EFECTO ANTIALIMENTARIO DE LOS EXTRACTOS DE SUSPENSIONES

CELULARES DE Azadirachta indica SOBRE Spodoptera frugiperda J. E.

Smith EN CONDICIONES DE LABORATORIO

Jacqueline Capataz Tafur1; Fernando Orozco Sánchez;2

Rodrigo Vergara Ruiz3 y Rodrigo Hoyos Sánchez4

_____________________________________________________________________________

RESUMEN

Los extractos de neem (Azadirachta indica) y sus ingredientes activos como la azadiractina,
Azadirachta indica
presentan acción antialimentaria e inhibición del desarrollo de muchos insectos. El objetivo de
este estudio fue examinar el efecto antialimentario de los extractos de suspensiones celulares de
neem elicitadas a diferentes condiciones de luz y temperatura. Los extractos fueron aplicados en
discos de hojas de maíz y sometidas a bioensayos en larvas de segundo instar de Spodoptera
frugiperda J. E. Smith (Lepidptera: Noctuidae). Los extractos intracelulares y del medio de cultivo
de las suspensiones celulares de A. indica mostraron efecto biológico sobre larvas de S. frugiper
frugiperda
da
L2, con valores del 100 % de índice antialimentario para los extractos intracelulares de
suspensiones de A. indica elicitadas a 15 °C y oscuridad, y del 39,3% para extractos extracelulares
(medio de cultivo) de suspensiones elicitadas a 35 °C y oscuridad.

Palabras claves: Azadirachta indica, azadirachtina luz, temperatura, Spodoptera frugiperda.

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ABSTRACT
ANTIFEEDANT EFFECT OF CELL SUSPENSION EXTRACTS OF Azadirachta indica ON Spodoptera
frugiperda J. E. Smith UNDER LABORATORY CONDITIONS

Extracts of neem (Azadirachta indica) and their active ingredients as azadirachtin, present an
Azadirachta indica
action and inhibition of the development of many insects. In this study, the antifeedant effect of
cell suspension extracts elicited to different conditions of light and temperature was examined.
The extracts were applied in corn leaves disks and submitted to bioassays in larvae of second

1
Ingeniera Química. Auxiliar de Investigación. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de
Ciencias. A.A. 3840, Medellín, Colombia. <jcapata@ unalmed.edu.co>
2
Profesor Asistente. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias. A.A. 3840,
Medellín, Colombia.<feorozco@unal.edu.co>
3
Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelín, Facultad de Ciencias Agropecuarias. A.A.
1779, Medellín, Colombia. <rvergara@unalmed.edu.co>
4
Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelín, Facultad de Ciencias Agropecuarias. A.A.
1779, Medellín, Colombia. <rhoyos@unalmed.edu.co>

Recibido: Junio 20 de 2006; aceptado: Febrero 28 de 2007.

Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.60,No.1.p.3703-3715. 2007
 Capataz, J.; Orozco, F.; Vergara, R.; Hoyos, R.

instar of Spodoptera frugiperda J. E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae). The intracellular extracts and
the culture media (supernatant) of the cell suspensions of A. indica showed a biological effect on
larvae of S. frugiperda L2, with values of the 100 % of antifeeding index for the intracellular
extracts of cells elicited to 15 °C and darkness, and 39,3% of antifeeding index for extracellular
extracts (medium of cultivation) of elicited suspensions to 35°C, and darkness.

Key words: Azadirachta indica, azadirachtin, light, temperature, Spodoptera frugiperda.

________________________________________________________________________________________

El “gusano cogollero del maíz” Spodop- plagas porque pueden ser eficaces y
tera frugiperda J. E. Smith (Lepidóptera: complementar a menudo las acciones
Noctuidae), es una especie polifitófaga de los enemigos naturales (Schmutterer
nativa del trópico con amplia dis- 1990).
tribución geográfica, desde Argentina y
Chile hasta el sur de Estados Unidos. Los extractos del neem (Azadirachta
Prefiere hojas y brotes tiernos, especial- indica A. Juss, familia Meliaceae) son
mente los cogollos (Sosa 2002). Entre ampliamente explotados para su uso
los cultivos atacados se encuentran contra una amplia variedad de insec-
arroz, maíz, algodón, sorgo, trigo, tos. En particular el triterpeno azadirac-
avena, caña de azúcar, pastos, ajonjolí, tina y sus derivados, presentan efecto
soya, tabaco, plantas hortícolas, ciprés, antialimentario, repelente, insecticida,
papa, berenjena, crisantemo, y muchas regulador del crecimiento y son cau-
más (Gallego 1946, Vélez 1997). Es la santes de esterilidad en hembras
plaga de mayor importancia económica adultas (Allan et al. 2002, Schmutterer
en muchos cultivos de Colombia, que 1990). Sin embargo, su compleja es-
muestra mayor preferencia por el tructura química hace difícil su pro-
cultivo del maíz, actuando como ducción comercial mediante síntesis
gusano tierrero trozador de plántulas, química. Así, el suministro de insec-
perforador de fruto y como cogollero ticidas elaborados a partir de neem
que es su hábito más característico depende de la extracción de las se-
(Negrete y Morales 2003), alcanzando millas, las cuales son difíciles de
poblaciones tan altas que pueden obtener en la cantidad y calidad nece-
causar daños con un índice del 10% de sarias para asegurar el alto contenido
plantas trozadas (García1996). de azadiractina. Las técnicas del cultivo
de tejidos vegetales in vitro y de
La aplicación de insecticidas contra el suspensiones celulares de neem, han
estado larval del gusano cogollero es el sido desarrolladas y estudiadas como
principal método de control, pero la alta métodos alternativos para la síntesis
tolerancia a la mayoría de insecticidas y del producto (Zounos, Allan y Mordue
problemas ambientales asociados pue- 1999).
den comprometer su uso continuado
(Greenberg, Showler y Liu 2005). Los El objetivo de este estudio fue el de
productos botánicos son herramientas investigar y determinar la capacidad de
alternativas útiles y deseables en la ma- las suspensiones celulares de A. indica
yoría de los programas de manejo de para la producción de azadiractina

3704 Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.60,No.1.p.3703-3715. 2007

Efecto antialimentario de....

sometidas a condiciones de elicitación indica. Los experimentos fueron rea-

de régimen de luz y temperatura. Para lizados en enlemenyer de 100 mL con
esto se realizó el análisis químico de los 20 mL de medio de cultivo y utilizando
extractos de las suspensiones y se un inóculo del 20 % v/v a 120 rpm
evaluó su actividad biológica mediante durante 15 días. Se tomaron muestras
bioensayos de escogencia en larvas de cada tercer día para evaluar el cre-
segundo instar de S. frugiperda. cimiento celular (datos no mostrados) y
el efecto antialimentario de los extractos
intra y extracelulares del cultivo. El efecto
MATERIALES Y MÉTODOS de los diferentes tratamientos se analizó
estadísticamente mediante análisis de
indica.. Las
Suspensiones celulares de A. indica varianza (ANAVA). Los experimentos
suspensiones fueron iniciadas a partir fueron realizados por duplicado.
de callos friables de ocho (8) semanas
de edad provenientes de explantes de Obtención de los extractos intra y
hojas juveniles, suministrados por el suspensiones
extracelulares de la susp ensiones de A.
Laboratorio de Crecimiento y Desarrollo indica. La extracción de los metabolitos
de las Plantas (Universidad Nacional de intra y extracelulares de los cultivos de
Colombia, Sede Medellín). 500 mg de A indica en medio líquido se realizó
callos friables fueron transferidos en con disolventes orgánicos polares a
forma aséptica a erlenmeyers de 250 mL partir de la biomasa celular y del medio
con 50 mL del mismo medio utilizado de cultivo (sobrenadante), los cuales
para la inducción de los callos pero sin fueron separados mediante filtración al
agente gelificante. El medio de cultivo vacío. Para la obtención de los ex-
consistió de sales básicas Murashige & tractos intracelulares, 5 g de biomasa
Skoog 962, con orgánicos mínimos seca fue macerada y extraída con me-
(MSMO, Sigma M6899), suplementado tanol, CH3OH (3 x 10 mL); los extractos
con 4 mg/L de ácido indol butírico fueron combinados y concentrados al
(IBA), 1 mg/L de 6-benzil amino purina vacío en un rotoevaporador R-3000
(BAP) y 3 % (p/v) de sacarosa, ajustado Büchi por debajo de 45 °C hasta
a un pH de 5,8 (Kearney et al. 1994). sequedad; se adicionaron 10 mL de
Los cultivos fueron incubados en un agua destilada más 1 mL de cloruro de
agitador orbital a 25 °C ± 1 °C y 120 rpm sodio (NaCl 5 % p/v) y se extrajo con
en condiciones de oscuridad. El sub- diclorometano, CH2Cl2 (3 x 10 mL).
cultivo fue realizado cada 21 días en el
mismo medio descrito anteriormente. Las fases acuosas fueron descartadas y
las capas de diclorometano se combi-
Diseño experimental. Se adoptó un naron y se secaron con sulfato de
diseño experimental multinivel factorial magnesio (MgSO4) para retirar el exceso
3 x 2 completamente al azar para estu- de agua. Los extractos intracelulares se
diar los efectos de temperatura (15 °C y rotoevaporaron nuevamente hasta se-
35 °C) y del régimen de luz (luz continua, quedad y fueron redisueltos en 2 mL de
12 h luz / 12 h oscuridad y oscuridad metanol HPLC y almacenados a -4 °C
completa) en las suspensiones se A. (Balaji et al. 2003, Dai et al. 1999,

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Giraldo et al. 2002, Mordüe y Blackwell Insectos. Para los bioensayos, las larvas
1993, Schaaf et al. 2000). de S. frugiperda fueron suministradas
por el Laboratorio de Control Biológico
El volumen del medio de cultivo libre de la Universidad Nacional de Colombia,
de células fue medido y una parte de Sede Medellín, las cuales fueron alimen-
medio fue mezclado con 0,25 partes tadas con hojas de maíz (Zea mays). Las
de diclorometano en un embudo de larvas fueron mantenidas a 27 ± 2 °C,
separación y agitado por un minuto. condiciones de fotoperíodo de 12 h : 12 h
Después la fase de diclorometano fue – luz : oscuridad y 65 % humedad relativa
removida. Este procedimiento se re- promedio.
alizó 3 veces y todas las fracciones de
diclorometano fueron combinadas y el Bioensayos de escogencia. Las evalua-
exceso de agua fue removido utili- ciones de los extractos intra y extra-
zando MgSO4 el cual fue retirado por celulares se realizaron de acuerdo con
filtración. Los extractos extracelulares la metodología reportada por Blaney et al.
fueron rotoevaporados al vacío por 1990. Se utilizaron larvas de S. frugiperda
debajo de 45°C y resuspendidos en 2 mL de segundo instar (L2) las cuales fueron
de metanol HPLC y almacenados a -4 °C dejadas sin alimentación durante 3 horas
(Mordüe y Blackwell, 1993). antes del bioensayo. Luego se colocaron
individualmente dentro de cajas de Petri
Cromatografía líquida de alta de 8,5 cm. de diámetro con una capa de
(HPLC).. Los extractos fueron
resolución (HPLC) agar 1,0 % p/v, en la que habían dos
analizados en una columna Supelcosil discos de hojas de maíz con un área de
LC-18 RP-HPLC (10 cm. x 4,6 mm D.I, 2,25 cm2. Uno de los discos no fue
diámetro de poro 5 mm, Merck, inoculado con los extractos, actuando
Alemania). Se utilizó como fase móvil como control y el disco del tratamiento
acetonitrilo-agua (40:60) a una velo- recibió 50 µL de los extractos. Previamente
cidad de flujo de 0,7-mL min.-1, inyec- se evaluó el efecto del disolvente para
tando 10 µL de cada solución estándar descartar su efecto en la alimentación de
de azadiractina y de los extractos. La los insectos y de 50 µL de azadiractina
cuantificación de azadiractina fue rea- 1,5 ppm en metanol como control po-
lizada a 218 nm utilizando un detector sitivo de los ensayos. El efecto antialimen-
de arreglo de diodos UV visible Agilent tario de los bioactivos (E.A.A) se calculó
G1315B (Giraldo et al. 2002, Schaaf et mediante la fórmula propuesta por
al. 2000). Kearney et al. 1994 y Blaney et al. 1990.

Área del disco control consumida - Área del disco con tratamiento consumida
E.A.A = x 100
Área del disco control consumida + Área del disco con tratamiento consumida

Los bioensayos fueron finalizados a las con un medidor de área foliar LI-3000A
24 h. El área consumida fue cuantificada Portable Leaf Area Meter (Li-Cor, USA),

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Efecto antialimentario de....

RESULTADOS Y DISCUSIÓN antialimentarios son producidos durante

el crecimiento celular. Entre el día 3 se
Efecto antialimentario de los extractos obtuvo un E.A.A del 70 % incre-
intra y extracelulares a condiciones de mentándose hasta 99 % el día 15 de
25 °C y ooscuridad
scuridad (control). El efecto cultivo. Mordüe y Blackwell 1993,
antialimentario producido por los ex- reportaron que el efecto antialimentario
tractos es altamente variable en las de extractos etanólicos de suspensiones
distintas especies de plagas; aún para celulares de A. indica cultivadas a 25 °C
aquéllas donde la supresión de la y oscuridad, en ninfas de S. gregaria se
alimentación aparece como una con- incrementó significativamente entre los
tribución principal para la protección días 7 y 10 de 26,7 % a 55,1 %.
de los cultivos, la respuesta puede ser Extractos de líneas celulares de callos y
alcanzada a partir del efecto tóxico de suspensiones celulares de A. indica
postingestivo en vez de un comporta- presentaron un alto E.A.A sobre
miento directo (Isman 2002). En el caso Schistocerca gregaria, utilizando el
de larvas de S. frugiperda L2, los mismo medio de cultivo de esta in-
bioensayos realizados con extractos vestigación (Kearney et al. 1994). En su
intracelulares de A. indica cultivados a estudio, el E.A.A de los extractos de las
25 °C y oscuridad, mostraron un alto suspensiones celulares de A. indica se
porcentaje de efecto antialimentario incrementó significativamente entre los
(Figura 1), sugiriendo que compuestos días 14 y 24 del cultivo.

100
Efecto Antialimentario (%)

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 3 6 9 12 15
Tiempo (días)

Figura 1. Índice antialimentario de los extractos celulares de Azadirachta indica a

25°C oscuridad, sobre larvas de Spodoptera frugiperda.

En este estudio, los extractos de los 0,56 mg/L) y alcanzándose un máximo de

días 9 y 12 de incubación obtenidos del 35 % de dicho efecto en el día 9. Los
medio de cultivo, mostraron un efecto extractos extracelulares obtenidos por
sobre las larvas de S. frugiperda (Figura 2), Mordüe y Blackwell 1993, tuvieron
a pesar de las pequeñas concentraciones efecto un efecto antialimentario en
de azadiractina detectada (0,03 mg/L – ninfas de S. gregaria incrementándose 20

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veces entra los días 5 y 10 del cultivo. En mento en el E.A.A entre los días 6 y 9 de
esta investigación se observó un incre- cultivo.

Efecto Antialimentario (%)

35

30

25

20
15

10
5

0
0 3 6 9 12 15
Tiempo (días)

Figura 2. Índice antialimentario del medio de cultivo de Azadirachta. indica a 25°C

y oscuridad, sobre larvas de Spódoptera frugiperda.

Efecto antialimentario de los ex ex-- previo a la exposición de las larvas al

tractos intra y extracelulares de material.
suspensiones de A. indica obtenidos
bajo diferentes condiciones de luz y Los extractos intracelulares de las
temperatura. Los extractos intra y suspensiones de A. indica bajo los
extra celulares de las suspensiones de efectos de luz y temperatura mostraron
A. indica bajo las condiciones de un alto porcentaje de E.A.A en larvas de
elicitación abiótica fueron evaluados segundo instar (L2) de S. frugiperda,
en larvas de S. frugiperda L2 (Figura 3). alcanzándose un valor del 100 % con
La evaluación antialimentaria de los extractos obtenidos a condiciones de
extractos se realizó después de haber 15 °C - oscuridad en el día 9 de cultivo
transcurrido una hora de ser aplicado (Figura 4). En este mismo día de
el extracto. El efecto observado varió cultivo, los tratamientos de 15 ºC - luz
en los tratamientos, desde una alta continua, 25 ºC - oscuridad, 35 ºC - luz
preferencia de los lepidópteros a continua y 35 ºC - oscuridad obtu-
aposentarse sobre los discos de hojas vieron valores de 99,1; 93,0; 98,6 y
control hasta un total rechazo de los 99,1 % de E.A.A respectivamente. Las
discos con extractos. En general, el suspensiones celulares de A. indica pre-
efecto repelente prevaleció durante sentaron un contenido intracelular de
todo el ensayo aunque en algunos azadiractina entre 0,15 mg/l - 27,31 mg/l;
casos se notó una mayor ingesta al con valores promedio de 4,99 mg/l de
comienzo de los bioensayos dismi- azadiractina a 15 ºC, 1,64 mg/l a 35 ºC y
nuyendo hacia el final del ex- de 4,25 mg/l y 3,58 mg/l de azadiractina
perimento, a pesar de que sólo se a condiciones de oscuridad total y luz
realizó una aplicación del extracto continua respectivamente.

3708 Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.60,No.1.p.3703-3715. 2007

Efecto antialimentario de....

a. b.

c. d.

e. f.
Figura 3. Respuesta antialimentaria de los extractos de Azadirachta indica en
larvas de Spodoptera frugiperda L2,, a. Control azadirachtina grado reactivo (1.5
ppm). b. Control hoja de maíz sin extracto c. Biomasa a 15 °C - oscuridad, día 9. d.
Medio de cultivo a 35°C - oscuridad, día 6. e. Biomasa a 35°C - fotoperíodo, día 6.
f. Medio de cultivo a 15 °C - oscuridad, día 6. C: control y T: tratamiento.

Los extractos extracelulares de A. indica 5,28 mg/l de azadiractina). Por lo tanto, el

(Figura 5) exhibieron un E.A.A < 40 % efecto antialimentario encontrado se
sobre larvas de S. frugiperda, a pesar de podría atribuir a la presencia de otros
que se detectó poca cantidad de azadi- compuestos que actúan en forma inde-
ractina en el medio de cultivo (0,02 mg/l – pendiente o sinérgica con la aza-

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 Capataz, J.; Orozco, F.; Vergara, R.; Hoyos, R.

diractina tales como nimbina, 3- superó al 7% y los tratamientos que

tigloilazadiractina, salanina y otros, de produjeron mayores compuestos antiali-
los cuales también se ha reportado que mentarios extracelulares fueron 15 ºC -
producen efectos antialimentarios luz continua, 15 ºC - fotoperiodo, 35 ºC -
(Simmonds et al., 2004). A 15 ºC - fotoperiodo y 35 ºC - oscuridad con
oscuridad el E.A.A de estos extractos no valores de E.A.A mayores al 35 %.

100
15 °C, Luz
90 a Continua
15 °C,
80 Fotoperíodo
15 °C, Oscuridad
Efecto Antialimentario (%)

70
25 °C, Oscuridad
60 (control)

50

40

30

20

10

0
0 3 6 9 12 15
Tiempo (días)

100
25 °C, Oscuridad
90 b (control)
35 °C, Luz
80 Continua
Efecto Antialimentario (%)

35 °C, Fotoperíodo
70
35 °C, Oscuridad
60
50
40
30
20
10
0
0 3 6 9 12 15
Tiempo (días)

Figura 4. Efecto antialimentario de los extractos de las células de Azadirachta.

indica. a. 15 ºC; b. 35 ºC, sobre larvas de Spodoptera frugiperda.

3710 Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.60,No.1.p.3703-3715. 2007

Efecto antialimentario de....

40
15 °C, Luz

35
a Continua
15 °C, Fotoperíodo

30 15 °C, Oscuridad
Efecto Antialimentario (%)

25 25 °C, Oscuridad
(control)
20

15

10

0
0 3 6 9 12 15

Tiempo (días)

40 25 °C, Oscuridad
(control)
35 °C, Luz
35
b Continua
35 °C, Fotoperíodo
Efecto Antialimentario (%)

30
35 °C, Oscuridad

25

20

15

10

0
0 3 6 9 12 15

Tiempo (días)

Figura 5. Efecto antialimentario de los extractos del medio de cultivo de

Azadirachta. indica. a. 15 ºC; b. 35 ºC, sobre larvas de Spodoptera frugiperda.

El análisis de varianza (Tabla 1) indica 15 °C y oscuridad (Figura 6). El com-

que la interacción luz – temperatura portamiento del E.A.A máximo se
(valor p = 0,4458) no tiene un efecto puede describir mediante la siguiente
significativo sobre el índice antiali- ecuación:
mentario de los extractos de A. indica.
Por el contrario, la temperatura y la luz E.A.A.máx = 102,88 – 0,0516083 L –
son significativas ejerciendo efectos 0,19861 T + 0,000895417 LT
negativos. Los valores óptimos del
índice antialimentario se obtuvieron E.A.Amásx: Índice Atialimentario Máximo (%)
mediante un gráfico de superficie de L: Régimen de Luz (h)
respuesta estimada, los cuales fueron T: Temperatura (°C)

Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.60,No.1.p.3703-3715. 2007 3711

 Capataz, J.; Orozco, F.; Vergara, R.; Hoyos, R.

Tabla 1. Análisis de varianza del efecto antialimentario de los extractos de

Azadirachta indica sobre larvas de Spodoptera frugiperda.

Factor GL Suma de cuadrados Media de cuadrados Relación F Valor

Valor P

A: Régimen de Luz 1 0,983784 0,983784 7,09 0,0374

B: Temperatura 1 42,3519 42,3519 305,08 0,0000
AB 1 0,092364 0,092364 0,67 0,4458
Error Total 6 0,832923 0,138821
Efecto antialimentario (%)

102
100
98
96
94 35
92 23 2731
0 4 8 12 16 20 24 1519 Temperatura (°C)
Regimen de luz (h)

Figura 6. Superficie de respuesta estimada para el efecto antialimentario máximo

de azadiractina de las suspensiones celulares de Azadirachta indica.

Las hojas de maíz tratadas con extracto pura a 1 ppm en larvas de S. frugiperda
de neem fueron ingeridas por las larvas mostraron un 90 % de E.A.A en ensayos
de S. frugiperda hasta llegar a cierto de escogencia y un consumo del 5 % del
punto de ingestión donde empezaron a disco tratado en ensayo de no escogen-
comer cada vez menos, hasta que cia mostrando una alta susceptibilidad al
dejaron de ingerir y murieron. Esto metabolito. Simmonds et al. 2004
significa que la reducción en la toma reportaron que una concentración de
de alimento por las larvas no es solo 3,6 × 10−7 M de azadiractina es
gustativa (regulada por los órganos suficiente para causar un 50 % de
sensoriales de las partes de la boca) efecto antialimentario en larvas L3 de S.
sino también no gustativa (Schmutterer frugiperda. En el presente estudio, la
1990). azadiractina aplicada tuvo un E.A.A. de
100 %. En las condiciones de tem-
Blaney et al. 1990, reportaron que peratura y régimen de luz estudiados,
bioensayos realizados con azadiractina el efecto antialimentario en larvas de

3712 Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.60,No.1.p.3703-3715. 2007

Efecto antialimentario de....

Spodoptera fue mayor con los extractos suspensiones celulares de A. indica

celulares de A. indica que los extractos generadoras de metabolitos.
del medio de cultivo libre de células. El
13 % de la azadiractina producida fue
excretada al medio de cultivo, confir- AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
mando esto que la mayor producción
de azadiractina es a nivel intracelular y Los autores agradecen a la Dirección de
que la actividad antialimentaria de los Investigaciones de la Universidad
extractos extracelulares puede ser Nacional de Colombia, Sede Medellín,
debida a la presencia de otros me- DIME, por el financiamiento de este
tabolitos como 3-tigloilazadiractina y proyecto Código 030802664 y al
3-acetil-1-tigloilazadiractina que son Laboratorio de Control Biológico, de la
compuestos resultantes del rearreglo Universidad Nacional de Colombia,
de la azadiractina (Ley et al. 1989) y Sede Medellín, por el suministro de los
que pudieron haberse formado a partir insectos para los bioensayos.
de la azadiractina antes de ser
secretados al medio.
BIBLIOGRAFÍA
CONCLUSIONES
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