyección

Lipofección

Biobalística
Métodos físicos
• Choque térmico

• Someter a las células bacterianas a altas concentraciones de CaCl2 y a

cambios bruscos de temperatura

• Se generan pequeños poros transitorios en la membrana, por los cuales

entran los plásmidos

• Aunque la eficiencia de transformación es

baja (1 de cada 10,000 células), las pocas
bacterias transformadas pueden generar un
gran número de individuos

• No requiere equipo especial y su costo es bajo

Métodos físicos
• Electroporación

• Aplicar una descarga eléctrica por algunos milisegundos a las

células. Esto provoca la apertura transitoria de pequeños poros por
los que entran los vectores de clonación/transformación.
• Se utiliza para introducir plásmidos y BAC’S a bacterias
Métodos físicos
• Microinyección

• El ADN foráneo se inyecta

directamente dentro del
núcleo de la célula
eucarionte

• Se utiliza para transformar

células vegetales y animales

• En el caso de estas últimas,

usualmente la microinyección
se practica en embriones.
Métodos físicos
• Lipofección

• Se generan liposomas constituidos por lípidos catiónicos sintéticos,

dentro de los cuales se encuentra el ADN correspondiente al
transgén

• Los liposomas pueden fusionarse con las membranas celulares y así

liberar el ADN directamente al interior de la célula.
 Métodos físicos
• Biobalística

• Pequeñas partículas de tungsteno, u

oro son recubiertas con ADN, y
disparadas al tejido a transformar

• Muchas células sufren daños

irreparables, pero en algunas los
proyectiles llegan al núcleo, donde el
ADN exógeno es depositado y luego
puede ser insertado en el genoma de
la célula hospedera

• Muy efectiva pero costosa

Métodos biológicos

Transformación mediada
Virus
por Agrobacterium

A. A.
tumefaciens rhizogenes
Métodos biológicos
• Virus
• Algunos virus son utilizados para
insertar transgenes dentro de células
hospederas, aprovechando su
mecanismo natural de infección.
• El proceso se efectúa tanto en
bacterias como en eucariontes
• Se remueven los genes de
infección, y se conservan los
necesarios para el ensamblaje de la
partícula viral y la inserción de ADN
viral en el genoma hospedero,
además de los transgenes de interés
que se desea insertar.
Métodos biológicos
• Transformación mediada por A.
tumefaciens

• Causa la enfermedad conocida como

agalla de la corona. Los genes que
transfiere a las células vegetales
provocan la hipertrofia e hiperplasia de
esta, generandose tumores en el tejido
vegetal. De este modo, la bacteria
obtiene nutrientes de las células
vegetales
Métodos biológicos
• Transformación mediada por A. tumefaciens
Métodos biológicos
• Transformación mediada por
A. rhizogenes

• Causa la enfermedad conocida

como raíz pilosa; en el sitio de
infección, y como resultado de los
genes bacterianos insertados en las
células vegetales, se forman raíces
en forma de cabellera.
Secuenciación
del ADN
Secuenciación del ADN
• ¿Cómo podemos conocer el orden de pares de
bases en un genoma?

• El método de secuenciación más utilizado es el

desarrollado por Sanger-Coulson, también
conocido como método enzimático.

• Emplea nucleótidos de terminación de cadena;

estos son dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTP’s)
que carecen del grupos OH no solo en el carbono
2’, sino también en el 3’
Secuenciación del ADN
• Dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTP’s)
• Carecen del grupo OH no solo en el carbono 2’, sino también en el 3’
Secuenciación del ADN
• El procedimiento es el siguiente:
• 1. El segmento de ADN a secuenciar se copia mediante PCR, utilizando
como punto de partida un sitio fijo especificado por un primer.
Secuenciación del ADN
• 2. Se preparan cuatro mezclas de reacción; todas ellas contienen los
cuatro tipos de dNTP’s (A, C, G, T) y cada una de ellas contiene a un tipo
de ddNTP’s
Secuenciación del ADN

• 3. Se coloca el mismo ADN en las cuatro mezclas de reacción, y se corren

PCR’s independientes. Si la ADN polimerasa toma un dNTP, la síntesis de la
cadena continua de manera normal; pero cuando se topa con un ddNTP,
la síntesis de la cadena se interrumpe. De este modo, se obtienen
fragmentos de diferente longitud en cada reacción, y todos terminan con
el mismo nucleótido. Ejemplo para ddGTP:
Secuenciación del ADN
Secuenciación del ADN

• 4. Se realiza una
electroforesis, colocando
en carriles contiguos
muestras de cada uno de
las mezclas de reacción,
para separar las distintas
bandas generadas por
PCR.
Secuenciación del ADN
• Este método supuso un enorme avance, sin embargo para secuenciar
grandes cantidades de ADN resulta muy laborioso y consume mucho
tiempo.
• Posteriormente, este mismo procedimiento fue automatizado,
permitiendo una secuenciación mucho más rápida.
• El principio es exactamente el mismo, solo que los ddNTP’s con extremos
marcados fluorescentes (un “color” para cada nucleótido); la PCR se
efectúa en una sola mezcla de reacción.
• Una vez completada la PCR, los fragmentos producidos se separan
mediante cromatografía en columna, y las fracciones son analizadas
por espectrofotometría. Se genera un patrón con cuatro colores.
Secuenciación del ADN