Fecha: 01/12/2020

Nombre: Javiera Hidalgo, Yovanna Tamburini

R.U.T:
Grupo:
Guía de Secuencia Práctico 6. ANALISIS FORENSE Y ALCOHOLEMIA (CASO
CLINICO): ANALISIS DE MANCHAS Y SEMEN
Caso Clínico
Toxicología Clínica y Forense. Alcoholemias.
Experiencia 1. Determinación de Etanol en Muestras Forenses.

Caso Forense: El sábado 10 de febrero de 2019, don Pedro Pablo Pérez Pereira
acudió a una celebración donde ingirió seis copas de vino blanco y cuatro
cervezas. A las 23.30 hrs. se retiró a su domicilio y a eso de las 00.00 hrs. choca
con otro automóvil, sin resultado de muerte. A las 00.30 llega al lugar carabineros
de chile, quienes proceden a tomarle una prueba de alcotest, la cual arrojo 5.00
g/L, posteriormente lo trasladan al SAPU de Las Condes donde el médico de turno
a las 5.30 hrs., procede a tomarle una muestra de sangre para la alcoholemia de
rigor. La muestra de sangre es enviada al laboratorio donde usted se desempeña
como Perito.

Laboratorio de Peritaje

Para la cuantificación del etanol en la muestra sanguínea se utilizará el

micrométodo de Widmark, en el cual realizaremos una
-------------------------volumétrica indirecta; haciendo que el alcohol presente se
volatilice a.....°C y reaccione con dicromato de potasio de acuerdo con la reacción:

1) 2K2Cr2O7 + 3 C2H5OH + 8 H2SO4

entonces el dicromato en exceso reacciona con el indicador ioduro de potasio para

producir iodo molecular que es titulado con tiosulfato de sodio de acuerdo con la
reacción:
2) 2Na2S2O3 + I2

3) Para calcular la concentración de alcohol en la muestra en el laboratorio

realizará una curva de calibración (Promedio de volumen gastado de tiosulfato de
sodio versus concentración de alcohol en soluciones patrones). La curva de
calibración se realizó tomando los siguientes volúmenes del recipiente de etanol
escogido por usted (densidad= 0,89 g/mL) y llevándolos a un aforo de 25 mL.

a) b

4) Curva de Calibración

Concentración V(μL) Etanol en 25

Etanol (g/L) mL de Solución
0,5
0,8
1,0
2,0
3,0

De acuerdo a la normativa nacional, el método de control validado para esta

cuantificación dicta el siguiente procedimiento, de acuerdo a ello responda las
siguientes interrogantes y complete los campos solicitados una vez finalizado el
procedimiento.
Método de en caso de ausencia de cromatografía gaseosa.

1. Agregar a cada matraz 1 ml de solución de dicromato de potasio (patrón

primario), se debe tener la precaución que la solución debe quedar en el fondo del
matraz y no en las paredes de este.

2. Tomar 200 µL de cada una de las soluciones control de alcohol 0.3- 0.8-1.0-
2.0 y 3.0 g/L y depositar en cada dispositivo Widmark con la rotulación respectiva,
posteriormente realizar mismo procedimiento para la muestra problema en
triplicado.

3. Colocar a cada matraz el dispositivo Widmark. El dispositivo Widmark debe

quedar en la parte más ancha del matraz y a una distancia de 1 cm de la solución
de dicromato de potasio. Presionar y girar el tapón de goma del dispositivo contra
la boca del matraz, con extremo cuidado.

4. Organizar los equipos Widmark en dirección de izquierda a derecha para

mantener un orden de las soluciones control, por lo tanto, la primera solución
control de alcohol 0.5 g/L, corresponderá al primer equipo Widmark ubicado a la
izquierda de la gradilla.

5. La Primera gradilla representará “el blanco”, dispondrá de 3 matraces Widmark,

los cuales deben contener 1 ml de dicromato de potasio y sólo se taparán con el
tapón de goma.

6. Las siguientes tres gradillas dispondrán de los siguientes 6 equipos Widmark,

que contienen en el matraz 1 ml de dicromato de potasio y por dispositivo
Widmark de izquierda a derecha, 200 µl de solución control de alcohol 0.5- 0.8-
1.0- 2.0 y 3.0 g/lL y su muestra problema.

7. Cubrir con parafilm cada tapón de los equipos Widmark.

8. Introducir las gradillas en el baño termorregulador a 70°C por 2 horas y controlar

que no se destape ningún matraz por la presión de vapor interna. En caso que
sucediera se deberá realizar una marca con una X en el cuello del matraz con un
marcador.

9. Terminado el tiempo de incubación, retirar las gradillas del baño

termorregulador y dejar enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente.
10. Destapar cada uno de los equipos Widmark, y retirar los dispositivos Widmark.

11. Agregar a cada matraz 1 ml de solución de yoduro de potasio 10% p/v,

homogeneizar y esperar 2 minutos.

12. Ambientar y preparar las buretas de 2 ml con Tiosulfato de sodio para la

titulación.

13. Titular cada matraz con solución de tiosulfato de sodio 0,1M (patrón
secundario), el punto final estará indicado por un viraje de coloración verde pálido.
Durante este proceso no deben transcurrir más de 5 minutos.

Material de Medición Volumétrica:

A B C

Micropipetas: (10-100) μL (20-200) μL

(100-1000) μL

D E

Pipeta Volumétrica de 1 mL Pipeta Graduada de 1 mL

Cuestionario Práctico:

5) Equipo de medición volumétrico usado en el paso 1: ................

6) Equipo de medición volumétrico usado en el paso 2: ...............

7) Por cuál razón práctica es importante seguir el orden del paso 4 si las muestras
de igual forma deben ser rotuladas.

8) ¿Por qué se realiza la medición de un blanco en el micrométodo de Widmark si

no hay interferencia de la matriz de la muestra en el análisis?

9) ¿Por qué el ensayo se realiza a 70°C en el período previo a la valoración

indirecta?

10) Señale las condiciones bajo las cuales una solución de Ioduro de potasio al
10% puede ser útil como indicador en una titulación volumétrica.

Resultados: Los volúmenes gastados del titulante para cada uno de los puntos
controles de la curva obtenidos en el laboratorio fueron registrados

Conc. (g/L) V1(mL) V2(mL) V3(mL) Vprom

0 (Blanco) 2,8 2,8 2,9 2,8
0,5 2,4 2,4 2,4 2,4
0,8 2,1 2,1 2,0 2,1
1 1,0 1,0 1,1 1,0
2 0,9 0,9 0,9 0,9
3 0,1 0,1 0,2 0,1
Muestra 0,3 0,3 0,4 0,3

De acuerdo con estos resultados:

11) ¿A qué se puede atribuir que se necesitó menos titulante en la solución patrón
de concentración 3 g/L?
12) Grafique la curva de calibración (Excel), anote los datos de pendiente y
coeficiente de correlación lineal y explique la importancia de estos datos para la
cuantificación de etanol en la muestra.

Reporte Pericial.

13) Realice los análisis respectivos e informe el valor de alcoholemia cuantificado.

14) Con el valor de la alcoholemia cuantificada en la muestra de sangre, realice la

retroproyección de esta, e informe el valor de alcohol en sangre al momento del
accidente.

15) ¿Es correcto con el valor del alcotest calcular la alcoholemia al momento del
accidente?. justifique su respuesta.

16) Argumente el estado de temperancia o intemperancia que tenía Don Pedro

Pablo, al momento del accidente.
Experiencia 2. Determinación de Metanol en Muestras Clínicas.

Caso Clínico: Un varón de 54 años de edad, 168 cm de estatura, 75 Kg de peso,

recluso en la cárcel de Talca, ejerce el oficio de carpintero y mueblista, es
trasladado por los paramédicos al servicio de urgencia del Hospital de Talca,
debido a que bebió un vaso de 300 cc de “Pájaro Verde”.

La ingesta de la bebida, ocurrió 40 minutos antes del ingreso al Servicio de

Urgencia. El paciente con historial médico de Alcoholismo, asma, hipertensión
arterial, depresión y un intento de suicidio anterior.

Examen físico: A su llegada al servicio de urgencias, el paciente no responde a los

movimientos posturales, sudoración profusa, con signos de incontinencia urinaria,
confuso, visión borrosa, vómitos, intenso dolor abdominal y esofágico. Piel pálida y
fría. Glasgow de 4 y midriasis bilateral arreactiva.

Frecuencia respiratoria: 6 latidos por minuto y Disnea

Temperatura corporal: 35,8 °C
Presión arterial = 246/112 mmHg

Datos de laboratorio clínico

Exámenes de sangre Resultado Valor de Referencia

Saturación O2 70% >95%

PO2 (mmHg) 69 75-100

PCO2(mmHg) 33 35-45

HCO3 (mEq/l) 7 22-26

pH 6,5 7.35-7.45

Na+(mEq/l) 90 135-144

K+(mEq/l) 2,8 3.5-5

Cl-(mEq/l) 90 95-105

Glicemia (mg/dl) 160 70-105

 Creatinina(mg/dl) 0,4 0.4-1.1

BUN(mg/dl) 5,8 6-20

Cuantifique la cantidad de alcohol metílico en la muestra de sangre extraía al

paciente, correlacione la cantidad cuantificada con los antecedentes clínicos y
comente.

1) Con los síntomas y signos presentados por el paciente en su ingreso al servicio

de urgencias, se podría inferir que presenta una intoxicación medicamentosa o por
drogas de abuso. ¿Cuáles pruebas de laboratorio pediría usted para confirmar
este diagnóstico? Mencione al menos tres .

2) ¿Una prueba de colinesterasa sanguínea (CHE) es útil para evaluar a este

paciente? Justifique su respuesta.

3) Mencione los metabolitos tóxicos producidos por la intoxicación por metanol.

Cuantificación de Metanol por el método de Winnick

El método se basa en una reacción óxido reducción del metanol con dicromato de
potasio en medio ácido, el producto final de la reacción es un compuesto
coloreado el cual puede ser determinado espectrofotométricamente. La liberación
del metanol de la muestra se basa en la volatilidad del metanol y la reacción con el
dicromato de potasio, la cual ocurre en la cámara de difusión Conway.

La cuantificación se realiza por medida espectrofotométrica a 600 nm. Para los

cálculos en el laboratorio se realizará una curva de calibración midiendo la
absorbancia de testigos de concentración conocida de metanol. Estos testigos se
realizan a partir Metanol Puro de densidad= 0,7918 g/mL
4) Diga los volúmenes en microlitros del Metanol indicado, necesarios para
preparar la siguiente curva de calibración con soluciones de 25 mL.

Concentración V(μL) Metanol

Metanol (g/L) Puro en 25 mL de
Solución
0,3
0,5
0,8
1,0
2,0

C1 V 1C 2 V 2

C1  0,7918g / mL  791,8 g / L

V 1 ?

V 2 25mL  0,025 L

g
0,3  0,025 L
Concentración 1: L  V1  9,472 x10 6 L  (1000000 L / L)  9,472 L
791,8 g / L

g
0,5  0,025L
Concentración 2: L  V1  1,5787 x10 5 L  (1000000L / L)  15,787L
791,8 g / L

g
0,8  0,025L
Concentración 3: L  V1  2,5259x10 5 L  (1000000L / L)  25,259L
791,8 g / L

g
1,0  0,025L
Concentración 4: L  V1  3,1574x10 5 L  (1000000L / L)  31,574L
791,8 g / L

g
2,0  0,025L
Concentración 5: L  V1  6,3147x10 5 L  (1000000L / L)  63,147L
791,8 g / L

Método en caso de ausencia de cromatografía gaseosa.

1. Disponer de la celda de Conway dentro de la cápsula de Petri. Considerar 5
puntos de concentración conocida para la curva de calibración, el blanco y la
muestra problema.

2. Colocar 1,0 mL de la solución de Dicromato de potasio (25 g/l) en solución de

ácido sulfúrico (500 ml/l), previamente preparada, dentro de la celda Conway.

3. Fuera de la celda de conway colocar 1.0 mL de solución saturada de carbonato

de potasio.

4. Adicionar 1,0 mL de cada una de las soluciones control de metanol (0.3-0.5-0.8-

1.0 - 2.0 g/L) y 1,0 mL de la muestra problema sobre la solución saturada de
carbonato de potasio, respectivamente, el blanco realizarlo con agua destilada.
Cerrar el sistema y dejar incubando por una hora, a temperatura ambiente.

5. Una vez cumplido el tiempo de difusión, trasvasar el contenido del

compartimento interno en forma cuantitativa (enjuagando el compartimiento con
pequeños volúmenes de agua destilada varias veces) a un tubo graduado de 10
ml de capacidad. Llevar a 10 mL con agua, mezclar por inversión.

6. Leer en espectrofotómetro a 600 nm.

Resultados: Las absorbancias medidas en el laboratorio para cada uno de los

puntos controles y la muestra fueron registrados

Conc. (g/L) Absorbancia

0,3 0,051
0,5 0,085
0,8 0,111
1 0,173
2 0,341
Muestra 0,273
5) Grafique la curva de calibración (Excel), anote los datos de pendiente y
coeficiente de correlación lineal y explique la importancia de estos datos para la
cuantificación de etanol en la muestra.

La gráfica se aproxima a un comportamiento lineal respondiendo a una ecuación de la recta:

y  mx  b

Dónde:

x= concentración (g/L)

y= Absorbancia

b= -0,0065

m= 0,1725

r= 0,995

7) Podría decir qué el Método de Winnick es específico en la determinación de

Metanol. Justifique su respuesta.

Experiencia 3. Determinación de Semen en Muestras Forenses.

Caso Forense: Una mujer de aproximadamente 45 años, es encontrada fallecida

en un sitio eriazo, entre unos arbustos, no identificada aún, muerte de causas
desconocidas.

Los vecinos decían que era una mujer que frecuentaba el lugar, en situación de
abandono que acostumbraba a consumir bebidas alcohólicas, lo que le
ocasionaba fuerte cambios de conducta en donde se ponía a gritar o desvariar
mientras seguía alcoholizándose, referían también que esa tarde escucharon
gritos que hacía generalmente por lo que no le dieron importancia y le ignoraron
como de costumbre.

En sus cercanías se sentía un entremezclado olor acido, orina, heces y leve

putrefacción, el expediente destaca que la mujer se encontraba con los pantalones
abajo y su ropa estaba relativamente sucia con manchas color rojo en distintos
tonos que no parecían propias de la prenda, a los funcionarios de Policía les llamo
la atención la ropa interior que parecía tener líquidos desecados, por lo que ahora
daba un aspecto endurecido a esta, el cadáver tenía hematomas en la sección
lateral izquierda de su cuerpo y alrededor de su cuello, junto a algunos rasmillones
en la cara y brazos, por lo que se decide tomar una muestra de sus prendas y
analizarlo en el laboratorio, de igual forma lo hicieron con la ropa interior para
descartar presunta violación.

Finalmente, el fiscal solicita que usted realice los análisis respectivos, en las
prendas de ropa, y su informe pericial que permita esclarecer la situación.

Recolección de muestra

1. Se observa el soporte solido en la luz forense e se Identifica la zona en

donde existe fluorescencia para determinar la ubicación del supuesto fluido
biológico.

2. La extracción de muestras en superficies solidas se realiza con hisopo

(corte longitudinal) y en los demás casos se realiza un corte aprox. 3mm ó
5mm.

3. Se Agrega en un microtubo con 200 µL de buffer de extracción y se agita

con un dispositivo Vortex por 30 minutos a mínima rpm.

4. Se Centrifuga la muestra 8 minutos a 3.600 rpm. y se elimina el

sobrenadante con una pipeta. Se transfiere el sedimento a una placa porta
objetos y se fija la placa.

Determinación de Fosfatasa Ácida Prostática. Método de Sivaram-Bami

1.Las muestras se incuban en 1000 µL de tampón Citrato 90 mM pH 4.9,

durante 60 minutos a 38°C.

2.Luego de la incubación, cada muestra se separa en dos alícuotas de 400

µL.
 3.Se incuban las muestras durante 60 minutos a 38ºC. Finalizada la
incubación, los tubos se dejan enfriar a temperatura ambiente, se agrega a
cada uno de ellos 200 µL de reactivo de Folin & Ciocolteau y se
homogenizan.

4.Por último, a cada tubo se le agregan 170 µL de reactivo alcalinizante

(Carbonato de Sodio al 20%), se agitan y una vez transcurrido 10 minutos,
se observan los resultados.

Cuestionario Práctico:

1) ¿Cuáles reactivos proporcionan el medio ácido para poder desarrollar la

reacción de Sivaram-Bami?

2) ¿Qué función cumple el L(+)- Tartrato en la reacción de Sivaram-Bami?

3) ¿Qué función cumple el Na2CO3 en la reacción de Folin & Ciocolteau?

4) ¿Es específico el método propuesto por Sivaram-Bami para la detección de

semen humano en manchas? Justifique su respuesta.

5) ¿Cuál son los componentes de la solución Kernechtrot y de qué color tiñe al

espermatozoide?