Guía de Laboratorio. No. 1. Recuento de Aerobios PDF

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD
Sección Genética Humana, Microbiología y Bioquímica Clínica
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
“GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

DE ALIMENTOS”
Loja - Ecuador
2020
Departamento de Ciencias de la Salud Código: LAB_ANAT_V04
Laboratorio de Microbiología de Alimentos Válido desde: Octubre 2017

Guía práctica Página: 2 de 10
ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN ¡Error! Marcador no definido.
II. OBJETIVOS. ¡Error! Marcador no definido.
III. MATERIALES Y EQUIPOS ¡Error! Marcador no definido.
IV. METODOLOGÍA (PROCEDIMIENTO) ¡Error! Marcador no definido.
V. RESULTADOS OBTENIDOS ¡Error! Marcador no definido.
VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ¡Error! Marcador no definido.
VII BIBLIOGRAFÍA ¡Error! Marcador no definido.
VIII ANEXO ¡Error! Marcador no definido.
Elaborador: Revisión: Aprobó:
Cargo: Docente de Prácticas Cargo: : Responsable de la Sección Cargo: Directora del

Departamento
Fecha: Fecha: Fecha:
Custodio: Responsable de Laboratorio

Práctica No. 1 Recuento de aerobios mesófilos por el método de vertido en

placa y rápido petrifilm
I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias aerobias mesófilas son todas las bacterias capaces de desarrollarse
en un medio nutritivo incubado en condiciones de aerobiosis. Las bacterias
mesófilas tienen varios usos como indicadores:
 Determinan la posible presencia de bacterias patógenas. La mayoría de bacterias

patógenas son mesófilas y por tanto un recuento elevado de bacterias mesófilas
aerobias indica que existieron condiciones que favorecieron el que ciertos
microorganismos patógenos proliferaran considerablemente encontrándose en el
alimento en gran número.
 Indican la calidad sanitaria de un alimento natural o procesado, ya que éstos
productos deben satisfacer ciertas especificaciones microbiológicas (Normas de
Calidad).
 Estiman la duración de la vida de anaquel de un producto, ya que generalmente existe
una relación directa entre el grado de descomposición y el contenido microbiano
(excepto en productos fermentados o madurados.
 Petrifilm en placa para conteo aeróbicos: las placas contienen nutrientes, agente
gelatinizante soluble en agua fría, 2,3,5, triphenytetrazolium chloride indicador. Las
placas petrifilm las provee 3M.
1.1 Fundamento del método de dilución y vertido en placa
Según Ramirez Gama, et al. (2015) involucra la dispersión de la muestra en una serie
de diluciones y en un medio con agar. Se basa en el supuesto de que cada célula
bacteriana, fúngica, o esporas incluidas en el medio con agar o en su superficie, al
multiplicarse dará origen a un cúmulo de células que producen una colonia. De este
modo cada colonia puede proceder de una sola célula o de una agrupación (unidad
formadora de colonia UFC), por lo que es difícil obtener resultados reproducibles
1.2 Fundamento del método rápido petrifilm

Departamento

Petrifilm, es un sistema que contiene sustancias nutritivas rehidratables integradas en
una serie de películas sobre una base plástica. Esta unidad tiene un tamaño similar al
de una tarjeta de crédito en la parte superior una cubierta plástica protege el medio de
cultivo deshidratado que es soluble en agua fría (Martínez Gama, et al. 2015).
Para obtener la cuenta de células viables, se levanta la capa protectora y se deposita
1 mL de la muestra en el centro de la unidad, después se cubre con la capa protectora
suavemente para evitar la formación de burbujas, posteriormente se coloca una
plantilla plástica sobre la cubierta y el inóculo la que se presiona ligeramente para
distribuir de manera uniforme la muestra y generar un molde redondo que servirá
como límite para realizar el conteo de las colonias desarrolladas. El medio rehidratado
permite el desarrollo de los microorganismos presentes en la muestra después de
incubarla durante un tiempo y temperaturas apropiados.
II. OBJETIVOS.
1. Determinar el contaje de aerobios mesófilos en alimentos por agar plate count y

método rápido en placas petrifilm,
2. Diferenciar las colonias de aerobios mesófilos obtenidas en el ensayo por los dos
métodos.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
- Butterfield’s buffered phosphate diluent: preparación de la solución stock: disolver

34,0 g de KH2PO4 en 500 ml de agua, se ajusta el pH a 7,2 con aproximadamente
1,75 ml de NaOH 1M, y diluir a 1 Lt. Mantener en refrigeración. Diluyente: diluir
1,25 ml de la solución stock a 1 lt con agua. Prepare blancos de dilución con esta
solución. Autoclavar 15 minutos a 121 ºC.
- Medio de cultivo Agar plate count 140 ml.
- Placas de aerobios mesófilos petrifilm (4 unidades)
- 3 pipetas de 10 ml
- 3 pipetas de 1 ml
- 1 Incubador
- 1 mechero bunsen
- 1 pera de succión
- 3 erlenmeyers de 250 ml
- 1 erlenmeyer de 500 ml
- 1 balón de 1000 ml
- Contador de colonias
- Termómetro NIST
- 1 varilla de agitación
- Papel craf
- Algodón
- Papel aluminio

Departamento

- Alcohol.
- 1 autoclave para esterilización
IV. METODOLOGÍA (PROCEDIMIENTO)
AGAR PLATE COUNT
- Limpiar la mesa de trabajo con alcohol y luego prender el mechero bunsen.

- Limpiar el envase del producto con un algodón empapado en alcohol.
- Abrir el envase y tomar asépticamente 10 ml de la muestra y poner en 90 ml de
agua buferada estéril, agitar 30 veces esta será la dilución 10 -1 , tomar 1 ml de
esta solución y poner en un tubo de 9 ml de agua buferada estéril esta será la
dilución 10-2, poner de esta solución 1 ml en un tubo de 9 ml de agua buferada
estéril esta será la dilución 10-3 .
- Poner estas soluciones en las cajas petri estériles
- Colocar en la caja petri estéril ,con una pipeta perpendicular colocar 1 ml de la
muestra en el centro de cada una de la diluciones (10-1,10-2,10-3)
- Poner el agar frio y templado a 45 º C y realizar movimientos: 6 a la izquierda, 6 a
la derecha y 2 arriba y otro abajo.
- Dejar secar las placas con agar hasta que se solidifique
- Poner las placas en la incubadora en forma invertida 24 a 48 horas a 35 º C..
- Realizar el conteo entre 25-250 colonias.
MÉTODO RÁPIDO PLACAS PETRIFILM
- Poner estas soluciones en las placas petrifilm.

- Colocar la placa petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior.
- Con una pipeta perpendicular a la placa petrifilm colocar 1 ml de la muestra en el
centro del film inferior de cada una de la diluciones (10-1,10-2,10-3)
- Dejar caer el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire.
- Con la cara lisa hacia arriba, colocar el aplicador en el film superior sobre el
inóculo.
- Ejercer una presión sobre el aplicador para repartir el inóculo sobre el área
circular. No girar ni deslizar el aplicador.
- Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que solidifique el gel. RECUERDE
inocular y poner el aplicador antes de pasar a la siguiente placa.
- Incubar las placas petrifilm cara arriba en pilas de hasta 20 placas a temperatura
de 35 ºC por 48 +/- dos horas.
- Realizar el conteo entre 30-300 colonias.

Departamento

V. RESULTADOS OBTENIDOS
AGAR PLATE COUNT
- Para diferenciar las colonias de aerobios mesófilos en las placas petrifilm, busque
algunas de las siguientes características típicas del cultivo: colonias de color
blanquecino a crema.
- Para calcular el contaje de aerobios mesófilos, multiplicar el número total de
colonias de aerobios mesófilos por placa por el respectivo factor de dilución.
- Cuando se hace el contaje en placas por duplicado en diluciones consecutivas,
calcule el número promedio de colonias de cada dilución antes de determinar el
contaje total de aerobios mesófilos.
- Se puede hacer contajes estimados en placas con más de 250 colonias y puede
ser reportado como contaje estimado. Al realizar dichos contajes determinar el
contaje promedio / 1 cm2 y multiplicar por 60 (área de crecimiento circular de 60
cm2).
- CONTAJE DE AEROBIOS: se aplica la siguiente fórmula:
°
=
ó
-
- Las unidades son ufc/ml (Unidad formadora de colonia por ml o g de muestra)
MÉTODO RÁPIDO PETRIFILM
- Para diferenciar las colonias de aerobios mesófilos en las placas petrifilm, busque
algunas de las siguientes características típicas del cultivo: colonias de color rojo.
- Para calcular el contaje de aerobios mesófilos, multiplicar el número total de
colonias de aerobios mesófilos por placa por el respectivo factor de dilución.
- Cuando se hace el contaje en placas por duplicado en diluciones consecutivas,
calcule el número promedio de colonias de cada dilución antes de determinar el
contaje total de aerobios mesófilos.
- Se puede hacer contajes estimados en placas con más de 300 colonias y puede
ser reportado como contaje estimado. Al realizar dichos contajes determinar el
contaje promedio / 1 cm 2 y multiplicar por 30 (área de crecimiento circular de 30
cm2).
- CONTAJE DE AEROBIOS: se aplica la siguiente fórmula:
°
=
ó

Departamento

-
- Las unidades son ufc/ml (Unidad formadora de colonia por ml o g de muestra)
VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Las conclusiones y recomendaciones son referentes a la práctica realizada.
VII. BIBLIOGRAFÍA
 Maturin, L. and Peeler, J. Bacteriological Analytical Manual. Aerobic Plate Count.

Ch. 3.
 AOAC (Official Methods of Analysis. Microbiological Methods). 2005. AOAC
990.12. Método rápidp PetrifilmTM para el recuento de Aerobios mesófilos en
alimentos. Ch. 17, Ed. 18.
 Guía de interpretación. 3MTM PetrifilmTM
 https://www.google.es/imghp?hl=es
VIII. ANEXO
FIGURAS EXPLICATIVAS
AGAR PLATE COUNT

Departamento

MÉTODOS RÁPIDOS PLACAS PETRIFILM

Departamento


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I. INTRODUCCIÓN ¡Error! Marcador no definido.

II. OBJETIVOS. ¡Error! Marcador no definido.

III. MATERIALES Y EQUIPOS ¡Error! Marcador no definido.

IV. METODOLOGÍA (PROCEDIMIENTO) ¡Error! Marcador no definido.

V. RESULTADOS OBTENIDOS ¡Error! Marcador no definido.

VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ¡Error! Marcador no definido.

VII BIBLIOGRAFÍA ¡Error! Marcador no definido.

VIII ANEXO ¡Error! Marcador no definido.

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Práctica No. 1 Recuento de aerobios mesófilos por el método de vertido en

 Determinan la posible presencia de bacterias patógenas. La mayoría de bacterias

1.1 Fundamento del método de dilución y vertido en placa

1.2 Fundamento del método rápido petrifilm

Elaborador: Revisión: Aprobó:

Cargo: Docente de Prácticas Cargo: : Responsable de la Sección Cargo: Directora del

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1. Determinar el contaje de aerobios mesófilos en alimentos por agar plate count y

- Butterfield’s buffered phosphate diluent: preparación de la solución stock: disolver

Cargo: Docente de Prácticas Cargo: : Responsable de la Sección Cargo: Directora del

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IV. METODOLOGÍA (PROCEDIMIENTO)

AGAR PLATE COUNT

- Limpiar la mesa de trabajo con alcohol y luego prender el mechero bunsen.

MÉTODO RÁPIDO PLACAS PETRIFILM

- Poner estas soluciones en las placas petrifilm.

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AGAR PLATE COUNT

MÉTODO RÁPIDO PETRIFILM

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VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

 Maturin, L. and Peeler, J. Bacteriological Analytical Manual. Aerobic Plate Count.

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MÉTODOS RÁPIDOS PLACAS PETRIFILM

Elaborador: Revisión: Aprobó:

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