Bioquimica Previo 6

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN LABORATORIO DE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOQUIMICA MICROBIANA SEMESTRE: 2021-I
SECCIÓN BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA HUMANA TÉCNICAS DE AISLAMIENTO QUÍMICA INDUSTRIAL
Y MORFOLOGÍA COLONIAL
Nombre: Equipo:
Fecha:
1. ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA, CUESTIONARIO PREVIO.
1.1 MENCIONAR TRES TÉCNICAS UTILIZADAS PARA AISLAR MICROORGANISMOS EN

PLACA DE AGAR.
Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:
2.1 Métodos generales
2.1.1. Por diseminación en la superficie de un medio sólido en placa de Petri.
Es la técnica más utilizada. Con un ansa de siembra, calentada al rojo vivo en el mechero y enfriada cerca del mismo, se
toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre la superficie de la placa con el medio agarizado,
pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se lleva la placa a incubar a la temperatura adecuada, siempre en posición
invertida lo que evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención
de colonias aisladas. Mediante estas técnicas se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un
elevado número de bacterias. Existen distintos tipos de trazados tendientes a lograr una buena separación entre los
gérmenes sembrados. Se puede sembrar por:
I. Agotamiento de ansa: Se flamea el ansa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se
realizan estrías en dos placas en forma consecutiva sin recargar el ansa.
II. Depósito y posterior quemado: Se carga el ansa con la muestra y las estrías se extienden sobre un área
pequeña de la superficie de la placa. Se retira el ansa, se quema a la llama, y luego de enfriarla en el interior
de la placa se hacen nuevas estrías por otra zona tocando ligeramente la muestra sembrada anteriormente.
Este proceso puede repetirse sucesivamente, flameando y enfriando el ansa al comienzo de las sucesivas
siembras en estría, de acuerdo a la carga inicial de microorganismos. Tras la incubación, se observarán las
colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada, donde se puede estudiar la morfología colonial.
III. Dilución previa en solución fisiológica o caldo: Se toma la muestra para aislar y se la resuspende en
solución fisiológica o caldo nutritivo, preparando luego diluciones seriadas decimales en condiciones
asépticas. Se toman las diluciones y se estría con ellas una placa para cada una. En la dilución adecuada se
obtendrán colonias aisladas.
IV. Extensión en superficie con espátula de Drigalski: Aquí también pueden prepararse diluciones decimales.
Se deposita sobre la superficie de la placa una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de
microorganismos y se extiende con ayuda de la espátula, previamente esterilizada por flameado, en todas
las direcciones hasta que esté completamente seco.
Tras el período de incubación las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha
realizado de forma correcta. Podrán diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc. Esta
técnica de siembra, además de permitir el aislamiento de colonias, permite el recuento de bacterias viables en la
muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.
2.1.2 Mezclas.
Esta técnica tiene la ventaja de permitir el cálculo del número de bacterias presentes en la muestra, si se trabaja con
exactitud. Se realizan diluciones seriadas de la muestra y se coloca en tubos estériles, por separado, el mismo volumen
de cada una. Luego se vierte en el tubo, medio de cultivo fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. El contenido
se homogeneiza por rotación, y luego se lo vierte sobre la superficie de una placa de Petri. Tras la homogeneización, se
dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada
(siempre en posición invertida). 7 Otra variación de esta técnica consiste en depositar en una placa de Petri vacía un
pequeño volumen conocido de muestra y a continuación añadir el medio de cultivo fundido y atemperado, mezclando
por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán homogéneamente en el medio de
cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en la superficie tendrán distintas
características, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la
superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de
distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian
unas de otras por su morfología. Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza
para determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o
microaerófilos.
2.2 METODOS ESPECIALES
Se basan en las características del germen que se quiere aislar. Hay que tener en cuenta que puede haber gérmenes que
poseen idénticos comportamientos frente a un mismo agente físico o químico.
I) Calentamiento: se utiliza para el aislamiento de gérmenes esporulados de los no esporulados. Consiste en

calentar la suspensión a 100ºC durante 10 min. y 85ºC durante 15 o 30 min. Luego se siembra en medios
sólidos.
II) Agregado de álcali o ácido: tratamiento de la muestra con algunos de estos agentes ya que existen
microorganismos que los resisten y otros que no.
III) Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos temperaturas distintas

IV) Cambios en el pH: existen unos pocos gérmenes que pueden crecer en medios con pHs extremos.
V) Presencia de sales o colorantes: debido a la capacidad de distintos microorganismos de crecer o no en medios

con sales, sustratos, colorantes o antibióticos, se utilizan distintos medios de cultivo con el fin de lograr su
aislamiento.
1.2 INDICAR TRES TÉCNICAS PARA HACER RECUENTO DE MICROORGANISMOS

El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana.
- Conteo en placa de Petri. Método más usado para contar bacteriano. Se prepara un caldo de cultivo, el
cual posteriormente se vierte en las placas de petri. Es de suponerse que cada célula o grupo de células
presentes en la muestra se reproducirá en sus múltiples alrededores para producir "colonias de células"
separadas en el agar. Cada colonia es llamada unidad formadora de colonias (UFC).
- Conteo de Filtración. Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en casos de
lagos y arroyos relativamente puros. En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua que
atraviesen una membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeños que no permitan el paso de
bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie del filtro.
Posteriormente el filtro es transferido a una caja de petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual las
colonias surgen de las bacterias en la superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este
método son distintivas cuando ocupan un medio diferencial.
Este método es aplicado frecuentemente en la detección y enumeración de bacterias coliformes, las
cuales son indicadores de contaminación fecal en la comida o en el agua.
- Método más probable (NMP). Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor
número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el
punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de dilución. Muestras microbianas
son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas formado en la fermentación
y da un estimado de número de células. Este método es más útil cuando las bacterias que están siendo
contados no crecerán en medios sólidos, como en el caso de las bacterias nitrificantes quimioautótrofas.
También es útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio líquido diferencial, usado para
identificar microbios, como en bacterias coliformes. El NMP es la única afirmación en la cual existe 95% de
probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto, siendo el número estadístico más
probable.
- Determinación directa por microscopio
- Las células se pueden contar en un frote teñido, como es el caso del Método de Breed, colocando en la
preparación un volumen conocido de la suspensión de células sobre un área conocida del portaobjetos.
Después de haber fijado y teñido el frote, es posible contar con un microscopio las bacterias.
- Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células en unos cuantos campos
microscópicos seleccionados al azar. Si el diámetro del campo microscópico se mide con micrómetro
objetivo, se puede calcular fácilmente el área, entonces el número de campos en 1 cm² se multiplicará por
el promedio del número de células por campo y después por 100 (si se vierte 0.01 mL) el resultado será
igual al número de células por mililitro. Este método es susceptible a muchas críticas debido a su falta de
uniformidad al momento de hacer el frote.
- Método de turbidez
Para algunos experimentos, es necesario estimar turbidez, ya que es una forma práctica de monitorizar el
crecimiento bacteriano. Como una bacteria se multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de
aspecto nublado por las células. El instrumento usado para medir la turbiedad es
un espectrofotómetro (colorímetro). En el espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la
suspensión bacteriana a un detector sensible a la luz. Mientras incremente el número de bacterias, menor
será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se registrará en la escala del instrumento como
el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión logarítmica llamada absorbancia (algunas
veces nombrada densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser
reportado. Más de un millón de células por mililitro deben estar presentes para que la primera señal de
turbidez sea visible. Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de células por mililitro son
necesitadas para hacer una suspensión suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La
turbidez no es útil para medir contaminación en líquidos por la pequeña cantidad relativa de bacterias.
- Determinación del peso seco en las células
Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y probablemente el más
fácilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar sólo en suspensiones celulares muy densas y
las células deben ser lavadas muy bien para removerles todo material extra. Se utiliza para bacterias
filamentosas y mohos. En este proceso, el fungus es removido del medio de crecimiento, filtrado para
remover material extraño, drenado en un secador y después es pesado.
1.3 ¿QUÉ ES UNA CEPA?

Una cepa, en microbiología, es una población de microorganismos de una sola especie descendientes de una
única célula o que provienen de una determinada muestra en particular, la que usualmente es
propagada clonalmente, debido al interés en la conservación de sus cualidades definitorias. De una manera más
básica puede definirse como un conjunto de especímenes bacterianos o virales que comparten, al menos, una
característica o variante genética.
1.4 ¿QUÉ ES UNA COLONIA?
En microbiología, se denomina colonia la agrupación de un conjunto de microorganismos de un mismo

tipo. Algunos microorganismos que forman colonias son las bacterias, los hongos y los protozoos o
protozoario.
1.5 ¿QUÉ ES UN CULTIVO AXÉNICO?
Un cultivo axénico está formado por una única especie, cepa o variedad de organismo, y por lo tanto está
desprovisto de otros organismos contaminantes. Los cultivos axénicos son muy extraños en la naturaleza. En los
medios naturales como el suelo, agua, o en el cuerpo humano, existen cultivos mixtos que consisten en muchas y
diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en un laboratorio.
Tener un cultivo axénico permite facilitar el estudio de ciertos microorganismos. Sin embargo, presenta
dificultades al no considerar los cambios fisiológicos y morfológicos que pueden tener estos organismos al no
encontrarse en su cultivo natural.
1.6 INDICA EL VOLUMEN DEL ASA NEGRA Y DEL ASA ROJA:
Microlitro UL
https://viresa.com.mx/asa-bacteriologica-de-nicromo-negra-calibrada-10ul-var--p6500
1.7 ¿QUÉ ES UN BANCO DE DILUCIÓN?
Técnica de aislamiento y recuento: Banco de diluciones

Esta técnica nos permite un doble objetivo, el aislamiento de colonias y además el recuento de los
microorganismos que tenemos en el cultivo inicial.
Se trabaja con cinco tubos con suero fisiológico estéril, uno de ellos con 10 ml y el resto con 9 ml, en el
orden que se muestra en la figura. Mediante una pipeta estéril tomar 1 ml del cultivo mixto y depositarlo en el
primer tubo. Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea. Tomar otra pipeta estéril y de este primer
tubo transferir 0,1 ml al segundo tubo, agitar y repetir la operación transfiriendo 1ml del segundo al tercer
tubo, del tercero al cuarto y del cuarto al quinto.
Una vez realizado el banco de diluciones procederemos a sembrar de los tres últimos tubos (diluciones 104,
105 y 106) 0,1 ml en placas de agar nutritivo, mediante la técnica de siembra por extensión (ver video). Se
depositan los 100 microlitros en la superficie del agar y se debe extender la muestra en toda la superficie del
mismo, utilizando para ello el asa de vidrio.
Para esterilizar el asa de vidrio, en primer lugar se introduce en alcohol y se flamea encendiéndola con la
llama del mechero bunsen. Dejar que se consuma la llama y abriendo la placa lo justo para introducir el asa,
extender la muestra arrastrándola con
la base del triángulo por toda la superficie del medio hasta que éste absorba toda el agua. Incubar a 37ºC
durante 24 horas y realizar el recuento de las colonias calculando la concentración de células en el tubo
inicial mediante la fórmula:
1.8 ¿QUÉ ES UN NEFELÓMETRO Y A CUÁNTO EQUIVALE EL 0.5?
Un es un instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido o en un gas, para lo que utiliza
una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente luminosa. La unidad nefelométrica de
turbidez, (UNT) expresada habitualmente con el acrónimo NTU del inglés Nephelometric Turbidity Unit, es una
unidad utilizada para medir la turbidez de un fluido, sólo líquidos y no aplicable a gases o atmósfera.
os estándares de turbidez de McFarland se usan como referencia en suspensiones bacteriológicas para saber
que el número de bacterias por mililitro, o más bien en UFC según una escala que va de 0.5 a 10. s. El patrón de
McFarland más utilizado es al 0.5% y corresponde aproximadamente a una suspensión homogénea de 1.5 x 108 celulas
bacterianas por ml.

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1. ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRÁCTICA, CUESTIONARIO PREVIO.

1.1 MENCIONAR TRES TÉCNICAS UTILIZADAS PARA AISLAR MICROORGANISMOS EN

I) Calentamiento: se utiliza para el aislamiento de gérmenes esporulados de los no esporulados. Consiste en

III) Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos temperaturas distintas

V) Presencia de sales o colorantes: debido a la capacidad de distintos microorganismos de crecer o no en medios

1.2 INDICAR TRES TÉCNICAS PARA HACER RECUENTO DE MICROORGANISMOS

1.3 ¿QUÉ ES UNA CEPA?

1.4 ¿QUÉ ES UNA COLONIA?

En microbiología, se denomina colonia la agrupación de un conjunto de microorganismos de un mismo

1.6 INDICA EL VOLUMEN DEL ASA NEGRA Y DEL ASA ROJA:

Técnica de aislamiento y recuento: Banco de diluciones

1.8 ¿QUÉ ES UN NEFELÓMETRO Y A CUÁNTO EQUIVALE EL 0.5?

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