FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

TALLER No 1

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS EMPLEADOS EN MICOLOGIA

INTRODUCCION

Los hongos, como las bacterias, pueden ser aislados en medios de cultivos naturales o sintéticos.
Estos aislamientos se observan como colonias con características macroscópicas y microscópicas
que sirven para la identificación del género y muchas veces de la especie.

Gran parte del éxito en el aislamiento y la identificación de los hongos depende de la adecuada
preparación, almacenamiento y utilización de los medios de cultivo y de los reactivos. Estos
procedimientos deben seguir las normas establecidas de cantidad, tipo de solvente, esterilización y
almacenamiento.

Los medios de cultivo utilizados en micología son sólidos o líquidos. Pueden ser simples,
diferenciales, selectivos y enriquecidos, entre otros. El laboratorista debe utilizar un medio de
acuerdo con el resultado que necesite obtener: aislamiento primario, identificación bioquímica o
determinación de otras características.

El tiempo de crecimiento de los hongos en el medio adecuado varía de acuerdo con su género y
especie; por ejemplo los mohos aseptados tardan de 24 a 48 horas, las levaduras de 3 a 5 días, los
dermatofitos de 10 a 20 días y los agentes de las micosis profundas pueden tardar de 4 a 5 semanas.
Esto debe tenerse en cuenta para el seguimiento y el informe oportuno del resultado.

OBJETO DE ESTUDIO
Medios de cultivo, reactivos y coloraciones de uso en micología

OBJETIVOS DEL TALLER:

 Identificar los medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados en el estudio de los
hongos y el diagnóstico de enfermedades micóticas
 Distinguir el uso de los diferentes medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados
en el laboratorio de micología
 Conocer el fundamento de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones utilizadas en
micología

COMPETENCIAS A ADQURIR POR EL ESTUDIANTE

El estudiante conoce el fundamento y uso de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones
utilizadas en micología.

METODOLOGIA:
 Desarrollo y socialización del cuestionario
 Presentación del profesor: examenes directos con diferentes reactivos y coloraciones,
crecimiento de colonias de hongos en diferentes medios de cultivo, estructuras observadas a
partir de cultivos con reactivos específicos para este uso.
 Uso de la información para la elaboración del primer informe práctico.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué ventajas proporciona la implementación de un estricto control de calidad de medios

de cultivos y reactivos en el laboratorio de micología?
- Evita falsos negativos y falsos positivos, asegura el diagnóstico y confirma un pronóstico
- Permite que los resultados emitidos por el laboratorio sean confiables.
- ¿cómo se hace?

. El sitio de preparación debe ser completamente estéril, se deben respetar las concentraciones o
cantidades de sus componentes (soluto y solvente), el Ph debe ser el adecuado entre 5 y 6

2. ¿Cómo se realiza el control de calidad interno de las diferentes tinciones que se utilizan
para el examen directo de muestras sospechosas para investigación de hongos?

Examen en fresco con clarificación por KOH

En el momento de su preparación comprobar su actividad por la capacidad de disolver una porción

de muestra de esputo, ya que el KOH lo que hace es disolver las estructuras, las proteínas de la
pared micótica, se usa esputo porque tiene muchas proteínas, lípidos etc. Por lo que es un buen
control
En el momento del uso diario hay que realizar un control visual macroscópico de ausencia de
precipitados y de contaminación.

Tinción de blanco de calcofluor

Los controles se realizan cada vez que se prepara un lote nuevo de reactivo y cada vez que se
realiza la tinción. Utilizar Candida albicans en suspensión acuosa para el control positivo y una
suspensión en solución salina de Escherichia coli para el control negativo.

Es una tinción fluorescente con gran afinidad por la quitina de la pared fúngica que no requiere
fijador ni medio de transporte para su análisis, por lo que su interpretación puede ser inmediata. Se
usa para hongos filamentosos (mohos) que NO se tiñen con Gram. Ej: Aspergillus, Penicillium

Tinción de tinta china para la observación de la cápsula polisacárida de Cryptococcus spp.

 Cada vez que realicemos la técnica comprobar la esterilidad del reactivo y añadir un control positivo a partir
de una suspensión acuosa de Cryptococcus albidus.

Tinción con azul de lacto fenol

Hay que comprobar la esterilidad del reactivo cada vez que se utilice. Es una tinción que se utiliza con un
doble propósito, como tinción y como solución de montaje. Sus componentes actúan matando al hongo pero
preservando la estructura al mismo tiempo que se tiñe de azul.
No es necesaria la utilización de controles positivos y negativos, es suficiente con comprobar que las
estructuras fúngicas se tiñen de color azul.

3. ¿Diga tres condiciones que se deban cumplir para contar con un medio de cultivo de calidad
adecuada?

- Concentración alta de carbohidratos y una fuente de nitrógeno

- El Ph debe oscilar entre 5 y 6
- Temperatura de incubación entre 15 y 37 °C
- Esterilidad
- Temperatura de almacenamiento:

4. Las condiciones ambientales requeridas para desarrollar los ensayos relacionados con la Micología
Médica son similares a las de cualquier laboratorio de Microbiología. Sin embargo, existen ciertas
peculiaridades que deben considerarse a la hora de realizar la manipulación de muestras clínicas y de
hongos patógenos. ¿Qué consideraciones de bioseguridad y de limpieza deben tenerse en cuenta en
el laboratorio de micología?
- Si se sospecha que la muestra proviene de un paciente con infección por un hongo de nivel de
peligrosidad 3, el laboratorio debe contar con las condiciones de bioseguridad nivel 3 para
procesar esa muestra, además para los cultivos de hongos filamentosos se debe contar con una
cabina de bioseguridad para evitar contaminaciones cruzadas dentro del laboratorio.
- Hongos nivel 3: C, neoformanas, histoplasma capsulatum
- La limpieza en las zonas de cultivos se realiza con etanol al 70%
- Las estufas con halacid al 1%, bencilbenzoato al 20% ó con formalina si está permitido.

5. Revise la información acerca de los medios de cultivo, reactivos y coloraciones empleados en

micología y agrúpelos con base en su uso y/o características afines

Clasificación Medios
Aislamiento primario Agar sabouraud dextrosa, agar sabouraud modificado, agar sangre, medio de kamiski
modificado, medio de borelli, agar chocolate.
Identificación bioquímica Gelatina líquida, gelatina al 12%, medio de leche desnatada, tiamina para dermatofitos,
agar arroz para dermatofitos.
Medios de esporulación Medios de vitamina, agar kamiski modificado, agar harina de maíz, czapeck almidón agar,
agar arroz, medio de arroz
Crecimiento de formas sexuadas Medio de papa zanahoria, agar harina de maíz, agar ascosporas

Mohos negros agar harina de maíz (cornmeal agar), gelatina al 12%, czapeck
Medios de reversión Medio de Kelly.
Medios diferenciales Azúcares al 1%, medio modificado de wickerham, papa dextrosa agar (PDA)
Medios de placa para cultivos Medio de gel agar, cultivo de Jelly

Medios formadores de clamidiosporas. Medio de leche, agar harina de maíz, medio para clamidiosporas.

Medios para levaduras Chromagar, medio de leche, Sabouraud simple. Agar sangre, medio , agar harina de maíz,
medio para clamidiosporas, agar chocolate, medio Wickerham, Agar ascosporas

Medios para dermatofitos Agar sangre, Gelatinaliquida, Medio Xantina Hiposantina, medio
leche desnatada, agar gelatina al 12% Para dermatofitos, Medio de
arroz, Kaminsky, medio con vitaminas, medio de tiamina, tiamina
para dermatofitos, Sabouraud modificado

Medios actinomicetos Agar sangre, Gelatinaliquida Medio Xantina Hipoxantina el leche

desnatada, agar gelatina al 12%

Mohos negros: Cladosporium spp, Epicoccum spp, Sporobolomyces spp, Stemphylium spp
Medio de Jelly: para el montaje de placas de cultivo
Agar urea de Christensen: para diferenciar criptococcus de otras levaduras

En el Gram las levaduras se ven gram positivas, moradas

Clasificación Tinciones y colorantes

Examen directo – montajes Rojo Congo, liquido Erlisse, calcoflúor blanco, azul de lactofenol es
húmedos a partir del cultivo, negro de clorazol, Tinta china, Hidróxido de
potasio (KOH al 10%9y nigrosina
Histopatológicas Hematoxilina y eosina, PASD (ac peryodico de Schif),Plata
metenamina de Gomori, Fontana Mason, Mucicarmina de Meyer,
Plata Metenamina de Gomori
Cápsula Tinta china, nigrosina, azul de Alcian
Extendidos hematológicos Diff quik , variante de las Rowmanosky, Wright y Giemsa
Histoplasma y malassezia Wright y Giemsa
spp
Nocardia Ziehl Neelsen, Kinyoun
Blastoconidias Gram

Diagnóstico diferenciales Acido Peryodico de schiff, Hidróxido de Potasio con azul de Evans,
Con fluorescencia Blanco de calcoflour - Rojo Congo

6. ¿Cuál es el pH óptimo de los medios de cultivo para hongos?

¿Qué efecto adicional positivo tiene este pH en el aislamiento de los hongos?

El Ph óptimo de los medios de cultivo para hongos es entre 5 y 6, adicionalmente este Ph inhibe el
crecimiento bacteriano que puede contaminar el cultivo.

7. Diga en el diagnóstico de qué tipo de infecciones micóticas son útiles los medios cromogénicos?
- En infecciones mixtas y en infecciones por levadduras
Verde: C, albicans
Azul: C, tropicali
Rosadas: C, krusei

8. En el diagnóstico de las micosis, diga cuál es el aporte de los hemocultivos automatizados por el
método de lisis centrifugación?

- El aporte de …. Es que disminuye el tiempo de reporte de resultados especialmente en micosis

invasoras o fungemias.
- Consiste en un tubo de lisis cuyo contenido es polianetol sulfonato de sodio como anticoagulante,
saponina como agente lítico de eritrocitos, leucocitos y macrófagos, polipropilenglicol como
antiespumante y un fluoroquímico inerte de alta densidad. Luego se somete a la muestra a una
centrifugación a alta velocidad que permite la concentración de microorganismos en el sedimento
que se siembra en medios de cultivo específicos. En general, este método permite mejorar en un 25 a
50% la detección de hongos levaduriformes y filamentosos

9. Cómo haría el control de calidad del medio Agar sabouraud dextros-SDA

- Medio de cultivo color ámbar, transparente, sólido y sin precipitado, con un ph de 5.6 + o – 2. Para el
control de crecimiento se usa candida albicans, saccharomyces cerevisiae, aspergillus brasiliensis,
trichophyton mentagrophytes y para el de inhibición S, aureus y E, coli.

10. Por qué el medio SDA modificado debe utilizarse simultáneamente con otros medios?

- El medio SDA modificado debe usarse junto a otros medios porque inhibe muchos hongos de
importancia clínica al contener cicloheximida, como Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans,
Aspergillus spp, penicillium spp y mohos aceptados.

11. Al momento de realizar un cultivo, cómo aprovecharía las diferencias existentes en la composición
del sabouraud simple y el sabouraud modificado?

- Aprovecharía esas diferencias dependiendo la muestra que vaya a procesar, si es una muestra de un
lugar con contaminación bacteriana usaría el SDA modificado, ya que posee cloranfenicol que inhibe
muchas bacterias. Si la muestra es de un sitio con poca o ninguna contaminación bacteriana (estéril)
usaría el SDA simple.
- El SDS contiene mas dextrosa 40%, por lo que inhibe algunas bacterias y algunos hongos, se usaría
para aislar tanto patógenos cómo no patógenos. El medio SDM tiene 10% de dextrosa y posee
cloranfenicol que inhibe el crecimiento bacteriano y cicloheximida que inhibe a hongos saprofitos,
por lo que se usaría para aislar hongos patógenos.

12. Mencione la utilidad de los componentes de la tinción de azul algodón de lactofenol.

- Es útil para observar estructuras fúngicas provenientes de cultivos, son permanentes y se pueden
sellar con esmalte de uñas por un año.
- Fenol. Mata al hongo
- Ácido láctico: agente aclarante que preserva la estructura del hongo
 - Glicerina: previene la desecación
- Azul de algodón: colorea la quitina y celulosa del hongo

13. Al procesar el examen directo y cultivo para estudio micológico de una muestra clínica, qué
diferenciación haría usted en el uso del KOH al 10% y el azul de lacto fenol?

– para el examen directo (muestras con material queratínico, raspados de córnea) se usa el KOH al
10% y para el cultivo el azul de lactofenol

14. Revise el fundamento de las siguientes coloraciones: Ácido peryodico de Schiff (PAS), calcofluor
blanco, plata- metenamina de Gomori (GROCOTT)

- Ácido peryodico de Schiff: Este método esta basado en la propiedad que tienen los
mucopolisacáridos neutros,presentes en la pared celular de los hongos, de oxidarse en presencia del
acido peryódico al formar aldehídos. Estos aldehídos fijan la fucsina de schiff, que recobra su color
rojo en presencia de ellos.

Oxida los mucopolisacaridos de la pared formando aldehídos, estos fijan la fucsina de schif se tiñe de rojo el
hongo.

- Calcofluor blanco: Es un colorante fluorocromico que se une a la quitina y celulosa de la pared de

los hongos. Los organismos transmiten una fluorescencia cuando se excitan con luz UV (mayor de
410-450 nm) por lo que se necesita un microscopio de fluorescencia. El fluorocromo se puede
mezclar con KOH para limpiar la muestra y facilitar la observación de elementos fúngicos. Es
sensible en el examen directo en muestras con poca carga microbiana como las queratitis micoticas.

- plata- metenamina de Gomori (GROCOTT): Entre las coloraciones especiales para hongos la plata
metenamina es la másempleada. La reacción tintorial está basada en que en presencia de ácido
crómico los grupos hidroxilo de los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a
aldehídos; estos, a su vez reducen el complejo nitrato-plata metenamina produciendo la coloración
café a negro, debido al depósito de la plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos.

El ácido crómico oxida los hidroxilos de los polisacáridos de la pared dando aldehídos, estos reducen el
complejo plata metenamina dando un color marron

15. Diga el fundamento y uso del medio CHROMagar Cándida

- Este medio es usado para diferenciar cultivos mixtos. Se basa en la detección de la actividad
enzimática de las levaduras mediante la hidrolisis de sustratos cromo- génicos que darán un color
específico si la enzima está presente.
- La peptona es la fuente de nitrógeno en el medio, la glucosa es la fuente de energía. La
diferenciación entre las especies del género Candida se logra a través de los sustratos cromogénicos
contenidos en el medio de cultivo, sobre los que actuarán las enzimas hexosaminidasa, glucosidasa
y fosfatasa alcalina

Verde: C, albicans
Azul: C, tropicali
Rosadas: C, krusei
 16. ¿Cuál es la función del tween80 en los medios de cultivo para hongos?

- En los medios de cultivos para hongos el Tween 80 (o polisorbato 80) es agregado estimular la
formación de Clamidoconidias, esto gracias a la presencia de ácidos oleicos.

17. Cual es la sensibilidad del KOH al 10% para la identificación de hongos en los exámenes directos?
- Alta en el diagnóstico de las onicomicosis 61% y en la pitiriasis versicolor 78%
- Baja en histoplasmosis y neumocistosis

BIBLIOGRAFÍA:

Gómez B, Tobón A y Restrepo A. Fundamentos de las micosis humanas. Corporación de investigaciones

biológicas. Primera edición. 2018

Arenas R. Micología Médica. McGraw-Hill Interamericana. Quinta Edición. 2014

Bonifaz A. Micología Médica Básica. McGraw-Hill Interamericana. Cuarta edición.

Arango M. y Castañeda E. Micosis Humanas:Procedimientos de diagnóstico. Exámenes Directos CIB –

INS. 2003

Kwon-ChungK. Medical Mycology. Lea y Febiger. Philadelphia – London 1992

López R. Micología Médica: Procedimientos para el Diagnóstico de laboratorio. México: Editorial

Trillas; 2012

Micología Médica. Manual de Laboratorio. Universidad de Antioquia. Facultad de Medicina.

Departamento de Microbiología y Parasitología

Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiología Clínica. Disponible en:
http://www.seimc.org/contenidos/gruposdeestudio/gegmic/dcientificos/documentos/gegmic_dyc1_2004.p
df