UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL DE

HUAMANGA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA DE FORMACION PROFESIONAL DE AGRONOMIA
MICROBIOLOGÍA AGRICOLA (PV 343)
TRABAJO N°1

INSTRUMENTAL BÁSICO Y TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

AYACUCHO – PERU
2021
 Práctica N. 1
Instrumental básico y Técnicas microbiológicas

A. TÉCNICAS PARA LA PREPARACIÓN DE MATERIALES Y MÉTODOS DE

ESTERILIZACIÓN

I.- OBJETIVOS: Logros que deben alcanzar al término de la Práctica.

Conocer las técnicas básicas utilizadas para la preparación y esterilización de

materiales de vidrio y posteriormente la utilización de estas.

Conocer los principios generales de las diferentes técnicas de esterilización.Conocer

las partes y el manejo de una autoclave.

II.- ASPECTOS GENERALES:

El material que se emplea en microbiología debe estar perfectamente limpio y estéril.

La limpieza es importante ya que restos de sustancias que permanecen en los tubos,
placas y en otros materiales; pueden impedir el posterior desarrollo de los
microorganismos. La esterilización es fundamental para evitar la presencia de
microorganismos extraños o contaminantes; para ello el material deberá ser
acondicionado de tal forma que mantenga estas condiciones por tiempo indeterminado.

2.1.- MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN:

Existen diferentes métodos de esterilización, se detallan a continuación

a) Calor Directo o flameado. - Consiste en el quemado de ciertos

materiales a lallama de un mechero, como por ejemplo asas de kolle,
pinzas y boca de tubos.

Flameado
b) Ebullición. - Consiste en hacer hervir en agua algunos materiales por un
tiempo de10 a 15 minutos, como tapones de jebe.

Ebullición

c) Vapor sin presión (Tindalización). - La esterilización se produce por el

calor liberado durante la evaporación del agua que posteriormente se
condensa. Este método es empleado para la esterilización de algunos
medios que sufren hidrólisis en temperaturas elevadas. Para realizar este
proceso se emplea la autoclave sin presión (espita abierta).

ESPITA

Autoclave con espita abierta

d) Vapor saturado a presión. - Se emplea la autoclave. Sirve para esterilizar

medios de cultivo, equipos y material de vidrio.

Uso de autoclave para esterilizar

e) Calor seco. - Se emplea el horno o estufa, es utilizado para la esterilización
de material de vidrio y equipo metálico. Los materiales son sometidos a
160°C por 2 horas o 180°C por 30 minutos.

Horno o Estufa

f) Gases. - La esterilización por gases es recomendada para los materiales

que no pueden ser esterilizados por otros métodos, como algunos equipos
quirúrgicos. Losgases empleados son el óxido de etileno y el formaldehído.

Cámara de óxido de Etileno

g) Radiaciones. - Se utiliza los rayos ultravioleta que destruyen principalmente

los ácidos nucleicos, matando los microorganismos. Se utiliza para
esterilizar ambientes de trabajo y sala de operaciones.

Cámara de radiaciones ultravioleta

h) Desinfecciones. - Son productos químicos que actúan ya sea como

bactericida (matan microorganismos) o como bacteriostáticos (inhiben el
desarrollo de los microorganismos). Se emplean para desinfectar la piel y
ambientes de trabajo. Entre los desinfectantes que más se utilizan tenemos:
fenoles, alcoholes, yodo, detergentes y colorantes.
2.2.- ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE CON VAPOR SATURADO A PRESIÓN:

a) Uso. - Se emplea para esterilizar medios de cultivo, materiales de vidrio y

otros materiales resistentes a la acción del calor y presión, en una atmósfera
saturada devapor de agua.

b) Fundamento. - El vapor a presión proporciona temperaturas superiores a la

que se obtiene por ebullición, además de tener otras ventajas como
calentamiento rápido, penetración y humedad en abundancia, lo que facilita
la coagulación de lasproteínas de los microorganismos causando la muerte.

c) Descripción. - El autoclave consiste en un cuerpo cilíndrico que está

dividido, poruna placa perforada, en dos partes:

a) La inferior, denominada reservorio de agua.

b) La superior denominada cámara de vapor.

A este cuerpo cilíndrico va adaptado por la parte superior una tapa que se fija a la
misma mediante una serie de bulones que permiten un cierre hermético. En la misma
tapase dispone de un manómetro que indica la presión y de un termómetro que indica
la temperatura, además de una espita para la purga del aire y de una válvula de
seguridad. En la parte inferior puede o no estar colocado el sistema de calefacción (que
puede ser eléctrico, gas, etc.) que permite calentar el agua.
III.- MATERIALES:

 Tubos de ensayo.
 Placas petri.
 Pipetas.
 Matraces.
 Papel kraft.
 Algodón.
 Pabilo.
 Autoclave.
 Asa de kolle.
 Pinzas.
 Mechero.
 Medios de cultivo.

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Cada estudiante preparará correctamente una pipeta, un matraz y una placa Petri
para ser esterilizada.

4.1.- CONFECCIÓN DE TAPONES DE ALGODÓN:

Tomar un trozo rectangular.

Practicar a lo largo, el doble en tres y enrollarlo transversalmente hasta darle la medida
y diámetro necesario.
El tampón en los tubos de ensayo, matraces u otros recipientes, deben quedar
introducidos en sus terceras partes, no muy ajustadas, ni muy flojos, para evitar la
contaminación y dificultar el manipuleo.
Esquematice los pasos de la preparación
4.2.- PREPARACIÓN DE TUBOS DE PRUEBA:

Para su uso deben estar perfectamente limpios.

Colocar a cada tubo tapones de algodón confeccionados de acuerdo con lo
explicado anteriormente.
Amarrar con un pedazo de pabilo entre 05 a 06 tubos, luego todo el paquete, cubrir
con papel kraft y sujetar con pabilo.

Esquematice los pasos de la preparación

4.3.- PREPARACIÓN DE PIPETAS:

Colocar tapones de algodón a manera de filtro moderadamente ajustadas en laboquilla

de las pipetas, luego quemar el algodón sobrante.
Colocar oblicuamente la pipeta en una tira de papel, haciendo doblez de éste en un
extremo y cubrir la punta de la pipeta.
Deslizar el papel en espiral sobre la longitud de la pipeta hasta la boquilla, hacer
torsión de la tira de papel para permitir la protección completa.
Marcar en el papel datos de medidas de las pipetas.

Esquematice los pasos de la preparación

4.4.- PREPARACIÓN DE PLACAS PETRI:

Las placas se envuelven con trozos rectangulares de papel kraft.

Colocar las placas sobre el papel en posición invertida y doblar los márgenes uno sobre
otro a manera de cubrirla.
Completar el dobles con los extremos del papel sobrante, asegurando bien. Los bordes
de la placa deben quedar íntimamente adheridos al papel, para evitar vacíos.
Esquematice los pasos de la preparación

4.5.- PREPARACIÓN DE MATRACES, BALONES, ETC:

Colocar tapones de algodón, preparados de acuerdo a la indicación anterior.

En seguida cubrir cada material con una capucha de papel kraft y sujetarlo con pabilo.
Cuando se trata de matraz kitasato, se procede como si se preparara un matraz
corriente, pero no se debe olvidar de taponar también la tubuladura lateral ycubrir la
misma con un trozo de papel y asegurar con pabilo.
4.6.- MANEJO DE AUTOCLAVE:

 Verificar que el agua del reservorio alcance el nivel de la placa perforada.

 Colocar los materiales y medios de cultivo preparados en una canastilla y ésta
sobre la placa perforada. Los materiales no deben estar muy juntos para evitar
se obstaculice el libre paso de vapor de agua.
 Cerrar el autoclave constatando que la tapa quede perfectamente
acoplada.Ajustar los bulones en cruz sin apretarlos demasiado.
 Calentar el autoclave, manteniendo abierta la espita (válvula de pura) con la
finalidad de purgar el aparato (expulsar el aire contenido en el autoclave) que se
manifiesta por la salida de un chorro continuo de vapor de agua.
 Cerrar la espita y esperar que el manómetro indique 15 libras de presión
equivalente a 121°C.
 Cuando el manómetro indique 15 libras se debe mantener esta presión durante
15 a 20 minutos.
 Transcurrido este tiempo se interrumpe la calefacción. Se espera que la presión
descienda a 0. Es en este momento se debe abrir la espita que restablece el
equilibrio de las presiones interior y exterior. Después de desajustar los bulones,
abrir la tapa de autoclave, esperar que los materiales se enfríen un poco para
luegoproceder a descargar el aparato.

VI.- CONCLUCIONES:

 logramos aprender la realización correcta de tampones para diferentes tipos de

materiales de laboratorio a base de algodón y en otros casos tela.
 se pudo observar la manera correcta de preparar un tubo de ensayo, como se
muestra en el grafico anterior antes de esterilizarlo.
 Aprendimos a preparar las pipetas de una forma adecuada usando tampones de
algodón y cubriéndolo con papel kraft antes de que estas sean colocadas en un
tubo para la esterilización.
 Aprendimos a preparar la placa Petri usando papel kraft para cubrirlo, para
después esterilizarlo.
 Por ultimo aprendimos a cómo preparar los matraces con un tampón de algodón
y como cubrir la entrada con papel kraft, para esterilizarlo.
 Por ultimo colocamos todos los materiales preparados de una forma correcta a
una autoclave para que sean esterilizados y estén listos para su uso, después de
este proceso es necesario el uso de guantes quirúrgicos y tener mínimo contacto
con ellos.

VII.- CUESTIONARIO:

1. Indique una diferencia entre esterilización y desinfección

 2. Después de haber realizado la esterilización, ¿Cómo estás seguro de
que elmaterial está realmente estéril?
para que la esterilización sea eficaz, la temperatura y el tiempo seleccionados deben
alcanzarse en todo el líquido. Por ese motivo, no conviene esterilizar juntos
recipientes grandes y pequeños, sino seleccionando el volumen del instrumental.
Los recipientes con cierre hermético deben introducirse en la autoclave sin cerrar
totalmente el tapón, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso.
Por último, los recipientes vacíos precisan de un tiempo de esterilización mayor que
los recipientes con líquido en su interior.
3. ¿Cuándo se realiza la esterilización por tindalización?
Es un método de esterilización mediante calentamiento discontinuo (por lo general
de alimentos), que debe su nombre a John Tyndall. Consiste en someter la sustancia
a esterilizar a un proceso seriado de elevación y disminución de la temperatura, de
tal modo que en cada una de esas etapas se eliminen paulatinamente las esporas
presentes a medida que se transforman en gérmenes activos. Se requiere un
mínimo de tres sesiones de elevación y disminución de la temperatura. Todavía se
usa ocasionalmente.
4. ¿Siempre la esterilización es por un tiempo de 15 a 20 minutos?
El tiempo de esterilización usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas
oportunidades, dadas las características del material, es necesario variar el tiempo
de esterilización.
5. ¿Los rayos ultravioleta cómo elimina los microorganismos?
La luz ultravioleta UV-C es efectiva para destruir el material genético de
microorganismos como virus y bacterias. También se ha demostrado que este tipo
de radiación acaba con otros coronavirus como como el del SARS.

VI.- BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

 https://www.tncentro.com/que-diferencia-hay-entre-desinfeccion-y-
esterilizacion/
 https://es.wikipedia.org/wiki/Tindalizaci%C3%B3n
 http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/1
0_Esterilizaci%C3%B3n_por_calor_h%C3%BAmedo.pdf
 https://material-
electrico.cdecomunicacion.es/noticias/sectoriales/40930/por-que-la-luz-
ultravioleta-uv-c-elimina-los-virus-coronavirus-y-bacterias
 https://equipos-biomedicos.com.mx/aprende-a-identificar-un-producto-
esterilizado-2/
 B. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

I.- OBJETIVOS: Logros que deben alcanzar al término de la Práctica.

Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los medios de
cultivo.

Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación del mediode

cultivo en la práctica microbiológica.

Aprender el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus componentes

individuales.

II.- ASPECTOS GENERALES

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, como uno de los factores de
crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el
desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos
es muy amplia; por ello, la variedad de medios de cultivo es también muy grande, no
existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos los microorganismos.

Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita cultivarlos en condiciones

de laboratorio, utilizando medios de cultivo. Un medio de cultivo es formulado en base
a las necesidades nutricionales del microorganismo.

2.1.- CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO:

SEGÚN SU ORIGEN:
Naturales. - empleo de tejidos animales o vegetales como por ejemplo: leche,
sangre, jugo de frutas, etc.
Artificiales Sintéticos. - de composición química definida por ejemplo: NaCl,PO4K2,
etc.
Artificiales complejos. - de composición química no definida por ejemplo peptona,
levadura, etc.

SEGÚN SU NATURALEZA:
Líquidos. - no tiene agar en su composición.
Sólidos. - tienen en su composición agar que le da dureza y consistencia deseada.

SEGÚN SU USO:
Medios básicos. - Son medios que permiten el desarrollo de los microorganismos más
comunes.
Medios enriquecidos. - Son medios básicos, enriquecidos con sustancias como
sangre, extracto de tejidos de animales y plantas.
Medios selectivos. - Son medios que presentan ciertas sustancias químicas
específicas que no permiten el desarrollo de un grupo de microorganismos.
Medios diferenciales. - Son medios que se emplean para demostrar algunas
propiedades bioquímicas de las bacterias, que permiten una rápida identificaciónde
los microorganismos.
2.2.- PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Los microorganismos son seres ubicuos que han colonizado todos los tipos de
ecosistemas: el agua, el suelo, el aire, el resto de los organismos.

Por ello todas las manipulaciones para conseguir cultivos puros se deben realizar en
un ambiente estéril que impida el acceso al medio de otros microorganismos diferentes
a los que deseamos aislar.

Deben crecer dentro de tubos de ensayo, los matraces y las placas de Petri,
previamente esterilizados, ya sea en medio líquido, semisólido o sólido.

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados,

normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la
preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada
del mismo, disolverlo en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo
las instrucciones del fabricante y esterilizarlo.

Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de

componentespreviamente esterilizados en autoclave. Antes de su esterilización, los
medios líquidos en caldo se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o
matraces); en ningún caso el volumen del líquido en el recipiente debe exceder un tercio
del volumen total del recipiente.

Si es un medio sólido, habitualmente se procede a fundir el agar en un baño maría

antes de esterilizarlo. Una vez fundido, se distribuye en caliente en tubos o matraces
(no en placas dePetri), se tapa y se esteriliza.

Finalizada la esterilización en el autoclave:

Los medios líquidos se dejarán enfriar a temperatura ambiente.

Los medios sólidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al solidificarse
adopten la forma de agar inclinado, si tal es su finalidad.
Los medios sólidos que se desea utilizar en placa petri, se realiza el plaquedo vertiendo
el medio aún fundido y estéril dentro de ellas en un ambiente aséptico en la proximidad
de la llama de un mechero Bunsen.
Caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura
ambiente. Sin embargo, para reducir su deshidratación y el consiguiente cambio delas
concentraciones de los componentes es preferible conservarlos a 4°C.

Medios de cultivo deshidratados

2.3.- PLAQUEADO:
El plaqueado consiste en verter el medio de cultivo esterilizado en placas de Petri
esterilizado, tomando en cuenta las siguientes recomendaciones o precauciones:
Desinfectar la zona de trabajo y manos del operador.
Trabajar cerca de la llama de un mechero bunsen.
Quemar la boca del frasco antes y después del uso.
Evitar hablar y corrientes de aire.

2.4.- CONTROL BACTERIOLÓGICO:

Después de realizar el plaqueado se debe colocar las placas con medio de cultivo
solidificado en estufa a 30°C, por 24 horas; con la finalidad de verificar que el medio de
cultivo no haya sido contaminado. Aquellas placas que presentan contaminantes al
realizarel proceso de plaqueado, desarrollan y formar colonias de bacterias u hongos,
las que deben ser descartadas. Las placas sin contaminación serán utilizadas para los
aislamientos

III.- MATERIALES:
Tubos de ensayo.
Placas petri.
Pipetas.
Matraces.
Balones.
Autoclave.
Algodón.
Levadura manitol agar (LMA).
Medio YCDA
Agar Mac Conke
Agua destilada.

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Los medios que prepararemos en prácticas son los siguientes:

4.1.- PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN FORMA GENERAL:

 Pesar la cantidad de sustancias indicadas en la fórmula e ir disolviendo una a
una con la ayuda del calor si es necesario.
 Completar el volumen con agua destilada
 Distribuir los medios preparados en recipientes adecuados (resistentes a la
esterilización) y proceder a la esterilización en autoclave.

4.2.- MEDIO LEVADURA MANITOL AGAR (LMA):

Este medio se emplea para el aislamiento de bacterias de los géneros Rhizobium y
Bradyrhizobium que viven en simbiosis con plantas leguminosas, formando
estructuras llamadas nódulos.
Composición:
Preparación del agua de levadura: Disolver 10 gr. de levadura seca en 100 ml. de agua
destilada, luego se esteriliza en autoclave por 30 a 60 minutos a 15 libras de presión,
dejar reposar unos días y decantar el sobrenadante (líquido amarillento).

Preparación:
- En un recipiente adecuado se coloca 900 ml. de agua destilada, se disuelve 10
gr. de manitol y luego se añade los diferentes reactivos más los 100 ml. de agua
de levadura. Si se utiliza extracto de levadura se debe utilizar 1 lt. de agua
destilada.
- A todo este conjunto se le aplica el agar y se somete a fuego lento, hasta que
elagar quede completamente disuelto.
- Repartir el medio en matraces o balones y esterilizar en autoclave por 20
minutos a15 libras de presión.
- Después de la esterilización agregar 10 ml. de la solución de rojo congo y
procedera plaquear el medio.

4.3.- MEDIO YCDA:

Este medio se emplea para el aislamiento de bacterias que atacan plantas.
Ejm.
Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia, Agrobacterium, etc.

Composición:
Extracto de levadura 10 gr.
Dextrosa 20 gr.
Carbonato de Calcio 20 gr.
Agar 18 gr.
Agua destilada Completar hasta 1 lt.
Preparación:
 Disolver el agar y luego agregar el extracto de levadura y la dextrosa, al final se
agrega el carbonato de calcio.
 Esterilizar en autoclave durante 20 a 30 minutos a 15 libras de presión
 Al momento de plaquear mover el medio para que se distribuya
uniformemente elcarbonato de calcio.

4.4.- MEDIO AGAR MAC CONKEY:

Este medio se emplea para el aislamiento de coliformes (Shiguella y Salmonella) de
leche,agua y otras sustancias contaminadas con heces.
Composición:
Medio comercial Mac Conkey 50
gr.Agua destilada 1 lt.
Preparación:
 Disolver 50 gr. del medio en 1 lt. de agua destilada tibia.
 Repartir el medio en balones o matraces de capacidad requerida.
Esterilizar durante 15 ó 20 minutos a 15 libras de presión.
 Distribuir el medio estéril en placas a razón de 20 a 25 ml.
4.5.- MEDIO DE CULTIVO AGAR PAPA DEXTROSA PARA EL AISLAMIENTO DE
HONGOS:

Composición:
Trozos de papa pelada 250 gr.
Azúcar (sacarosa) 10 gr.
Agua destilada 1000 ml.
Agar 18 gr.
Preparación:
 Hierva la papa en 500 ml de agua por 30 minutos, mientras disuelve el agar
enotros 500 ml, filtre el caldo de papa con pedazo de algodón o gasa.
 Junte las dos preparaciones, agregue y disuelva el azúcar y sustituya el agua
hastacompletar 1000 ml., esterilice y distribuya en placas de Petri.

4.6.- PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE

HONGOS:
COMPOSICIÓN:
Maicena 1.0 gr.
Azúcar blanca 20.0 gr.
Agua de levadura 200.0
mL.Agar 18.0 gr.
Agua destilada 1.0 Lt.
PREPARACIÓN:
1. Disolver el agar en 700 ml de agua destilada.
2. Luego añadir cada uno de los componentes según el orden indicado en la
composición.
3. Ajustar el pH a 5.5 a 6.0
4. Esterilizar en autoclave por 20 minutos y plaquear.
V.- RESULTADOS:
No existen resultados en esta práctica, por ser expositivo.
VI.- CUESTIONARIO:
1 ¿Qué equipos utilizaría para la esterilización de los medios de cultivo?

El equipo que se usa para esterilización se denominan autoclaves, formados por

un recipiente o cámara de esterilización de paredes gruesas y cierre hermético
que permite usar vapor a presión y temperatura elevada.

2 Explique ¿por qué los medios de cultivo deben ser sometidos a un

controlbacteriológico antes de su uso?

los medios de cultivo constituyen la herramienta fundamental en los laboratorios

de Microbiología, por lo que realizar pruebas de control de calidad a los medios
preparados es vital, con el fin de comprobar si estos cumplen con sus
especificaciones y si la metodología empleada en su preparación es
satisfactoria.
 3 ¿Qué medios de cultivo se utilizarían para el aislamiento de
microorganismos del suelo?
Para el aislamiento de microorganismos se pesa la tierra en gr y se diluye en ml
de agua peptona estéril (10-1), se homogeniza y se deja reposar un momento
para que los sólidos se decanten. A partir de esta solución se realizan dos
diluciones más (10-2 y 10-3) en agua peptona estéril. Para hacer la siembra se
toma 1 ml de cada dilución y se pone cada una en agar nutritivo con ayuda de un
asa de drigalsky. Finalmente se incuba las placas a temperatura ambiente por 7
días y se evalúa su crecimiento.

4 ¿En qué casos se utiliza medio semisólido o medio líquido?

Semisólido: En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o

no móvil, ya que en el primer caso se observará que el crecimiento difunde
alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose turbidez. Los
microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la picadura.
Este tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro método de
conservación de
microorganismos anaerobios facultativos.
Liquido:
En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto, no
sirven como técnica de aislamiento. La utilización de medios de cultivo líquidos
permite la obtención de una población microbiana grande, con un elevado número
de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. En estos cultivos se
examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de
una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del
tubo, etc.

VIII.- BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

 https://quercuslab.es/blog/esterilizacion-del-material-de-laboratorio/
 http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1561-
30032013000200004
 https://revistas.unilibre.edu.co/index.php/mente_joven/article/view/3666
 https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/182684/mod_resource/
content/1/2019%20TP2%20Farmacia.pdf