Pelet Trichoderma

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
DESARROLLO DE CUATRO PROTOTIPOS DE BIOFORMULACIONES EN

BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum
Trabajo de titulación previo a la obtención del Título de Ingeniera Agrónoma
AUTORA: Perdomo Quishpe Cynthia Estefania

TUTOR: Ing. Agr. Caicedo Chávez Jorge David, M.Sc.
QUITO, octubre 2018

DERECHOS DE AUTOR
Yo, CYNTHIA ESTEFANIA PERDOMO QUISHPE, en calidad de autora y titular de los

derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: DESARROLLO DE CUATRO
PROTOTIPOS DE BIOFORMULACIONES EN BASE A CONIDIAS DE
Trichoderma asperellum modalidad presencial, de conformidad con el Art. 114 del
CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,
CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador
una licencia gratuita, intransferible y exclusiva para el uso, no comercial de la obra, con fines
estrictamente académicos. Los derechos de autor me corresponden y seguirán a mi favor,
con excepción de la presente autorización de conformidad con lo establecido en los artículos
5, 6, 8, 19 y demás pertinentes de la LEY DE PROPIEDAD INTELECTUAL y su
reglamento.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización
y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por
cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad
de toda responsabilidad.
Cynthia Estefania Perdomo Quishpe

C.C.: 1719685776
stefyq-perdomo@hotmail.com
ii
APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por CYNTHIA ESTEFANIA

PERDOMO QUISHPE, para optar por el Grado de Ingeniera Agrónoma; cuyo título es:
BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum, considero que dicho trabajo reúne los
requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por
parte del tribunal examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 28 días del mes de junio de 2018
____________________________________
Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc.
CC. 1719050682
DOCENTE-TUTOR
iii
BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum
APROBADO POR:
Ing. Agr. Jorge Caicedo, M. Sc. __________________________

TUTOR
Lic. Diego Salazar, Mag. __________________________

PRESIDENTE DEL TRIBUNAL
Ing. Agr. Clara Iza, M. Sc. __________________________

PRIMER VOCAL
Ing. Agr. Christian Tamayo, M. Sc. __________________________

SEGUNDO VOCAL
2018
iv
DEDICATORIA
Este trabajo de titulación lo dedico a Dios y a mis padres Rosa y

Luis, por su amor, ejemplo, esfuerzo e incondicional apoyo
durante mi formación personal y profesional. A mis hermanos,
Alex y Mishel por brindarme constante ánimo y permanecer
siempre a mi lado.
A mis sobrinas Katherine y Danna quienes son la fuerza adicional

que me impulsa a ser mejor día a día y al amor, por motivarme a
cumplir todos mis anhelos con paciencia y dedicación
recordándome en cada paso que ¡La vida es bella!
Cynthia
J.L.L.A
v
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Central del Ecuador, la Facultad de Ciencias
Agrícolas, por mi desarrollo profesional.
Agresearch-Nueva Zelanda, en la persona de Trevor Jackson, al

Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias -
Estación Experimental Santa Catalina; en la persona de Cristina Tello;
por el financiamiento y apoyo otorgado al proyecto en el cual estuvo
inmersa esta investigación.
A Jorge Caicedo M. Sc, en calidad de tutor académico, por dirigir mi

trabajo de titulación con excelente disposición, preocupación y
constante orientación.
A Francisco Báez Ing. Agr. Técnico del Laboratorio de Control

Biológico, por brindarme su amistad, ánimo, asesoría y la oportunidad
de adquirir nuevos conocimientos.
A la Doctora Laura Villamizar de AgResearch–Nueva Zelanda, por su

asistencia técnica y consejos para el desarrollo de bioformulaciones, a
la Ing. Nicolalde y la Sra. Marcia Verdezoto por su amabilidad y
colaboración.
A mi familia en especial a mis padres y mi tía Geovanna, por su

incondicional apoyo y compañía desde mi niñez, por ser ejemplo de
que si deseamos algo y batallamos por ello se alcanza, no importa
cuántos obstáculos debamos vencer.
A mi abuelito Luis, por sus regaños y consejos; a mi abuelita Mercedes

que me da su bendición desde el cielo, por haberme motivado a luchar
por mis sueños.
A mis amigos y amigas en especial a Hugo, Cynthia, Diana y Pamela,

por su valiosa amistad, anécdotas y travesías compartidas durante la
carrera.
vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CAPÍTULOS PÁGINAS
I. INTRODUCCIÓN ___________________________________________________ 1
II. REVISIÓN DE LITERATURA ________________________________________ 2
2.1. Control biológico ____________________________________________________ 2
2.2. Trichoderma sp. _____________________________________________________ 2
2.3. Mecanismos de acción de Trichoderma ___________________________________ 3
2.3.1. Competencia ________________________________________________________ 3
2.3.2. Antibiosis __________________________________________________________ 3
2.3.3. Micoparasitismo _____________________________________________________ 4
2.3.4. Inducción de resistencia _______________________________________________ 4
2.3.5. Trichoderma asperellum ______________________________________________ 5
2.4. Bioformulaciones generalidades _________________________________________ 5
2.5. Tipos de formulaciones ________________________________________________ 6
2.6. Formulaciones sólidas _________________________________________________ 6
2.6.1. Polvos _____________________________________________________________ 6
2.6.2. Polvos mojables _____________________________________________________ 6
2.6.3. Granulados _________________________________________________________ 6
2.6.3.1. Gránulos cubiertos __________________________________________________ 7
2.6.3.2. Gránulos dispersables _______________________________________________ 7
2.7. Formulación líquida __________________________________________________ 7
2.7.1. Concentrados emulsionables ___________________________________________ 7
2.8. Estabilidad de bioformulaciones en almacenamiento _________________________ 8
2.9. Control de calidad de bioformulados _____________________________________ 8
2.10. Características microbiológicas de las formulaciones ________________________ 9
2.10.1.Concentración de colonias en Unidades formadoras de colonia (UFC/g o ml) ____ 9
2.10.2. Porcentaje de germinación de conidias (%) _______________________________ 9
2.10.3. Prueba de pureza ____________________________________________________ 9
2.11. Características fisicoquímicas de las formulaciones _________________________ 9
2.11.1. pH _______________________________________________________________ 9
2.11.2. Porcentaje de humedad (%) __________________________________________ 10
2.11.3. Humectabilidad (min) _______________________________________________ 10
2.11.4. Suspendibilidad (%) ________________________________________________ 10
vii
CAPÍTULOS PÁGINAS
2.11.5. Tamaño de la partícula (%) __________________________________________ 11

2.11.6. Actividad de agua (aw) ______________________________________________ 11
2.11.7. Densidad apisonada (g/ml) ___________________________________________ 11
2.11.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml) ___________________________ 12
III. MATERIALES Y MÉTODOS ________________________________________ 13
3.1. Ubicación ___________________________________________________________ 13
3.2. Ubicación política ____________________________________________________ 13
3.3. Ubicación geográfica __________________________________________________ 13
3.3.1. Características del laboratorio __________________________________________ 13
3.4. Materiales __________________________________________________________ 13
3.5. Material biológico ____________________________________________________ 13
3.6. Material de Laboratorio ________________________________________________ 13
3.7. Reactivos ___________________________________________________________ 14
3.8. Equipos ____________________________________________________________ 14
3.9. Métodos ____________________________________________________________ 15
3.9.1. Microorganismo experimental Trichoderma asperellum _____________________ 15
3.9.2. Producción masiva de Trichoderma asperellum. ___________________________ 15
3.9.3. Extracción de conidias de Trichoderma asperellum ________________________ 17
3.10. Formulación de Trichoderma asperellum ________________________________ 17
3.10.1. Formulación del prototipo polvo mojable (WP) __________________________ 17
3.10.2. Formulación del prototipo concentrado emulsionable (EC)__________________ 19
3.10.3. Formulación del prototipo gránulo cubierto (CG) _________________________ 21
3.10.4. Formulación del prototipo gránulo dispersable (WG) ______________________ 23
3.11. Análisis de calidad microbiológica de bioformulaciones a base de Trichoderma
asperellum _____________________________________________________________ 25
3.11.1. Porcentaje de germinación de conidias (%) ______________________________ 25
3.11.2. Determinación de la concentración de colonias en UFC/g o ml ______________ 26
3.11.3. Determinación de la pureza __________________________________________ 26
3.11.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación (%) _______________________ 27
3.12. Caracterización fisicoquímica de los prototipos de bioformulaciones. _________ 27
3.12.1. Humedad (%) _____________________________________________________ 27
3.12.2. Actividad de agua (aw) ______________________________________________ 27
viii
CAPÍTULOS PÁGINAS
3.12.3. Densidad apisonada (g/ml) ___________________________________________ 28

3.12.4. Determinación de pH _______________________________________________ 28
3.12.5. Humectabilidad (minutos) ___________________________________________ 28
3.12.6. Suspendibilidad (%) ________________________________________________ 28
3.12.7. Tamaño de partícula (%) ____________________________________________ 28
3.12.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml) ___________________________ 29
IV. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ___________________________________________ 30
4.1. Factores en estudio __________________________________________________ 30
4.1.1. Prototipos de bioformulaciones (P) _____________________________________ 30
4.1.2. Temperaturas de almacenamiento (T) ___________________________________ 30
4.1.3. Tratamientos _______________________________________________________ 30
4.2. Esquema del experimento ____________________________________________ 31
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN _______________________________________ 32
5.1. Caracterización microbiológica de los prototipos ___________________________ 32
5.1.1. Porcentaje de germinación ____________________________________________ 32
5.1.2. Concentración de colonias en UFC _____________________________________ 36
5.1.3. Pureza ____________________________________________________________ 39
5.1.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación ____________________________ 41
5.2. Caracterización fisicoquímica de los prototipos ____________________________ 42
5.2.1. Densidad apisonada _________________________________________________ 42
5.2.2. Humectabilidad _____________________________________________________ 44
5.2.3. Humedad__________________________________________________________ 45
5.2.4. pH _______________________________________________________________ 47
5.2.5. Estabilidad del concentrado emulsionable ________________________________ 48
5.2.6. Suspendibilidad ____________________________________________________ 50
5.2.7. Tamaño de la partícula _______________________________________________ 51
5.2.8. Actividad de agua __________________________________________________ 55
5.3. Resumen de las características microbiológicas y fisicoquímicas _____________ 58
VI. CONCLUSIONES __________________________________________________ 60
VII. RECOMENDACIONES _____________________________________________ 61
VIII. RESUMEN________________________________________________________ 62
IX. REFERENCIAS ____________________________________________________ 66
ix
CAPÍTULOS PÁGINAS
X. ANEXOS __________________________________________________________ 70
x
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICOS PÁG
1. Porcentaje de contaminación de los bioformulados, antes y después de seis meses

de almacenamiento. ................................................................................................. 40
2. Porcentaje de pureza de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento. ...................................................................................................... 40
3. Suspendabilidad en porcentaje del WP y WG, después de manufacturación y

almacenamiento por seis meses a dos temperaturas. ............................................... 51
4. Distribución del material retenido (%) de WG, a partir de su elaboración (inicial) y

almacenamiento por seis meses. .............................................................................. 53
5. Distribución del material retenido (%) de CG, a partir de su elaboración (inicial) y

6. Distribución del material retenido (%) de WP, a partir de su elaboración (inicial) y

xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURAS PÁG
1. Colonias del hongo Trichoderma asperellum. ........................................................ 15
2. Producción masiva de Trichoderma asperellum a) multiplicación in vitro b)

multiplicación en sustrato arroz. .............................................................................. 16
3. Método de extracción y conservación de conidias secas de Trichoderma asperellum.

................................................................................................................................. 17
4. Mezcla de excipientes con el ingrediente activo (conidias puras y secas). ............. 18
5. Prototipo de polvo mojable a base de conidias de Trichoderma asperellum. ......... 18
6. Empaque y etiquetado del producto polvo mojable (WP) a dos condiciones de

almacenamiento. ...................................................................................................... 19
7. Formulación del producto concentrado emulsionable (EC) a base de conidias de

Trichoderma asperellum. ........................................................................................ 20
8. Empaque y etiquetado de porciones del producto concentrado emulsionable (EC).

................................................................................................................................. 20
9. Elaboración del Gránulo Dispersable (WG). ........................................................... 24
10. Secado del Gránulo Dispersable (WG). .................................................................. 24
11. Empaque y división de gránulos dispersables (WG) para almacenamiento a dos

temperaturas............................................................................................................. 25
12. Elaboración del Biomatrix para la formulación de gránulo cubierto (CG). ........... 22
13. Elaboración y secado del prototipo gránulo cubierto (CG). ................................... 22
14. Empaque y etiquetado del gránulo cubierto (CG) para almacenamiento a dos
temperaturas............................................................................................................. 23
15. Esquema de la disposición de las unidades experimentales. ................................... 31
xii
FIGURAS PÁG
16. Disposición de las unidades experimentales según cada tratamiento a diferentes

temperaturas de almacenamiento............................................................................. 31
17. Humectabilidad de WP. ........................................................................................... 44
18. Humectabilidad de WG. .......................................................................................... 45
19. Estabilidad del concentrado emulsionable cremado a) 1 hora b) 24 horas. ............ 49
xiii
LISTA DE CUADROS
CUADROS PÁG
1. Medio de cultivo para la multiplicación de Trichoderma asperellum. ................... 16
2. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del polvo

mojable (WP)........................................................................................................... 18
3. Datos informativos correspondientes al etiquetado del polvo mojable. .................. 19
4. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del

concentrado emulsionable (EC). ............................................................................. 19
5. Datos informativos correspondientes al etiquetado del concentrado emulsionable. 21
6. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

cubierto (CG). .......................................................................................................... 21
7. Porcentajes de ingredientes que forman el Biomatrix para gránulo cubierto .......... 21
8. Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo cubierto................ 23
9. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

dispersable (WG). .................................................................................................... 23
10. Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo dispersable. .......... 25
11. Medio de cultivo utilizado en el porcentaje de germinación de conidias. ............... 25
12. Medio de cultivo para cuantificación de colonias de Trichoderma asperellum ...... 26
13. Tratamientos correspondientes a los 4 prototipos de bioformulaciones desarrolladas

a base de conidias Trichoderma asperellum............................................................ 31
14. Normalidad y homocedasticidad del porcentaje de germinación antes y durante los

seis meses de almacenamiento a dos temperaturas. ................................................ 32
15. ANOVA del porcentaje de germinación después de formulados los prototipos y

durante dos meses de almacenamiento a 4 y 30°C. ................................................. 33
xiv
CUADROS PÁG
16. ANOVA del porcentaje de germinación del 3er al 4to mes de almacenamiento, a dos
temperaturas............................................................................................................. 33
17. Medias del porcentaje de germinación después de la elaboración de los prototipos y

durante seis meses de almacenamiento a dos temperaturas. ................................... 34
18. Porcentaje de germinación de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento, a dos temperaturas. ...................................................................... 35
19. Normalidad y varianzas constantes de la concentración en Log UFC/g de lo

bioformulados, antes y durante los seis meses de almacenamiento, a dos
temperaturas............................................................................................................. 36
20. ANOVA del porcentaje de la concentración de colonias (Log UFC/g) después de

formulados los prototipos y durante dos meses de almacenamiento, a dos
temperaturas............................................................................................................. 37
21. ANOVA de la concentración de colonias (Log UFC/g) a partir 3er al 6to mes de
22. Medias de la concentración (Log UFC/g) después de formulados los prototipos y

durante seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas. .................................. 38
23. Concentración de colonias (UFC/g) de los bioformulados, antes y después de seis

meses de almacenamiento, a dos temperaturas. ...................................................... 39
24. Medias del nivel de eficiencia del proceso de formulación (%) después de
manufacturación en los cuatro bioformulados a base de Trichoderma asperellum. 41
25. Análisis de la densidad apisonada según Kruskall Wallis antes y durante seis meses
de almacenamiento, a dos temperaturas. ................................................................. 43
26. Medias y rangos de significación para densidad apisonada (g/ml), evaluados en

prototipos sólidos WP, WG, CG a partir del mes de formulación y durante seis meses
xv
CUADROS PÁG
27. Análisis del porcentaje de humedad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses
de almacenamiento, a dos temperaturas. ................................................................. 46
28. Medias y rangos de significación para porcentaje de humedad (%), evaluados en

29. Análisis del pH según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de almacenamiento,
a dos temperaturas. .................................................................................................. 47
30. Medias y rangos de significación para el valor de pH, evaluados en los cuatro
prototipos WP, WG, CG y EC, a partir del mes de formulación y durante seis meses
31. Análisis de la suspendibilidad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de
32. Medias y rangos de significación para suspendibilidad (%), evaluados en prototipos

sólidos WP y WG a partir del mes de formulación y durante seis meses de
almacenamiento. ...................................................................................................... 50
33. Análisis del tamaño de partícula según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de
34. Medias y rangos de significación correspondiente a tamaño de la partícula (%), en

35. Normalidad y varianzas constantes de la aw de los bioformulados, antes y durante los

seis meses de almacenamiento a dos temperaturas. ................................................ 55
36. ANOVA correspondiente a la aw después de formulados los prototipos y durante tres

meses de almacenamiento, a dos temperaturas. ...................................................... 56
37. ANOVA correspondiente a la aw del 4to al 6to mes de los bioformulados

almacenados, a dos temperaturas............................................................................. 56
xvi
CUADROS PÁG
38. Medias correspondientes a la aw después de formulados los prototipos y durante seis
meses de almacenamiento a dos temperaturas. ....................................................... 57
39. Características microbiológicas de los bioformulados a base de Trichoderma

asperellum después de seis meses almacenamiento a 4°C y 30°C. ......................... 58
40. Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma

asperellum después de seis meses almacenamiento a 4°C. ..................................... 59
41. Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma

asperellum después de seis meses almacenamiento a 30°C. ................................... 59
xvii
LISTA DE ANEXOS
ANEXO PÁG
1. Identificación del aislamiento de Trichoderma asperellum realizado por INIAP-
Estación Experimental Litoral Sur. ......................................................................... 70
2. Parámetros de calidad para formulaciones biológicas, establecidos por el Laboratorio

de Control Biológico de INIAP-EESC. ................................................................... 71
3. Determinación de la concentración de colonias (UFC/g) en diluciones serias de 10 4

a 106. ........................................................................................................................ 72
4. Determinación del porcentaje de germinación (%) de Trichoderma asperellum.... 72
5. Conteo de conidias de Trichoderma asperellum germinadas y sin germinar (40x).73
6. Área de secado de sustrato arroz con deshumificador. ............................................ 73
7. Producción masiva de Trichoderma asperellum en sustrato arroz. ........................ 74
8. Procedimiento para medición de la densidad apisonada en productos sólidos. ...... 74
9. Determinación de la actividad de agua .................................................................... 75
10. Determinación del porcentaje de humedad de los productos biológicos................. 75
11. Determinación del valor de pH ............................................................................... 76
12. Anexo 12: Determinación de la suspendibilidad ..................................................... 76
xviii
TÍTULO: DESARROLLO DE CUATRO PROTOTIPOS DE
BIOFORMULACIONES EN BASE A CONIDIAS DE Trichoderma asperellum
Autora: Cynthia Estefania Perdomo Quishpe

Tutor: Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez
RESUMEN
Se desarrollaron cuatro prototipos de bioformulaciones, tales como polvo mojable, concentrado

emulsionable, granulado cubierto y dispersable, basado en conidias de Trichoderma asperellum
provenientes del INIAP- Estación Litoral Sur. El objetivo de esta investigación fue determinar los
parámetros fisicoquímicos y microbiológicos de los prototipos en dos temperaturas, además de
establecer el mejor prototipo en función de su viabilidad, estabilidad y conservación después del
tiempo de almacenamiento. Estos productos almacenados en refrigeración a 4°C mostraron una
mayor viabilidad y estabilidad después de seis meses de tiempo de almacenamiento, en comparación
con 30°C, donde el efecto de la temperatura redujo la germinación de los conidios al 100%. Según
los parámetros antes mencionados, el mejor prototipo fue el polvo mojable almacenado a 4°C, que
presentó una viabilidad mayor al 85% de conidios germinados, y una concentración de colonias de
1x108 unidades formadoras de colonias (UFC)/g, manteniendo una buena estabilidad y conservación
del microorganismo después de seis meses del período de evaluación.
PALABRAS CLAVE: FORMULACIÓN BIOLÓGICA / POLVO MOJABLE /

CONCENTRADO EMULSIONABLE / GRANULADOS / AGENTE
BIOCONTROLADOR
xix
SUBJECT: DEVELOPMENT OF FOUR BIOFORMULATION PROTOTYPES
BASED ON CONIDIAS OF Trichoderma asperellum
Author: Cynthia Estefania Perdomo Quishpe

Tutor: Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez
ABSTRACT
Four prototypes of bioformulations were developed, such as wettable powder, emulsifiable

concentrate and covered and dispersable granulated, based on conidia of Trichoderma
asperellum coming from the INIAP- Station Litoral Sur. The aim of this research was to
determine the physicochemical and microbiological parameters of the prototypes under two
temperatures, in addition to establish the best prototype based on its viability, stability and
preservation after storage time. These products stored in refrigeration at 4 °C, showed greater
viability and stability after six months of storage time, compared with 30 °C, where the effect
of temperature reduced the conidia germination to 100 %. According to parameters above
mentioned, the best prototype was wettable powder stored at 4 °C, which presented a high
viability than 85 % of conidia germination, and a concentration of colonies of 1 x 108 colony
forming unit (CFU)/g, maintaining a good stability and preservation of the microorganism
after six month of evaluation period.
KEYWORDS: ORGANIC FORMULATION / WETTABLE POWDER /

EMULSIFIABLE CONCENTRATE / GRANULATES/ BIOCONTROLLER AGENT.
xx
CERTIFICACIÓN
En calidad de tutor del trabajo de graduación cuyo título es “Desarrollo de cuatro prototipos
de bioformulaciones en base a conidias de Trichoderma asperellum”, presentado por la
señorita Cynthia Estefania Perdomo Quishpe, previo a la obtención del Título de Ingeniera
Agrónoma, certifico haber recibido y corregido el ABSTRACT para el trabajo de grado,
aprobado el mismo, después de realizadas las observaciones por los miembros del tribunal,
por lo que apruebo, para el empastado final.
____________________________________
Ing. Agr. Jorge David Caicedo Chávez, M.Sc.
CC. 1719050682
DOCENTE-TUTOR
xxi
I. INTRODUCCIÓN
Ecuador posee sistemas de producción diferenciados por el tamaño de la Unidad Productiva

Agropecuaria (UPA) con factores edafoclimáticos muy diferenciados que contribuyen al desarrollo
de plagas humana (Bettiol et al., 2014). Las pérdidas por patógenos pueden superar el 20% de los
costos de producción, razón por la cual se ha impulsado la búsqueda de estrategias de control
alternativas al control químico, eficientes, con bajos impactos ambientales y sin afectar la salud
(Vallejo, 2014).
Entre las alternativas de control en programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP), se considera
el control biológico que es la utilización de un organismo antagonista frente a otro denominado
patógeno (Bettiol et al.,2014). En el suelo existe una gran cantidad de microorganismos benéficos
entre los que destacan los hongos pertenecientes al género Trichoderma, por su versatilidad,
adaptabilidad y fácil manipulación, los cuales son capaces de controlar una amplia gama de
microorganismos patógenos (Falconí, 2010). Trichoderma asperellum presenta diferentes
mecanismos de acción como la inducción eficiente de resistencia sistémica en plantas (RSI por sus
siglas en inglés) y se observa su acción sobre patógenos foliares como Pseudomonas syringae pv.
lachrymans en pepino; y de suelo tales como Fusarium oxysporum f. sp. cubense en banano (Yedidia
et al., 2003., Thangavelu y Gopi, 2015., Bissett al., 2015).
De acuerdo con Fernández (2001) y Vallejo (2014), es importante destacar que se pueden realizar
diferentes formulaciones con el hongo Trichoderma spp, sin embargo, estos formulados no poseen
el mismo efecto en todas las zonas agroecológicas debido a las diversas condiciones ambientales
consiguiendo elevar o disminuir su efectividad, por lo tanto, es pertinente realizar investigaciones
especificas en cada región agrícola (Falconí, 2010).
García, Durán y Riera (2006), mencionan que el material seco es el preferido para la elaboración de
formulaciones, debido a que, en la posterior comercialización del producto, son el peso y la
manipulación aspectos muy importantes del formulado. También se considera que las hifas son
poco resistentes al secado, por lo que se trabaja con las formas reproductoras (conidias y
clamidosporas). De esta forma, el tipo de formulación dependerá de la metodología de aplicación,
sitio de acción, condiciones ambientales, entre otros factores (Pavone, 2012).
Con la finalidad de promover estrategias biológicas para el control de plagas, el presente trabajo
tuvo como objetivo el desarrollo de cuatro prototipos de bioformulaciones a base de conidias de
Trichoderma asperellum mezcladas con varios ingredientes inertes que mejoren sus niveles de
sobrevivencia y almacenamiento; este microorganismo fue escogido por sus cualidades de
antagonismo y mecanismo de acción frente a nematodos fitopatógenos, según investigaciones
previas realizadas en el cultivo de banano en el INIAP-Estación Experimental Litoral Sur en el año
2010.
1
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Control biológico
El control biológico (CB), es un medio ecológicamente efectivo y específico que permite mitigar
poblaciones de plagas con el uso de uno o más organismos benéficos (enemigos naturales),
reduciendo el nivel de daño económico. Entre los agentes biocontroladores o enemigos naturales
de patógenos están las bacterias, hongos, parasitoides y depredadores entre otros (Nicholls, 2008).
Existen diversas formas para la implementación del CB, entre las que se destacan la importación o
introducción de agentes foráneos conocido como control clásico; la conservación o aumento de
enemigos naturales, preservando el agente benéfico nativo y las condiciones para que este
aumente su población y actué contra la plaga; otra forma es la aplicación de plaguicidas
microbianos (incluidos virus, bacterias, hongos, protozoos, nematodos o sus bioproductos),
alternativa más promisoria debido a su baja toxicidad y su potencial de permanecer en el
ecosistema aplicado (Quiroga, 2009).
Entre las ventajas de utilizar organismos biocontroladores está la seguridad durante su aplicación,
al no ser nocivo para humanos, cultivos y el ambiente; considerando que no afecta a otros
organismos benéficos y fauna útil, siendo totalmente compatible con los conceptos de manejo
integrado de plagas y agricultura sostenible (Rubio y Fereres, 2005).
Entre los géneros de hongos mayormente utilizados como agentes de control biológico se
encuentra Trichoderma que puede ejercer una actividad antagonista mediante diferentes
mecanismos de acción frente a distintos organismos patogénicos (Pavone, 2012).
2.2. Trichoderma sp.

Person describió el género Trichoderma en 1794, basándose en el material recogido en Alemania;
posteriormente, Rifai en 1969 hizo el primer agrupamiento de especies que se utiliza hasta el
presente (Martínez, Danay y Reyes, 2013). Este género reúne una gran cantidad de especies
ampliamente distribuidas en casi todos los tipos de suelos y ambientes, en especial con materia
orgánica en descomposición como madera y hojarasca; poseen importancia económica por su
diversa capacidad metabólica y agresiva competencia natural (Pavone, 2012).
Trichoderma es un género anamórfico cuya forma sexual es Hypocrea, considerado como un

excelente agente de control biológico por su alto nivel de diversidad genética y su eficiencia. Se
encuentra en una amplia gama de productos comerciales para el control de ciertos patógenos como
Rhizoctonia y Sclerotinia efecto que lo identificó por primera vez Weindling en 1930 (Martínez et
al., 2013., Sosa, Pérez, Molina y Rumbos, 2011). Especies como T. harzianum, T. atroviride,
T. asperellum entre otras, son capaces de controlar diferentes patógenos de plantas por
mecanismos de acción específicos (Casimiro, 2001).
Características macroscópicas de las colonias de Trichoderma definen en su inicio una coloración

blanquesina, que se torna a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. El micelio es ralo
en su mayoría, y visto al microscopio es fino. Sus conidióforos son ramificados y terminan en fiálides
donde se forman las esporas asexuales o conidias, de gran importancia para la identificación
2
taxonómica a nivel de especies. Las conidias aseguran las generaciones del hongo durante gran
parte del período vegetativo de las plantas (Infante et al., 2009).
2.3. Mecanismos de acción de Trichoderma
La habilidad de Trichoderma spp. para reducir daños causados por hongos fitopatógenos está
relacionada a su fuerte capacidad competitiva y persistencia en el ambiente. Los principales
mecanismos de acción que el hongo emplea son competencia, antibiosis, micoparasitismo e
inclusive inducción de resistencia (Casimiro, 2001), estos mecanismos pueden ser afectados por el
tipo de suelo, humedad de la planta y el ambiente, temperatura, pH y otros miembros de la
microflora (Chávez, 2011).
2.3.1. Competencia
La competencia es el comportamiento distinto entre dos o más organismos ante un mismo

requerimiento, reduciendo la cantidad necesaria para los demás por aprovechamiento del
microorganismo benéfico (Martínez et al., 2013). Se puede originar competencia por los sitios de
infección, donde la ocupación por un microorganismo impide la colonización por otro o bien por
determinados nutrientes. En la competencia por nutrientes o bien cierto microorganismo posee
un mejor mecanismo de absorción o enzimas extracelulares más activas en comparación a otro,
de forma que obtiene más nutrientes y mayor crecimiento (Rubio y Fereres, 2005). La competencia
por nutrientes de Trichoderma, es principalmente por carbono, nitrato y hierro (Martínez et al.,
2013).
El hongo Trichoderma es considerado un excelente competidor por espacio y recursos nutricionales

debido a su alta plasticidad ecológica, velocidad de crecimiento y desarrollo (Martínez et al., 2013).
Este antagonista está adaptado para una colonización agresiva de los sustratos y en condiciones
adversas forma clamidosporas; factores como crecimiento, abundante esporulación y la amplia
gama de sustratos sobre los que puede crecer, cantidad enzimas, lo convierte en un hongo saprofito
muy eficiente excelente agente de control biológico (Infante et al., 2009). Los nutrientes de mayor
demanda para Trichoderma son carbono, nitrato y hierro (Martínez et al., 2013).
2.3.2. Antibiosis
La antibiosis es la acción directa de antibióticos o metabolitos tóxicos producidos por un

microorganismo sobre otro sensible a estos (Infante et al., 2009). Trichoderma produce
principalmente tres tipos de compuestos: peptaibols, poliketidos y terpenos, los cuales pueden ser
volátiles o solubles, tales como: ácido harziánico, alameticina, tricolina, peptaiboles, antibióticos,
6-pentil-α-pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisopreninas, ácido heptelidico, entre otros
(Pavone, 2012), algunos inhiben el desarrollo de otros microorganismos con los que no hacen
contacto físico (Infante et al., 2009).
Algunas especies de Trichoderma producen compuestos antifúngicos que actúan sobre

Rhizotocnia solani y S. rolfsii ocasionando la degradación de sus hifas, otras especies producen la
inhibición in vitro de la germinación de conidias de Botrytis cinerea Pers. Con relación al efecto de
Trichoderma sobre nemátodos se ha encontrado que las quitinasas y proteasas de Trichoderma
3
spp. son muy similares a las de los hongos nematófagos, lo cual les da el potencial para atacar a
estos invertebrados. El proceso parasítico y el efecto de las enzimas y metabolitos de Trichoderma
sobre nematodos pueden ocurrir en el suelo, en el interior de las raíces o sobre la superficie de
estas (Martínez et al., 2013).
Sin embargo se debe considerar que la antibiosis no debe ser el principal mecanismo de acción de
un antagonista, ya que existe el riesgo de aparición de cepas del patógeno resistentes al antibiótico
(Infante et al., 2009).
2.3.3. Micoparasitismo
Según el modo de micoparasitismo los hongos se dividen en dos grupos biotróficos o necrotróficos
(Casimiro, 2001). Los biotróficos tienen un rango de hospedantes restringido y producen
estructuras especializadas para absorber los nutrientes de sus células, se han encontrado pocos
casos de agentes de biocontrol de este tipo, entre ellos esta Sporidesmiun sclerotivorum Uecker y
Ampelomyces quisqualis (Memenza, 2009). Los necotróficos matan a la célula antes o después de
la invasión absorbiendo los nutrientes, no son especializados y tiene un amplio rango de
hospederos su actividad antagónica se da por la producción de antibióticos, toxinas y enzimas
hidrolíticas que matan y destruyen al patógeno, los géneros más comunes en este grupo son
Trichoderma, Pythium, Talaromyces, Coniothyrium y Gliocladium (Casimiro, 2001).
Trichoderma produce exoenzimas hidrolíticas que facilitan la degradación de la pared celular del
hospedero (Memenza, 2009), permitiendo su ingreso y uso del contenido celular para su
alimentación, ejerciendo de esta manera el control. Entre las enzimas que actúan en este
mecanismo se encuentran las quitinolíticas, las β-glucanasas o celulasas, las liasas, las proteasas y
lipasas, siendo las dos primeras las más importantes en el proceso de control, pudiendo incluso
actuar de forma sinérgica (Pavone, 2012).
Se ha evidenciado que Trichoderma posee diferentes tipos de interacción hifal para realizar
parasitismo, considerando esta acción como una potencialidad para su uso como biorregulador de
hongos del suelo. En pruebas realizadas sobre F. oxysporum f. sp. cubense, Pythium sp. y
Rhizoctonia solani se ha encontrado enrollamiento y penetración de hifas de Trichoderma las cuales
reducen la población del patógeno y evidencian su capacidad de micoparasitismo (Infante et al.,
2009).
2.3.4. Inducción de resistencia
Consiste en la inducción del sistema de defensa que da resistencia al hospedero frente a patógenos
por la interacción con un microorganismo no patógeno. Cuando se induce la resistencia la planta
expresa una serie de genes que confieren resistencia como 1,3-b-glucanasas, fitoalexinas, genes
relacionados con el refuerzo de la pared celular como peroxidasas y la deposición de lignina, callosa
y glicoproteínas ricas en hidroxiprolina y proteínas relacionadas con patogénesis, proteínas (PR)
(Rubio y Fereres, 2005).
Estudios recientes a niveles celular y molecular explican la diversidad de vías y mecanismos de

acción de Trichoderma, se ha descubierto que algunas cepas de este hongo pueden activar un
4
mecanismo nativo de defensa en las plantas, conocido como Inducción de Resistencia Sistémica
(por sus siglas en inglés IRS). Esto supone que puedan controlar a patógenos distantes del lugar
donde se encuentra físicamente el antagonista. Prueba de ello, fue la colonización de las raíces de
pepino con T. asperellum, la cual indujo resistencia a Pseudomonas syringae pv. lachrymans.
También existen evidencias de este modo de acción frente a nematodos (Martínez et al., 2013).
2.3.5. Trichoderma asperellum
CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE Trichoderma asperellum
Reino: Fungi
División: Ascomycota
Subdivisión: Pezizomycotina
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Hypocreaceae
Género: Tel= Hypocrea; An= Trichoderma
Especie: asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg
(Flores, 2013)
2.4. Bioformulaciones generalidades

Las formulaciones biológicas consisten en la mezcla física de uno o más principios biológicamente
activos (mohos, levaduras, bacterias, virus o nemátodos) de acción biocontroladora, con
ingredientes inertes para mejorar la eficiencia, estabilidad y manejo del producto (Agamez et al.,
2009).
El desarrollo de un bioformulado implica el seguimiento de diferentes etapas que aseguren la

obtención de un producto seguro, eficaz y confiable. El ingrediente activo (microorganismo) debe
ser aislado y seleccionado de acuerdo con su actividad biológica, pero antes de que este
microorganismo sea utilizado, debe ser caracterizado para garantizar que su utilización no
represente un riesgo para la salud humana, animal o para la sanidad vegetal. Además, el
microorganismo debe ser conservado bajo condiciones que mantengan sus características
genéticas y fisiológicas (Contreras, 2003).
Las funciones básicas del bioformulado son mantener estable el microorganismo durante la
producción, distribución y almacenamiento; facilitar la manipulación y aplicación del producto de
manera que sea fácilmente suministrado al patógeno y de la forma más apropiada, proteger el
agente biocontrolador su patogenicidad en el sitio de acción mediante aumento de su actividad,
reproducción, contacto y la interacción con el patógeno especifico (Burges, 1998).
Por todo esto, las etapas de preformulación y formulación son etapas críticas en el desarrollo de un
bioformulado. La etapa de preformulación es aquella encaminada a determinar las características
del microorganismo utilizado como principio activo y los cambios físicos, químicos y microbiológicos
que éste pueda sufrir al ser combinado con los auxiliares de formulación (Contreras, 2003).
5
2.5. Tipos de formulaciones
La formulación de microrganismos puede dividirse en dos grupos sólidos secos o líquidos.
Actualmente las formulaciones sólidas más ampliamente usadas son los polvos, gránulos, cápsulas,
cebos, briquetas y dentro de las líquidas se encuentran suspensiones concentradas, aerosoles y
concentrados emulsionables (Quiroga, 2009).
2.6. Formulaciones sólidas

2.6.1. Polvos
Los polvos son compuestos producidos por la mezcla del ingrediente activo con un material inerte
que actúa como diluyente o transportador (Carrier) el cual normalmente posee una capacidad
absorbente. Los diluyentes comúnmente empleados en este tipo de formulación son talcos de
silicatos, minerales de sílice en proporciones variadas según la densidad deseada (Quiroga, 2009).
Se caracterizan por tener un tamaño ideal de partícula que oscila desde 5 y 20 µm considerando
que las partículas menores a 10 µm son abrasivos e insecticidas y pueden provocar peligro de
inhalación para quien lo manipula. Este formulado contiene generalmente menor al 10% de
ingrediente activo (Burges, 1998).
Los tipos más comunes de polvos son, polvos para espolvoreo, los cuales pueden ser aplicados
directamente sobre las plantas o el suelo y polvos para reconstituir o mojables, los cuales
predominan entre los primeros productos comerciales y comprenden polvos técnicos mezclados
con aditivos (excipientes) para hacerlos estables durante el almacenamiento en la estantería y
fácilmente miscibles con agua para su aplicación por aspersión (Burges, 1998., Padin et al.,
2013.,Quiroga, 2009).
2.6.2. Polvos mojables

Un polvo mojable debe formar una adecuada suspensión en agua, por lo cual necesita de
considerable agitación para evitar la sedimentación. Entre las propiedades importantes de los
polvos mojables deben citarse la fluidez, la humectabilidad, la baja producción de espuma, la
estabilidad física y química, la suspendibilidad y el tamaño de partícula. La suspendibilidad es la
capacidad de un sólido de mantenerse en suspensión en un medio líquido por el mayor tiempo
posible sin depositarse en el fondo del recipiente o depositándose en la mínima cantidad posible
(Ramírez, 1982).
2.6.3. Granulados
Las formulaciones granulares contienen el principio activo en un medio sólido adecuado para llevar
a cabo la aplicación directa. Un producto granular debe ser seco, fluir libremente, sin tendencia a
aglomerarse, con índice de polvos bajo, tamaño uniforme de las partículas y presentar estabilidad
del principio activo (Contreras, 2003).
Los materiales inertes que sirven como soporte en este tipo de formaciones pueden ser zeolita,
vermiculita, caolinita, entre otros; capaces de absorber o de recubrirse con el resto de los
excipientes y el ingrediente activo. Típicamente la concentración del ingrediente activo va desde 5
6
a 20 % (Burges, 1998., Quiroga, 2009). Se caracterizan por tener un rango de tamaño mayor que
polvos los cuales oscilan entre 100 y 6 000 micrones (Padin et al., 2013).
Los excipientes utilizados para un granulado comprende agentes estabilizantes que se añaden para
evitar pérdidas del ingrediente activo durante el almacenamiento, agentes humectantes para
mejorar la eficacia, la lixiviación y percolación en el suelo, agente anti aglomerante para conservar
la fluidez del material y un vehículo diluyente inerte que puede ser mineral (zeolita, vermiculita,
diatomitas, Caolinitas, carbonatos), materiales extruidos (arcillas extruidas) y materiales orgánicos
(cáscaras de arroz o de maíz, etc.)(Ramírez, 1982).
En la formación de granulados los componentes más importantes son el principio, los diluyentes,
adherentes y el solvente. Las propiedades físicas del formulado como densidad, tamaño de
partícula, solubilidad y humectabilidad son críticas en la calidad y características finales de un buen
gránulo (Agamez et al., 2009).
Los diluentes más comunes son azúcares como la lactosa y la sacarosa y varias sales inorgánicas
como fosfato de calcio y sulfato de calcio y polímeros naturales como la celulosa y el almidón. Un
adherente es un material añadido a la formulación para causar que las partículas individuales se
adhieran durante la granulación para así aumentar el tamaño de partícula y generar un material de
libre flujo, el almidón, la gelatina y la sacarosa actúan como adherentes, hoy en día. El solvente de
mayor importancia y más utilizado es el agua, aunque no es parte del granulado final ya que es
removido en el secado, dependiendo de los ingredientes de la formulación se puede utilizar otros
solventes como el etanol (Contreras, 2003).
Entre los tipos de granulados, se encuentran los granulados encapsulados (cubiertos), solubles,
dispersables, macro y micro granulados (Agamez et al., 2009).
2.6.3.1. Gránulos cubiertos

Es un proceso de granulación en el cual las partículas de polvo y el ingrediente activo son agregados
sobre un soporte los cuales son agrupados mediante la utilización de un agente adherente. Este
tipo de granulación consume menos tiempo y por lo tanto es más económica que la granulación en
húmedo (Contreras, 2003).
2.6.3.2. Gránulos dispersables

Los gránulos dispersables están formados de sustancias finamente fragmentadas que se
comprimen en gránulos durante el proceso de composición y elaboración. Al ser colocados en agua
tienden a dilatarse y a separarse en las partículas originales finamente fragmentadas. Los requisitos
de una formulación de gránulos dispersables incluyen buena dispersabilidad, fragmentación en
partículas que pasen a través de mallas y toberas durante la operación de rociado y la estabilidad
de las propiedades físicas (Agamez et al., 2009).
2.7. Formulación líquida
2.7.1. Concentrados emulsionables
Estos constan del ingrediente activo suspendido en un vehículo oleoso acompañado de los
coadyuvantes necesarios, de manera que al mezclarse con agua se forme una emulsión estable.
7
Toda emulsión forma un sistema constituido por dos fases, el agua o fase continua y el líquido
emulsionable o la fase dispersa (Quiroga, 2009).
Cuando en el concentrado emulsionable se agrega agua, se forma una emulsión estable constituida
por pequeñas gotas del vehículo oleoso que contienen el principio activo y que están dispersas en
el agua. El emulsificante actúa para mantener las gotas de aceite bien dispersas y evitar la
coalescencia de las mismas (Contreras, 2003).
Con el fin de producir emulsiones estables, deben aplicarse surfactantes adecuados, los cuales
pueden presentar en su estructura cadenas polares hidrofílicas (solubles en agua) o no polares
lipofílicas (solubles en aceite) (Burges, 1998).
2.8. Estabilidad de bioformulaciones en almacenamiento

Durante el almacenamiento, los microorganismos presentes en un bioformulado pueden sufrir
alteraciones debido a factores del proceso de manufactura del producto, como el medio de cultivo
utilizado para la producción masiva del microorganismo, el proceso de congelamiento, secado y la
utilización de agentes protectores de secado. Además, el microorganismo también puede ser
afectado por la interacción de éste con los auxiliares de formulación y por las condiciones de
almacenamiento que incluyen la temperatura, la exposición a la luz, la atmósfera, la humedad
relativa e incluso el material y el tipo de envase que sea utilizado (Abadías et al., 2001).
La posibilidad de llevar a cabo la utilización de agentes biocontroladores a nivel comercial está

determinada en gran medida por la estabilidad de las formulaciones, debido a que la utilización y
aplicación de los microorganismos se hace más segura y fácil si se encuentran formulados, también
las formulaciones optimizan la vida útil de un producto, así como la eficacia del mismo (Contreras,
2003).
El almacenamiento a bajas temperaturas y en un ambiente libre de humedad son condiciones que

disminuyen la actividad metabólica de los microorganismos, para así prevenir la acumulación de
metabolitos tóxicos y la utilización de nutrientes para lograr mantener la estabilidad de las
características microbiológica durante el almacenamiento (Sabaratnam y Traquair, 2002).
2.9. Control de calidad de bioformulados

Una característica esencial en la producción de cualquier agente de control biológico es la
implementación de un sistema de control de calidad para las características fisicoquímicas y
microbiológicas que presenta el formulado. Las especificaciones del producto, acompañadas del
control de calidad, ayudan a maximizar los rendimientos, estandarizar costos de producción,
brindar confianza a los usuarios y mantener los estándares de calidad óptimos (Quiroga, 2009.,
Vélez et al., 1997).
Para plaguicidas en general, existen protocolos aprobados internacionalmente por la Organización

de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la
Salud (OMS) elaborados por entidades como el Consejo Internacional para la Colaboración en los
Análisis de Plaguicidas (CIPAC) y la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC) (FAO y OMS,
2004).
8
2.10. Características microbiológicas de las formulaciones
2.10.1. Concentración de colonias en Unidades formadoras de colonia (UFC/g o

ml)
La cuantificación de conidias permite determinar el número de unidades infectivas por unidad de
peso o volumen existentes en una formulación y sirve de base para establecer la dosificación del
producto (Vélez et al., 1997).
2.10.2. Porcentaje de germinación de conidias (%)

Esta prueba establece la viabilidad del ingrediente activo de la formulación, en un tiempo
determinado y nos permite conocer la cantidad de conidias viables por unidad de peso o volumen.
Una formulación comercial debe tener una germinación superior al 85% en un tiempo de
incubación de 24 horas. Lo anterior, debido a que al asperjar el formulado en campo el ingrediente
activo debe tener una rápida ambientación y efecto sobre el patógeno (Vélez et al., 1997).
El porcentaje de germinación se obtiene con la siguiente fórmula:
a/(a+b) x 100
Donde:
a = conidios germinados
b = conidios no germinados
(Berlanga y Hernández, 2006)
2.10.3. Prueba de pureza

La prueba de pureza tiene como finalidad establecer la proporción del agente biológico y los
microorganismos contaminantes en la formulación (Vélez et al., 1997). Los niveles de
contaminación aceptables en productos comerciales de bioformulaciones deben ser < 0,1%, con un
límite mínimo de 99% de pureza (Berlanga y Hernández, 2006).
2.11. Características fisicoquímicas de las formulaciones

“La doctora Villamizar expuso que las características fisicoquímicas deben ser evaluadas según el
tipo de formulación, durante el proceso de manufactura y el periodo de almacenamiento en las
temperaturas establecidas, con el fin de garantizar y comprobar la calidad del producto”.
(Villamizar, comunicación personal 18 de enero de 2018)
2.11.1. pH
El pH es la medida de la acidez o alcalinidad determinada en términos de la cantidad de iones
hidrógeno que posee la formulación (Quiroga, 2009). El valor de pH influye en la germinación del
ingrediente activo, retardándolo en valores extremos. Se consideran intervalos óptimos de pH los
valores entre 5,5 y 7,0% (Vélez et al., 1997)
9
2.11.2. Porcentaje de humedad (%)
La humedad es una variable física definida formalmente como la cantidad de agua que contiene un
material, es un parámetro determinante en la estabilidad de productos cuyo principio activo es un
microorganismo (Contreras, 2003., Quiroga, 2009).
En formulaciones biológicas con excipientes como talco, bentonita, leche y tierra de diatomeas, se
presentan porcentajes de humedad que oscilan entre 3 y 5 %, valores que retardan ligeramente el
proceso de germinación, mantienen en latencia al agente biocontrolador, permiten un mejor
almacenamiento y prolongan la viabilidad de las conidias por más tiempo (Quiroga, 2009., Vélez et
al., 1997).
Humedades mayores del 80% proporcionan condiciones favorables para el desarrollo de

microorganismos tales como bacterias y levaduras que entran a competir con el agente biológico y
reducen su viabilidad (Vélez et al., 1997).
En formulaciones granuladas y polvos la humedad elevada puede influir en sus características y

conservación debido a que su exceso puede dar lugar a adhesión entre granos y partículas,
facilitando el crecimiento de microorganismos contaminantes por la aparición de grumos o
aglomerados (Quiroga, 2009).
2.11.3. Humectabilidad (min)
Capacidad que tiene un sólido para humedecerse completamente. Esta prueba se realiza solo a
productos formulados en polvos, talcos, bentonitas, tierra de diatomáceas y leche entre otros
(Vélez et al., 1997). El tiempo que tarda el formulado en tener una humectabilidad completa
permite al productor dar una recomendación antes de aplicación como es la agitación vigorosa del
producto por un tiempo determinado (Santos et al., 2012).
2.11.4. Suspendibilidad (%)
La suspendibilidad es definida como la cantidad de principio activo en suspensión después de un

tiempo establecido de reposo (Vélez et al., 1997). Esta prueba tiene como propósito asegurar que
una cantidad suficiente de ingrediente activo esta homogéneamente dispersa en la suspensión a
fin de mantener una mezcla satisfactoria y eficaz durante la aplicación y evitar el taponamiento de
boquillas (FAO y OMS, 2004).
Se consideran valores óptimos de suspendibilidad los que presentan más del 50 % de ingrediente
activo en suspensión para formulaciones de polvos mojables y gránulos dispersables y 60% para
concentrados emulsionables, todos los productos son evaluados después de 30 minutos de iniciada
la suspensión (Figueres, 1998). En polvos mojables reducir el tamaño de la partícula hasta que estás
queden excepcionalmente finas aumenta la capacidad de suspensión en agua (Agamez et al.,
2009).
10
2.11.5. Tamaño de la partícula (%)
Algunas propiedades físicas y químicas de las diferentes formulaciones, incluidas la uniformidad de
contenido, textura, color y estabilidad se ven afectadas por la distribución de tamaño de la partícula
(Quiroga, 2009).
Para determinar el tamaño y distribución de frecuencia de las partículas se dispone de métodos
como gravimetría que consiste en pasar una muestra de producto por una serie de tamices de
apertura conocida y pesar la porción de partículas que conserva cada tamiz. Los resultados se
expresan en porcentaje correspondiente al tamaño de poro en el que queda retenida la mayor
cantidad de producto. Una buena formulación presenta tamaños homogéneos y no dispersos, es
decir, que la dispersión sea lo más pequeña posible y la mayoría de las partículas se encuentre en
un mismo rango nominal (Contreras, 2003., Quiroga, 2009).
Para polvos mojables se considera adecuado un tamaño de partícula menor 50 µm limite que evita
el taponamiento de boquillas al momento de aplicación (FAO y OMS, 2004).
2.11.6. Actividad de agua (aw)

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente.
Cuando un microorganismo se encuentra en un sustrato con una actividad de agua menor que la
que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no está relacionada a la
muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de latencia durante un
tiempo. En el caso de las esporas, la fase de latencia puede ser considerada prácticamente ilimitada
(Equinlab, 2009).
Los valores mínimos de actividad para el crecimiento óptimo de diferentes tipos de

microorganismos son, los siguientes: bacterias aw > 0.90, levaduras, aw > 0.85 y hongos filamentosos
aw > 0.80, estos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (más
secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras (Heer, 2007).
2.11.7. Densidad apisonada (g/ml)

La densidad de una formulación sólida se define como la relación que existe entre la masa y el
volumen ocupado por esta. Se pueden medir diferentes tipos de densidades que pueden ser
densidad volumétrica (sin comprimir) más conocida como densidad aparente y densidad
volumétrica comprimida o densidad apisonada, la cual se refiere al vehículo o formulación luego de
su compactación por distintas técnicas, de modo que sus partículas se orienten conforme a su mejor
acomodamiento, eliminando el aire entre ellas. Indica el máximo peso de una sustancia que puede
ser envasada en un recipiente de un volumen dado, y es de utilidad para predecir el
comportamiento de las formulaciones sólidas durante el manipuleo, transporte y almacenamiento.
La densidad aparente se expresa en g/ ml (Padin, et al., 2013., Quiroga, 2009).
Los límites de densidad apisonada son establecidos por el productor, según sus protocolos de
elaboración de formulaciones sólidas (FAO y OMS, 2004). Para obtener una manufactura eficaz de
formulaciones en polvos se requiere una densidad apisonada de hasta 1 g/ml (Torres, 2009).
11
2.11.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml)
La definición de estabilidad es mejor entendida si se habla en términos de inestabilidad, en una
emulsión inestable ocurrirán una serie de cambios que pueden ser observados y cuantificados. Por
ejemplo, la separación de fases de diferente color y de diferente densidad y el incremento del
tamaño de partícula visible bajo microscopía. Estos cambios pueden considerarse poco importantes
para la utilización de la estabilidad, por lo cual son inestabilidades menores. Las estabilidades
menores como el cremado, el ligero cambio de color o la formación de una delgada capa en la
superficie, son reversibles, es decir que el estado de una perfecta emulsión puede ser restaurado
fácilmente. Del otro lado, se pueden presentar inestabilidades mayores que alteran las
propiedades para el uso de la emulsión. Estos cambios, como el rompimiento de la emulsión y la
reversión de fases, son irreversibles, ni la agitación, ni los tratamientos prolongados en maquinaria
emulsificante lograrán reestablecer satisfactoriamente el producto (Contreras, 2003).
La calidad de una emulsión se evalúa determinando la separación espontánea de fases, en un

tiempo específico mediante evaluación óptica. Se considera estable la emulsión cuando cumple con
los siguientes requisitos referentes al cremado en reposo:
- A los 0 minutos presenta una emulsificación completa y espontánea

- A los 30 minutos se puede observar 2.0 ml de cremado máximo
- A la 1 hora presenta 3.0 ml de cremado máximo
- A las 24 horas es capaz de reemulsificarse completamente
Durante el proceso de análisis (24 horas), no debe de presentarse en ningún momento separación
de agua, si en cualquiera de los tiempos establecidos el cremado o el aceite sobrepasan los límites
señalados, se considera que la emulsión no es estable y que por ello no cumple con la norma de
calidad (Figueres, 1998., Quiroga, 2009).
12
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ubicación
La presente investigación se desarrolló en el Laboratorio de Control Biológico del Instituto Nacional
de Investigaciones Agropecuarias, INIAP-ECUADOR, Estación Experimental Santa Catalina.
3.2. Ubicación política

País: Ecuador
Provincia: Pichincha
Cantón: Mejía
Parroquia: Cutuglagua
Lugar: INIAP-Estación experimental Santa Catalina
3.3. Ubicación geográfica

Latitud: 00°22’ 57.33’’ S
Longitud: 78°33’18.46’’ O
Fuente: Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología (INAMHI), 2018
3.3.1. Características del laboratorio

Temperatura Máxima: 22°C
Temperatura Mínima: 12°C
Temperatura Promedio: 17°C
Humedad relativa Promedio: 65%
Fuente: Dattaloger, laboratorio de control biológico, 2018
3.4. Materiales
3.5. Material biológico

- Trichoderma asperellum proveniente de INIAP-ECUADOR, Estación Experimental–
Litoral Sur.
3.6. Material de Laboratorio

- Algodón
- Bandejas plásticas
- Bisturí (mangos y hojas respectivas)
- Cajas Petri de vidrio de 10 ml
- Cedazo
- Cronómetro
- Desecador
- Embudo
- Envases de vidrio color ámbar (capacidad 500ml)
- Estanterías metálicas
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- Frascos autoclavables de 500ml, 1000 ml y 2000ml (BOECO)
- Fundas metalizadas stand ups con zipper, 16 x 24 cm (capacidad 500g)
- Fundas de papel 8 x12 cm
- Gradillas
- Jeringuillas (10 ml y 60 ml)
- Libro de campo
- Material de protección (mandil, guantes, mascarillas, cofia, gafas)
- Micropipetas de 100 µl y 1000 µl (THERMO SCIENTIFIC)
- Mechero de vidrio de alcohol
- Papel parafilm
- Papel aluminio
- Pipetas de 10 ml
- Pinzas
- Porta y cubre objetos
- Probetas (50 ml, 100 ml, 250 ml y 1000 ml)
- Puntas para micropipetas (1000 µl y 100 µl)
- Regla metálica 30 cm
- Soporte metálico
- Tabla de 20 x 25,5 cm con 3 cm grosor
- Tubos de ensayo (capacidad 15ml)
- Vasos de precipitación (250 ml, 400 ml, 600 ml)
3.7. Reactivos
- Agua destilada
- Agua desionizada
- Alcohol 70%
- Alcohol 90%
- Aceite de parafina
- Ácido láctico
- Almidón de yuca
- Arroz pilado
- Goma Gellan 1%
- Goma Xanthan
- Papa Dextrosa Agar (Difco)
- Silica Gel
- Sacarosa (azúcar)
- Talco sin olor
- Tritón x-100 (LOBAL chemie)
- Zeolita
- Bentonita sódica
3.8. Equipos
- Agitador magnético (THERMO SCIENTIFIC)
- Autoclave
- Balanza analítica (OHAUS)
14
- Cámara de flujo laminar (THERMO SCIENTIFIC)
- Cámara de Neubauer (Marienfeod)
- Cámara de microscopio (MEM1300)
- Deshumificador (M&Z corporación)
- Estufa (memmert SN 30)
- Incubadora (THERMO SCIENTIFIC)
- Medidor de actividad de agua (AQUA-LAB 4TE)
- Medidor de porcentaje de humedad (BOECO BMA I50)
- Microscopio óptico (Olympus) Bx41
- pH-metro digital de mesa (HACH Sension 3)
- Refrigeradora
- Vórtex (Mixer VM- 300)
3.9. Métodos
La investigación se realizó durante 6 meses, evaluando mensualmente características fisicoquímicas
y microbiológicas de los prototipos de bioformulaciones, bajo condiciones de almacenamiento a
4°C y 30°C tomando como fundamento lo expuesto por Santos et al. (2012), quien considera un
lapso de seis meses como periodo de tiempo apropiado para realizar evaluaciones confiables en
bioformulaciones con microorganismos.
3.9.1. Microorganismo experimental Trichoderma asperellum
En el presente trabajo se utilizaron conidias liofilizadas de Trichoderma asperellum obtenido e

identificado en el INIAP- Estación Experimental Litoral Sur (Anexo 1), mismo que es utilizado por
presentar características de inducción de resistencia sistémica en las plantas y evitar proliferación
de plagas (Martínez et al., 2013).
Las conidias liofilizadas se conservaron en desecadores conteniendo perlas de silica gel hasta el
momento de su reactivación y multiplicación en sustrato sólido.
Figura 1: Colonias del hongo Trichoderma asperellum.

Fuente: La autora.
3.9.2. Producción masiva de Trichoderma asperellum.
El hongo requerido fue multiplicado en cajas Petri y posteriormente sobre sustrato sólido (arroz
pilado), según metodología utilizada en el Laboratorio de Control Biológico del INIAP – EESC.
15
En 4 tubos Eppendorf con 1000 µl de agua destilada estéril y tritón al 0,1% se preparó una
suspensión de las conidias liofilizadas, utilizando una alícuota del hongo Trichoderma asperellum
para cada tubo, posteriormente se agitó vigorosamente en vórtex homogenizando la suspensión y
se sembraron 100 µl en cada caja Petri conteniendo medio de cultivo según especificaciones de la
tabla 3; se sembraron 10 cajas Petri por tubo Eppendorf.
Cuadro 1: Medio de cultivo para la multiplicación de Trichoderma asperellum.
Componente Concentración
PDA (Papa Dextrosa Agar). 39 g/l
Ácido Láctico. Marca Panreac® 320 µl/l
Las cajas Petri sembradas se incubaron por el lapso de 7 días a una temperatura de 25°C. Para
promover la esporulación, se trasladaron las cajas Petri con Trichoderma asperellum a un área con
luz indirecta y fotoperiodo de 12:12 durante 7 días.
Para la multiplicación en sustrato sólido estéril (arroz pilado), se pesaron 2 000 g de arroz crudo por
lote, se sumergieron en agua caliente a 70 °C durante 20 minutos; se filtró el agua del arroz con un
colador y se colocó en una tela absorbente sobre una mesa durante 20 minutos a temperatura
ambiente de laboratorio. Se pesaron 100 g de arroz y se colocó en fundas plásticas de 8cm x 12cm,
se sellaron con grapas dejando un poco de aire dentro de la funda y se esterilizo en autoclave con
una presión de 15 libras y temperatura de 121°C.
Se preparó inoculo de Trichoderma asperellum en un frasco autocavable de 1000 ml con 200 ml de
agua destilada estéril, 200 µl de Tritón al 0.1% y 20 g de azúcar correspondiente al 10% del volumen
total. A la solución se añadió un raspado de micelio y conidias de 2 cajas Petri de 14 días de edad y
se procedió a inocular 100 g de arroz estéril con 10 ml de la solución preparada; el sustrato sólido
inoculado se incubó a 25°C por un lapso de 7 a 8 días hasta observar total crecimiento del hongo y
cobertura total del sustrato (se realizó remociones constantes del sustrato, para evitar
aglomeración y mantener aireación del hongo); el sustrato esporulado se trasvasó a fundas de
papel de 8cm x 12cm y se colocó en el área de secado (esta área contiene un deshumificador que
mantiene la temperatura a 18 °C y una humedad relativa entre 58 y 60 %), por el lapso de 7 días
(Anexo 7).
Figura 2: Producción masiva de Trichoderma asperellum a) multiplicación in vitro b) multiplicación

en sustrato arroz.
Fuente: La autora.
16
3.9.3. Extracción de conidias de Trichoderma asperellum
La extracción de conidias se realizó a partir de sustratos sólidos de 7 días de secado, se empleó un
juego de tamices de 500 µm y 250 µm colocados en forma de columna, respectivamente; en el
primer tamiz se colocó el sustrato seco mientras que en el segundo tamiz por la parte inferior se
colocó una funda plástica para recolección de las conidias secas; se tapó la parte superior del primer
tamiz y se procedió a la extracción. Las conidias extraídas se almacenaron en un desecador con
silicagel y el material restante (granos de arroz y residuos) se colocó en fundas plásticas para su
desecho. Por cada 100 g de sustrato arroz seco se obtuvieron 3.5 g de conidias puras.
El proceso se repitió varias veces hasta obtener la cantidad de conidias necesarias para la
elaboración de los 4 prototipos de bioformulaciones.
Figura 3: Método de extracción y conservación de conidias secas de Trichoderma asperellum.

Fuente: La autora.
3.10. Formulación de Trichoderma asperellum
3.10.1. Formulación del prototipo polvo mojable (WP)

Para el desarrollo del polvo mojable se utilizaron las conidias puras y secas de Trichoderma
asperellum, las cuales se mezclaron con excipientes inertes previamente seleccionados como
arcilla, minerales y almidón (Cuadro 2) a determinados porcentajes; los ingredientes a excepción
del almidón de yuca fueron secados y esterilizados durante 24 horas antes de la formulación, en
estufa Memmert SN 30 a 100 °C.
17
Figura 4: Mezcla de excipientes con el ingrediente activo (conidias puras y secas).
Fuente: La autora.
Cuadro 2: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del polvo mojable
(WP).
Ingredientes Porcentajes (%)
Bentonita: talco (1:1) 86.91
Almidón de yuca 7.10
Conidias secas 5.99
Total 100.00
Fuente: Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC
El prototipo se realizó, utilizando el protocolo adaptado por el Laboratorio de Control Biológico del
INIAP- EESC, se formuló un lote de 3000 g (Figura 5).
En la formulación se pesaron 2607.36 g de bentonita y talco en proporción 1:1, mezclando
vigorosamente hasta homogenizar los excipientes, se adicionaron 213 g de almidón de yuca
evitando la formación de aglomeraciones, finalmente se incorporaron las conidias de Trichoderma
asperellum y se homogenizaron hasta obtener una sola tonalidad de la mezcla (Figura 4).
Figura 5: Prototipo de polvo mojable a base de conidias de Trichoderma asperellum.

Fuente: La autora.
El lote de polvo mojable se dividió en 10 porciones (observaciones) de 300 g de peso, mismos que
se envasaron en fundas metalizada stand up con zipper de 16 cm x 24 cm con capacidad 500 g. Las
porciones fueron almacenadas a dos condiciones de temperaturas, una mitad a refrigeración a 4°C
y otra a 30°C.
18
Figura 6: Empaque y etiquetado del producto polvo mojable (WP) a dos condiciones de
almacenamiento.
Fuente: La autora.
Cuadro 3: Datos informativos correspondientes al etiquetado del polvo mojable.
Concentración teórica 3x108

Concentración real 6x108
Fecha de formulación 2017-08-02
3.10.2. Formulación del prototipo concentrado emulsionable (EC)

El concentrado emulsionable se elaboró mezclando las conidias puras y secas de Trichoderma
asperellum con excipientes inertes como aceite mineral y dispersante previamente seleccionados,
los porcentajes de cada ingrediente se muestran en el Cuadro 4.
Cuadro 4: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del concentrado
emulsionable (EC).

Conidias puras 8.33
Aceite de parafina 86.67
Tritón x-100 5.00
Total 100.00
Fuente: Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC
El prototipo se elaboró, utilizando el protocolo adaptado por el Laboratorio de Control Biológico

del INIAP- EESC, para lo cual se realizó un lote de producto de 3000 ml.
En la formulación de concentrado emulsionable, se midió un volumen de 2600.1 ml de aceite de
parafina al cual se adicionó un volumen de 150 ml de Tritón x-100, la solución se homogenizo
utilizando el Polytron PT 2100 a 15 000 rpm durante aproximadamente 5 minutos hasta observar
una mezcla homogénea con el dispersante, a esta mezcla se adicionaron 249.9 g de conidias puras
19
de Trichoderma asperellum y se homogenizó en el Polytron PT 2100 a 15 000 rpm durante
aproximadamente 3 minutos hasta obtener una mezcla homogénea.
Figura 7: Formulación del producto concentrado emulsionable (EC) a base de conidias de

Trichoderma asperellum.
Fuente: La autora.
El lote de concentrado emulsionable se dividió en 10 porciones y se envasaron en frascos de vidrio

color ámbar con capacidad de 500 ml, en cada frasco se colocaron 300 ml del prototipo. Las
porciones fueron almacenadas a dos condiciones de temperaturas, una mitad a refrigeración a 4°C
y la otra a 30°C.
Figura 8: Empaque y etiquetado de porciones del producto concentrado emulsionable (EC).

Fuente: La autora.
20
Cuadro 5:Datos informativos correspondientes al etiquetado del concentrado emulsionable.

3.10.3. Formulación del prototipo gránulo cubierto (CG)

Para el gránulo cubierto se utilizaron conidias puras y secas de Trichoderma asperellum, las cuales
se mezclaron con ingredientes inertes previamente seleccionados como goma, aceite vegetal,
arcilla y minerales (Cuadro 8 y Cuadro 9); los excipientes a excepción del almidón de yuca fueron
secados y esterilizados durante 24 horas antes de la formulación, en estufa Memmert SN 30 a
100°C.
Cuadro 6: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo
cubierto (CG).

Zeolita 77.81
Talco 1.04
Biomatrix 16.98
Total 100.00
Fuente: Adaptado de AgResearch Nueva Zelanda
Cuadro 7: Porcentajes de ingredientes que forman el Biomatrix para gránulo cubierto

Agua con Tritón x-100 11.44
Aceite de Canola 0.52
Goma Xanthan 0.52
Conidias Puras 4.49
Total 16.97
Se elaboró el prototipo, utilizando el protocolo adaptado de AgResearch Nueva Zelanda, para lo

cual se realizó un lote de 3000 g.
En el gránulo cubierto se obtuvo el Biomatrix que contiene el principio activo para lo cual se
mezclaron 15.6 g de aceite de canola con 15.6 g Goma Gellan, se mezcló hasta formar una masa
homogénea y se añadieron 134,.7 g de conidias de Trichoderma asperellum y 343.40 ml de agua
con Triton x-100 al 0.1%. Se mezclaron hasta obtener una masa semi líquida que corresponde al
Biomatrix. Se tomaron 3 muestras de Biomatrix para obtener la concentración en UFC/g.
21
Figura 9: Elaboración del Biomatrix para la formulación de gránulo cubierto (CG).
Fuente: La autora.
Al Biomatrix se incorporaron 2 334.3 g de Zeolita y se mezclaron hasta que todo el mineral se cubra;
posteriormente se agregaron 125 g de bentonita y talco en proporción 1:1 y se mezclaron hasta
recubrir el gránulo formado anteriormente, finalmente se adicionaron 31.2 g de talco. Los gránulos
cubiertos se colocaron en bandejas plásticas y se llevaron al área de secado a una temperatura de
18 °C y humedad relativa de 60 %, por un lapso de 24 horas.
Figura 10: Elaboración y secado del prototipo gránulo cubierto (CG).

Fuente: La autora.
Después del secado el gránulo cubierto se dividió en 10 porciones (observaciones) las cuales se
envasaron en fundas metalizadas stand up con zipper de 16 cm x 24 cm con capacidad de 500 g, en
cada funda se colocaron 300 g del prototipo. Las porciones se dividieron considerando las dos
temperaturas de almacenamiento 4°C y 30°C.
Las pruebas microbiológicas de este prototipo para el mes cero (formulación) se realizaron el día
de envasado del CG.
22
Figura 11: Empaque y etiquetado del gránulo cubierto (CG) para almacenamiento a dos
temperaturas.
Fuente: La autora.
Cuadro 8: Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo cubierto.

Fecha de empaque 2017-11-15
Tiempo de secado (horas) 22
3.10.4. Formulación del prototipo gránulo dispersable (WG)

Para el desarrollo del gránulo dispersable se utilizaron las conidias puras y secas de Trichoderma
asperellum, las cuales se mezclaron con excipientes inertes previamente seleccionados como goma,
arcilla, minerales y almidón; los ingredientes y sus porcentajes se presentan en el cuadro 6; los
excipientes a excepción del almidón de yuca fueron secados y esterilizados durante 24 horas antes
de la formulación, en estufa Memmert SN 30 a 100 °C.
Cuadro 9: Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo
dispersable (WG).
Ingredientes Porcentaje (%)
Goma Gellan 0.83
Almidón de yuca 3.30
Conidias puras 7.10
Agua con Tritón x-100 al 0,1% 35.80
Total 100.00
Fuente: Protocolo adaptado de AgResearch Nueva Zelanda
23
El prototipo se elaboró, utilizando el protocolo adaptado de AgResearch Nueva Zelanda, para lo
cual se realizó un lote de 3000 g.
En la formulación de gránulo dispersable se pesaron 213 g de conidias puras, se adicionaron 24.9 g
de Goma Gellan y agua con Tritón x-100 al 0.1 %, se mezclaron hasta obtener una pasta homogénea
sin grumos. A la mezcla se adicionaron 1588.8 g de bentonita y talco en proporción 1:1 y 99.0 g de
almidón de yuca, se obtuvieron pellets o gránulos pequeños pasando la mezcla por un cedazo
plástico. Los gránulos se colocaron en el área de secado a una temperatura de 18 °C y una humedad
relativa de 60%, por un lapso de 22 horas.
Figura 12: Elaboración del Gránulo Dispersable (WG).

Fuente: La autora.
Los gránulos dispersables se dividieron en 10 porciones (observaciones), envasadas en fundas

metalizadas stand up con zipper de 16 cm x 24 cm con capacidad de 500 g, en cada funda se
colocaron 300 g del prototipo. Las porciones se almacenaron a dos temperaturas correspondientes
a refrigeración a 4°C y a 30°C.
Figura 13: Secado del Gránulo Dispersable (WG).

Fuente: La autora.
Las pruebas microbiológicas para este prototipo en el mes cero (formulación) se realizaron el día
de envasado del producto.
24
Figura 14: Empaque y división de gránulos dispersables (WG) para almacenamiento a dos
temperaturas.
Fuente: La autora.
Cuadro 10: Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo dispersable.

Fecha de empaque 2017-11-29
Tiempo de secado (horas) 24
3.11. Análisis de calidad microbiológica de bioformulaciones a base de

Trichoderma asperellum
El análisis de los prototipos se realizó mensualmente considerado el porcentaje de germinación y
la concentración de unidades formadoras de colonias (UFC). Las evaluaciones se realizaron a partir
del mes de formulación y durante seis meses bajo condiciones de almacenamiento a dos
temperaturas.
3.11.1. Porcentaje de germinación de conidias (%)

La determinación del porcentaje de germinación se realizó en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar
(PDA) (Cuadro 11), para lo cual se tomaron muestras de 1g o 1ml de cada prototipo almacenados a
las diferentes temperaturas.
Cuadro 11: Medio de cultivo utilizado en el porcentaje de germinación de conidias.
PDA (Papa Dextrosa Agar) 39 g/l
Las muestras se reconstituyeron en tubos con 9ml de agua destilada con dispersante (Tritón x-100
al 0.1%), se homogenizaron en vórtex por aproximadamente un minuto y se extrajeron alícuotas de
1ml de la suspensión inicial, a partir de esta, se realizaron diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-3
sembrándose en cajas Petri que contenían el medio de cultivo únicamente las diluciones 10-2 y 103.
Las muestras sembradas se incubaron durante 24 horas a temperatura de 25 °C, transcurrido este
25
tiempo se realizó el contaje de 100 conidias entre germinadas y no germinadas utilizando un
microscopio óptico con lente 40X, finalmente se registró el porcentaje de conidias germinadas en
relación con los datos registrados.
3.11.2. Determinación de la concentración de colonias en UFC/g o ml

La concentración de colonias se determinó utilizando la técnica de recuento en caja Petri en medio
de cultivo (Cuadro 12).
Cuadro 12: Medio de cultivo para cuantificación de colonias de Trichoderma asperellum
PDA (Papa Dextrosa Agar). 39 g/L
Ácido Láctico. 320 µl/ L
Tritón X – 100 0.1%
Mensualmente se tomaron muestras de 1g o 1ml de cada prototipo almacenado a las diferentes
temperaturas, las cuales fueron reconstituidas en tubos con 9ml de agua destilada con Tritón x-100
al 0,1%. La solución se homogenizó en vórtex por aproximadamente un minuto y se extrajo 1ml de
la suspensión a partir de la cual se realizaron diluciones seriadas en agua con dispersante desde 101
hasta 10-6, las muestras se sembraron por duplicado en las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 en cajas Petri
conteniendo el medio de cultivo. Las muestras sembradas se incubaron durante 7 días a 25°C, los
recuentos se realizaron en cajas Petri que contenían entre 10 y 99 colonias considerando una misma
dilución.
El calculó de la concentración de colonias se realizó aplicando la siguiente fórmula:
N° de UFC = (X) x (FD) x (FA)
Donde:
X = Promedio de 2 lecturas en cajas Petri de una misma dilución
FD = Factor de dilución
FA = Factor de ajuste
3.11.3. Determinación de la pureza

El contenido de contaminantes se evaluó reconstituyendo 1 g o 1 ml de las muestras de cada
prototipo en 9 ml de agua con Tritón x-100 al 0,1%. Se extrajo 1 ml de la suspensión y se realizaron
diluciones seriadas desde 10-1 a 10-4. Se sembraron las muestras por duplicado considerando la
dilución 10-4, se incubaron durante 7 días a una temperatura constante de 25°C. Se realizaron
contajes de colonias pertenecientes a Trichoderma asperellum, así como de los contaminantes. El
contenido de contaminantes se obtuvo aplicando la fórmula 1 y posteriormente se calculó el
porcentaje de pureza de las formulaciones, con la fórmula 2 (Berlanga y Hernández, 2006).
Fórmula 1:
𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐚 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐚𝐦𝐢𝐧𝐚𝐧𝐭𝐞 (𝐔𝐅𝐂)
𝐱 𝟏𝟎𝟎 = % 𝐝𝐞 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐚𝐦𝐢𝐧𝐚𝐜𝐢ó𝐧
𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐚 𝐝𝐞𝐥 𝐡𝐨𝐧𝐠𝐨 (𝐔𝐅𝐂)
26
Fórmula 2:
% Pureza= 100% - %de contaminación
3.11.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación (%)

La eficiencia del proceso de formulación se determinó el día de elaboración de cada prototipo
tomando 10 muestras de 1 g o 1 ml de cada producto. Para obtener el porcentaje de eficiencia del
proceso de formulación, se consideraron los parámetros de contenido de colonias puras, para el
caso de gránulos se tomaron muestras del biomatrix, mientras que para polvo mojable y
concentrado emulsionable se tomaron muestras de la concentración de colonias obtenidas a partir
de las conidias secas en las formulaciones finales expresadas en UFC.
El nivel de eficiencia de los prototipos de bioformulaciones se obtuvo utilizando la siguiente fórmula
adaptada por el laboratorio de control biológico de la EESC:
E = ((A x B) / (C x D)) x 100
Donde:
A = Cuantificación de colonias del hongo en conidias secas (UFC/g).
B = Cantidad de conidias secas utilizadas en la formulación (g).
C = Volumen o peso de otros ingredientes en la formulación (ml o g).
D = Cuantificación de colonias del hongo en formulación (UFC/ml o g).
3.12. Caracterización fisicoquímica de los prototipos de bioformulaciones.
La caracterización fisicoquímica de los cuatro prototipos de bioformulaciones se realizó

inmediatamente después de la elaboración de cada producto y mensualmente durante seis meses
de almacenamiento a dos temperaturas (4 °C, ambiente de refrigeración y 30 °C, temperatura
ambiente promedio de la Región Costa del Ecuador).
3.12.1. Humedad (%)

El porcentaje de humedad se determinó siguiendo las recomendaciones establecidas por el
Laboratorio de Control Biológico, INIAP-EESC. En un medidor de humedad Boeco Modelo BMA 150,
se pesaron 2.0 g del producto en un plato de aluminio específico para el equipo y se inició el secado
de la muestra a 100 °C. Después de un tiempo que osciló entre 5 a 25 minutos según el tipo de
formulado, se registró el porcentaje de humedad en la pantalla del equipo.
3.12.2. Actividad de agua (aw)

La actividad de agua se determinó según las recomendaciones del Laboratorio de Control Biológico.
En un medidor de aw Aqua Lab modelo 4TE, se ubicó un recipiente plástico con una muestra de 2.0g
de formulado en el cual se consideró que la base se encuentre completamente cubierta por el
producto y se inició la medición. Se registró el valor de actividad de agua del bioformulado y
temperatura de medición en la pantalla del equipo. La actividad de agua se realizó en todos los
prototipos realizados.
27
3.12.3. Densidad apisonada (g/ml)
La prueba de densidad apisonada se realizó basándose en la norma MT 33 del CIPAC. Se pesaron
5.0 g del producto y se colocaron en una probeta de 50 ml de base plástica ubicada dentro de un
soporte de madera. La probeta se levantó a 5 cm de la madera y se dejó caer sobre la base del
soporte. Este proceso se repitió mecánicamente por 50 veces. Al finalizar, se registró el volumen
(V) de la muestra apisonada y se determinó la densidad apisonada (D) aplicando la fórmula
(Quiroga, 2009), en prototipos sólidos, polvo mojable y granulaciones.
D = 5 g/ V
3.12.4. Determinación de pH
Se preparó la muestra para análisis con 5,0 g del formulado reconstituido en 50 ml de agua destilada
desionizada, la solución se homogenizó con agitador magnético a 150 rpm durante dos minutos y
se determinó el valor de pH mediante lectura con un pH metro Hach modelo Sension 3 previamente
calibrado. La determinación de pH se realizó en todos los prototipos realizados.
3.12.5. Humectabilidad (minutos)

Esta prueba se determinó según la norma CIPAC MT 53.3. Se adicionaron 5.0 g del producto desde
una altura de 25 cm en un vaso de precipitación de 250 ml con 100 ml de agua destilada sin ningún
tipo de agitación. Se registró el tiempo en segundos que tardó el producto en humedecerse
completamente. La humectabilidad se determinó en prototipos sólidos, polvo mojable y gránulos.
3.12.6. Suspendibilidad (%)

La suspendibilidad del bioformulado se determinó basándose en la norma CIPAC MT 168. Se
reconstituyó el prototipo, adicionando 2,5 g del producto en un vaso de precipitación de 250 ml
con 50 ml de agua destilada previamente calentada a 30 °C. La solución se mezcló durante dos
minutos a 120 rpm con un agitador magnético y posteriormente se colocó la suspensión preparada
en una probeta de 250ml con el mismo volumen de agua destilada, se selló la probeta con una
funda plástica sujetada por una liga y a continuación, se invirtió la probeta 30 veces a 180° durante
1 minuto y se ubicó en incubación a 30 ± 1 °C por 30 minutos. Posteriormente con una pipeta de
10ml, se extrajeron 225ml de la suspensión a 600 rpm considerando una misma altura de
extracción, el sedimento se transfirió con agua destilada a una caja Petri de peso conocido y se llevó
en estufa a 90°C durante 24 horas, se registró el peso final de los sólidos de la muestra y se calculó
el porcentaje de suspendibilidad aplicando la fórmula (Quiroga, 2009) en prototipos sólidos, polvo
mojable y gránulos.
111 (1-a/w)
Donde:
a =Peso de la masa seca en los 25 ml de residuo
w=Peso de la muestra inicial (2.5 g)
3.12.7. Tamaño de partícula (%)

El tamaño de la partícula se determinó con 10 g del prototipo. El producto se pesó y colocó en una
columna de tamices de poro conocido ordenados de mayor a menor correspondientes a 2mm,
1,7mm, 250µm, 150µm y 53µm para formulaciones granuladas y 500µm, 250µm, 150µm, 106µm,
28
y 53µm para polvo mojable ambas columnas seguidas de un colector en la base. La columna de
tamices se ubicó en un agitador vibratorio marca KARL KOLB por 5 minutos, transcurrido este
tiempo, se pesó el material retenido en cada tamiz. El rango de tamaño de partícula se analizó
mediante una distribución de frecuencias. El porcentaje de tamaño de partícula se determinó en
prototipos sólidos, polvo mojable y gránulos.
3.12.8. Estabilidad del concentrado emulsionable (ml)

La estabilidad del concentrado emulsionable se determinó según en la norma CIPAC MT 20, la cual
consistió en reconstituir la emulsión en agua destilada y observar si esta es estable por la formación
de crema y en caso de separación de fases ver si es reversible a formas emulsión. La reconstitución
del concentrado emulsionable se realizó en un vaso de precipitación de 100 ml con 28 ml de agua
destilada al cual se le adicionó gota a gota 2 ml del producto oleoso, mezclando el sistema con una
barra de cristal dirigiendo el flujo hacia el centro del vaso de precipitación. El líquido reconstituido
se transfirió a una probeta de 100 ml la cual se llenó hasta el mismo volumen con agua destilada y
se dejó en reposo durante una hora. Transcurrido este tiempo, se observaron y registraron los
cambios en la emulsión.
29
IV. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El diseño experimental para la determinación de las características fisicoquímicas y microbiológicas
fue arreglo factorial 2X4 en Diseño Completamente al Azar (DCA). Cada prototipo consistió en 10
observaciones, que partieron de un mismo lote de formulación con un total de 40 unidades
experimentales (UE), divididas entre las dos temperaturas de almacenamiento (4°C y 30 °C), con 20
UE/cada una.
Los resultados fueron evaluados con el fin de establecer el efecto del tiempo y la temperatura de
almacenamiento sobre la viabilidad de Trichoderma asperellum en los bioformulados y para
determinar en cuál de estos presenta mayor estabilidad.
La normalidad y varianzas constantes de los resultados fueron determinadas mediante las pruebas
de Shapiro Wilks y Levene, respectivamente. Una vez demostrados estos principios, se procedió a
un análisis de varianza ANOVA y a pruebas de comparación de medias DMS (Least significant
difference) y Tukey (alfa 0.05%). Las variables que presentaron resultados no paramétricos se
evaluaron mediante la prueba Kraskall Wallis y Dunnett para comparación de medias. Se utilizó el
programa estadístico Infostat versión estudiantil 2017.
4.1. Factores en estudio
4.1.1. Prototipos de bioformulaciones (P)

Se realizaron cuatro diferentes prototipos de bioformulaciones con Trichoderma asperellum.
P1: Prototipo en gránulo dispersable
P2: Prototipo en gránulo cubierto
P3: Prototipo en polvo mojable
P4: Prototipo en concentrado emulsionable
4.1.2. Temperaturas de almacenamiento (T)
Los prototipos de bioformulaciones se almacenaron a dos temperaturas diferentes, considerando
el lugar de prospección del microorganismo y temperaturas promedio en cultivos de banano del
Ecuador, factor importante para su posterior uso:
T1: Temperatura a 4°C
T2: Temperatura a 30°C
4.1.3. Tratamientos
Los tratamientos resultaron de la interacción de los factores en estudio: Prototipos (4) x
Temperaturas (2), en total 8 tratamientos (Cuadro 13).
30
Cuadro 13: Tratamientos correspondientes a los 4 prototipos de bioformulaciones desarrolladas a
base de conidias Trichoderma asperellum.
Tratamiento Código Descripción

T1 P1T1 Prototipo en gránulo dispersable a 4 °C
T2 P1T2 Prototipo en gránulo dispersable a 30 °C
T3 P2T1 Prototipo en gránulo cubierto a 4 °C
T4 P2T2 Prototipo en gránulo cubierto a 30 °C
T5 P3T1 Prototipo en polvo mojable a 4 °C
T6 P3T2 Prototipo en polvo mojable a 30 °C
T7 P4T1 Prototipo en concentrado emulsionable a 4 °C
T8 P4T2 Prototipo en concentrado emulsionable a 30 °C
Fuente: La autora
4.2. Esquema del experimento
4 ºC 30 ºC
Ob1 Ob2 Ob3 Ob4 Ob5 Ob1 Ob2 Ob3 Ob4 Ob5
P1T1 P2T1 P3T1 P4T1 P2T1 P1T2 P2T2 P4T2 P3T2 P2T2
Figura 15: Esquema de la disposición de las unidades experimentales.

Fuente: La autora
Figura 16: Disposición de las unidades experimentales según cada tratamiento a diferentes
temperaturas de almacenamiento.
Fuente: La autora
31
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Caracterización microbiológica de los prototipos

El análisis de calidad efectuado a los bioformulados antes y durante el almacenamiento a dos
temperaturas, consideró como parámetros importantes el porcentaje de germinación,
concentración de colonias del hongo en unidades formadoras de colonia (UFC), la pureza y el nivel
de eficiencia del proceso de formulación.
5.1.1. Porcentaje de germinación

Expresa el total de conidias que se encuentran viables, es decir que tienen la capacidad de germinar.
Un producto se considera de alta calidad cuando alcanza niveles cercanos al 100% de germinación,
considerando que a medida que esta se reduce pierde su capacidad de establecerse en campo y su
efectividad sobre la plaga (Granada, 2000).
Las evaluaciones del porcentaje de germinación en los bioformulados sólidos y el líquido

desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum se realizaron antes y durante los seis
meses de almacenamiento a dos temperaturas. Los prototipos polvo mojable y concentrado
emulsionable se evaluaron inmediatamente después de su elaboración, mientras que para los
prototipos granulados se evaluaron el día de envasado. El análisis estadístico del porcentaje de
germinación se realizó por transformación de datos con arcoseno.
El análisis de los supuestos del ANOVA determinó normalidad según Shapiro Wilks y
homocedasticidad mediante la prueba de Levene, antes y durante seis meses de almacenamiento
a dos temperaturas (Cuadro 14). Con base en lo anterior, se analizó los resultados paramétricos
mediante ANOVA y pruebas de comparación de medias según DMS al 5% para prototipos (P),
temperaturas (T) y al presentarse interacción P x T se utilizó Tukey con un alfa 0.05%. Las medias
para los meses con resultados no paramétricos se determinaron mediante Dunnette.
Cuadro 14: Normalidad y homocedasticidad del porcentaje de germinación antes y durante los seis
meses de almacenamiento a dos temperaturas.
Porcentaje de germinación de conidias (%) Normalidad Varianzas constantes

Inicial 0.388 0.9123
1er mes 0.4945 0.9674
2do mes 0.4956 0.5422
3er mes 0.166
4to mes 0.6038
Na
5to mes
Na
6to mes
* Na: no se encontró normalidad o varianzas constantes
El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 15), determinó que los prototipos inicialmente presentaron
diferencias significativas entre sí, por lo contrario, las temperaturas de almacenamiento y la
interacción de estos dos factores no presentaron diferencias significativas. A partir del segundo
mes de almacenamiento los factores prototipos, temperaturas y la interacción presentaron
diferencias significativas sobre la germinación del hongo.
32
La viabilidad microbiológica de las conidias de Trichoderma asperellum, se evaluó mensualmente
presentando diferencias altamente significativas a partir del 2do hasta el 4to mes de
almacenamiento, encontrándose mayor porcentaje de germinación de conidias a 4 °C, y menor
porcentaje a 30 °C (Cuadros 16). Por lo tanto, se consideró que las temperaturas influyeron sobre
el porcentaje de germinación de las conidias en almacenamiento.
Cuadro 15: ANOVA del porcentaje de germinación después de formulados los prototipos y durante
dos meses de almacenamiento a 4 y 30°C.
Fuentes de variación Gl Cuadrados medios1 y p – valor2

Inicial 1er mes 2do mes
Total 39
Prototipos (P) 3 0.031 0.0005**2 0.04 <0.0001*** 0.38 <0.0001***
Temperatura (T) 1 0.001 0.5778 0.0002 0.7962 1.11 <0.0001***
PxT 3 8E-04 0.8818 0.0009 0.8429 0.18 <0.0001***
Error 32 0.004 0.0032 0.003
Promedio 0.01 0.01 0.42
Coeficiente de variación (%) 4.50 4.50 4.94
* Presenta diferencias significativas; ** Diferencias altamente significativas; *** Diferencias altamente
significativas.
Cuadro 16: ANOVA del porcentaje de germinación del 3er al 4to mes de almacenamiento, a dos
temperaturas.
Fuentes de variación Gl Cuadrados medios y p – valor

3er mes 4to mes
Total 39
Prototipos (P) 3 0.89 <0.0001*** 0.75 <0.0001***
Temperatura (T) 1 3.17 <0.0001*** 4.01 <0.0001***
PxT 3 0.55 <0.0001*** 0.45 <0.0001***
Error 32 0.01 0.003
Promedio 1.16 1.30
Coeficiente de variación (%) 8.77 6.42
significativas.
La prueba DMS al 5% para prototipos (Cuadro 17), inicialmente presentó tres rangos de
significación, encontrándose en el primer rango la formulación de gránulo dispersable (WG), con
mejor respuesta a la variable y 96.17 % de germinación, seguido de WP con 93.91 % de germinación
y en el último rango EC con menor efecto sobre la germinación de conidias (%). Por el contrario,
para el factor temperatura de almacenamiento y la interacción no presentaron diferencias
significativas entre las medias.
Después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, para la interacción P x T, se realizó
la prueba de Dunnett al 5%, determinado que el mejor bioformulado fue WP almacenado a 4 °C;
33
mientras que WG, CG y EC a 30 °C, presentaron menor respuesta al porcentaje de germinación, al
cabo de 24 horas.
Cuadro 17: Medias del porcentaje de germinación después de la elaboración de los prototipos y
durante seis meses de almacenamiento a dos temperaturas.
Medias1 y Rangos de Significación2

Prototipos (P)
Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes
Granulo
dispersable 1.371 A2 1.3 A 1.12 B 1.04 B 0.93 B 0.61 B 0.56 B
(P1)
Gránulo
1.28 BC 1.26 A 0.91 C 0.57 D 0.57 D 0.56 A 0.54 B
cubierto (P2)
Polvo mojable
1.33 AB 1.32 A 1.28 A 1.24 A 1.20 A 1.18 B 1.17 A
(P3)
Concentrado
emulsionable 1.26 C 1.18 B 0.86 D 0.76 C 0.73 C 0.60 B 0.53 B
(P4)
Temperaturas
(T)
4°C (T1) 1.31 A 1.27 A 1.21 A 1.18 A 1.17 A 1.16 A 1.12 A
30°C (T2) 1.32 A 1.26 A 0.87 B 0.62 B 0.54 B 0.32 B 0.28 B

Prototipos x
Temperaturas
P1T1 1.37 A 1.30 AB 1.27 A 1.27 A 1.24 AB 1.22 A 1.11 B
P1T2 1.38 A 1.30 AB 0.98 C 0.81 C 0.61 D 0.00 D 0.00 C
P2T1 1.28 B 1.26 ABC 1.21 A 1.14 AB 1.13 BC 1.12 AB 1.09 B
P2T2 1.29 AB 1.26 ABC 0.61 D 0.00 E 0.00 F 0.00 D 0.00 C
P3T1 1.33 AB 1.31 AB 1.27 A 1.24 AB 1.25 A 1.22 A 1.21 A

1.16
P3T2 1.33 AB 1.32 A 1.29 A 1.24 AB 1.15 AB 1.12 B
ABC
P4T1 1.28 AB 1.20 BC 1.09 B 1.08 B 1.06 C 1.07 B 1.06 B
P4T2 1.24 B 1.16 C 0.63 D 0.43 D 0.39 E 0.13 C 0.00 C

* Medias con una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0,02); Tukey: (p > 0,05);
Dunnette: alfa 0,05 (meses sin homocedasticidad).
Los prototipos granulados WG y CG presentaron un porcentaje de germinación inicial de 96.17% y

91.98%, respectivamente. Después de seis meses de almacenamiento WG tuvo una reducción del
16.45% a 4 °C y 100 % a 30°C. El CG presentó similares reducciones con un 14.89% a 4°C y 100% a
34
30°C (Cuadro 18). La disminución de la viabilidad en los prototipos granulados almacenados a altas
temperaturas provocó el daño en las conidias del hongo retardando su crecimiento o provocando
su muerte. Por otra parte, el almacenamiento a 4°C permitió el mantenimiento de una germinación
superior al 50%.
El porcentaje de germinación inicial del prototipo polvo mojable fue de 93.6% y después de seis
meses de almacenamiento presentó una disminución de la viabilidad de 6.71% y 13.96% a 4 y 30°C,
respectivamente (Cuadro 14), encontrándose dentro de los parámetros de aceptación para
porcentaje de germinación de conidias después de 24 horas. Por otro lado, concentrado
emulsionable presentó una germinación inicial de 90.36 % y después de seis meses obtuvo una
reducción de 15.89% y 100% a 4 y 30°C, respectivamente.
Cuadro 18: Porcentaje de germinación de los bioformulados, antes y después de seis meses de
almacenamiento, a dos temperaturas.
Porcentaje de germinación (%)

Prototipos
Inicial 6to mes
4°C 80.35
Gránulo Dispersable (WG) 96.17
30°C 0.00
Gránulo Cubierto 4°C 78.28
91.98
(CG) 30°C 0.00
Polvo Mojable 4°C 87.60
93.91
(WP) 30°C 80.80
Concentrado Emulsionable 4°C 76.00
90.36
(EC) 30°C 0.00
Granada (2000), señaló que la capacidad de sobrevivencia de las conidias en una formulación
depende de factores como contenido de humedad y temperaturas de almacenamiento. Así mismo,
expresa que la refrigeración (4 - 5 °C) puede mantener la viabilidad hasta por un año.
De acuerdo con Marín y Bustillo (2016), una formulación comercial debe tener una germinación
superior al 85% después de un tiempo de incubación de 24 horas, tomando en cuenta que el hongo
al ser aplicado en campo debe poseer un rápido efecto sobre la población plaga, atacando en un
corto periodo de exposición a condiciones ambientales adversas.
González, Valbuena, Rivera, Bustillo y Chaves, (1996), mencionaron que la germinación del hongo
entomopatógeno Metarhizium anisopliae a las 24 horas fue de 70%, debido a daños de la conidias
o al desarrollo de un mecanismo protector llamado choque proteico ocasionados por efecto de la
temperatura elevada de almacenamiento.
Troytiño, Fernandez, & Lara, (2007), determinaron que formulaciones a base de B. bassiana
almacenadas a 26°C tienden a bajar la viabilidad de manera casi lineal a lo largo del tiempo,
mientras que si se almacena a 4°C se puede conservar hasta por un año con mayor estabilidad.
En un estudio similar en polvo mojable a base de Trichoderma koningiopsis Th003 Corpoica (2010),
recomendó que la conservación del prototipo en polvo deba realizarse a temperaturas de entre 4°C
y 18°C para asegurar su calidad y efectividad durante su vida útil.
35
Por lo tanto, el mejor prototipo basado en el porcentaje de germinación de las conidias fue polvo
mojable que presentó una reducción mínima al cabo de seis meses de almacenamiento a 4°C
conservando un 87.6% de germinación. Los porcentajes de germinación de WP a menor
temperatura se encontraron dentro de los parámetros de calidad propuestos por el Laboratorio de
Control Biológico, INIAP-EESC, es decir la viabilidad fue superior al 85%. También se debe tomar en
cuenta que polvo mojable a 30 °C mantuvo una germinación del 80.8%, lo cual es importante debido
a que las formulaciones realizadas tienen como finalidad su aplicación en cultivos de banano de la
Región Litoral del Ecuador.
5.1.2. Concentración de colonias en UFC

La evaluación de la estabilidad microbiológica de los prototipos en estudió se determinó mediante
la evaluación de la concentración por la técnica de recuento en caja Petri antes y durante seis meses
de almacenamiento a 4°C y 30°C. El análisis de los resultados se realizó después de transformar la
concentración en UFC/g a Log UFC/g.
El análisis de los supuestos del ANOVA (Cuadro 19) determinó normalidad según Shapiro Wilks y
homocedasticidad mediante la prueba de Levene, antes y durante seis meses de almacenamiento
a dos temperaturas. Con base en lo anterior, se analizó los resultados paramétricos mediante
ANOVA y pruebas de comparación de medias según DMS al 5% para prototipos (P), temperaturas
(T) y al presentarse interacción P x T se utilizó Tukey con un alfa 0,05%. Las medias para los meses
con resultados no paramétricos se determinaron mediante Dunnette.
Cuadro 19: Normalidad y varianzas constantes de la concentración en Log UFC/g de lo

bioformulados, antes y durante los seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.
Concentración en LOG UFC/g Normalidad Varianzas constantes

Inicial 0.6804 0.807
1er mes 0.4365 0.5435
2do mes 0.3439 0.2378
3er mes 0.1211 0.2885
4to mes 0.1105 0.2313
5to mes Na
Na
6to mes 0.1267
El análisis de varianza ANOVA (Cuadro 20) determinó que los prototipos inicialmente presentaron
diferencias significativas entre sí, por lo contrario, las temperaturas de almacenamiento y la
interacción de estos dos factores no presentaron efectos significativos a partir del segundo mes de
almacenamiento los factores prototipos, temperaturas y la interacción presentaron diferencias
significativas sobre la viabilidad de Trichoderma asperellum.
La estabilidad microbiológica de Trichoderma asperellum se evaluó durante seis meses en cuatro

bioformulados observándose que las temperaturas de almacenamiento tuvieron un efecto
altamente significativo encontrándose mayor concentración de colonias en UFC a 4°C y menor
concentración a 30°C (Cuadro 21).
36
Cuadro 20: ANOVA del porcentaje de la concentración de colonias (Log UFC/g) después de
formulados los prototipos y durante dos meses de almacenamiento, a dos temperaturas.

Inicial 1er mes 2do mes
Total 39
Prototipos (P) 3 0.191 0.0013(2) ** 0.54 <0.0001*** 1.08 <0.0001***
Temperatura (T) 1 0.01 0.6671 0.34 0.0001** 7.02 <0.0001***
PxT 3 0.02 0.5184 0.0024 0.9307 2.02 0.0001**
Error 32 0.03 0.02 2.12
Promedio 0.0625 0.2256 3.06
significativas.
Cuadro 21: ANOVA de la concentración de colonias (Log UFC/g) a partir 3er al 6to mes de

3er mes 4to mes 6to mes
Total 39
Prototipos (P) 3 2.591 <0.0001***(2) 6.73 <0.0001*** 28.32 <0.0001***
Temperatura (T) 1 18.39 <0.0001*** 42.15 <0.0001*** 147.42 <0.0001***
PxT 3 1.44 <0.0001*** 6.96 <0.0001*** 28.46 <0.0001***
Error 32 0.03 0.03 0.01
Promedio 5.61 13.97 51.05
significativas.
El análisis estadístico de comparación de medias DMS al 5% (Cuadro 22), determinó inicialmente

dos rangos de significación para los prototipos, encontrándose en el primer rango WP, EC y WG con
mejor respuesta a la variable, mientras que CG en el segundo rango con 3.92 x108 UFC/g y menor
efecto sobre la concentración de colonias en UFC. Los bioformulados polvo mojable, gránulo
dispersable y concentrado emulsionable, sobrepasaron la concentración teórica deseada 5x108
UFC/g después de su elaboración. Por el contrario, gránulo cubierto con 3x108 UFC/g no alcanzó la
concentración inicial propuesta por el Laboratorio de Control Biológico del Departamento de
Protección Vegetal INIAP-EESC (Anexo 2).
Después de seis meses de almacenamiento de los prototipos la comparación de medias DMS al 5%,
presentó cuatro rangos de significación, dejando en el primer rango a WP con 108UFC/g con mejor
respuesta a la variable, por lo tanto, mayor estabilidad en el tiempo; seguido de CG con 107UFC/g,
EC con 106UFC/g y finalmente WG con 104UFC/g con menor respuesta a la variable. La temperatura
a la cual se presentó mayor estabilidad microbiológica de Trichoderma asperellum fue 4°C, en todos
37
los casos y en todos los meses de evaluación, al contrario del almacenamiento a 30°C donde hubo
una reducción hasta del 100% en la concentración de colonias en UFC/g. Los factores en estudio a
partir del segundo mes y hasta el sexto mes de evaluación evidenciaron la misma tendencia en el
comportamiento de la viabilidad a las diferentes temperaturas de almacenamiento, permitiendo
recomendar que el almacenamiento de productos bioformulados se realice a temperaturas de
refrigeración la cual garantiza su estabilidad y prolonga la vida útil del producto.
La interacción P x T al sexto mes de almacenamiento, determinó que los mejores prototipos fueron
Polvo mojable y Concentrado emulsionable almacenados a 4°C, debido a su alta estabilidad con
valores superiores a 1x108UFC/g límite de aceptación propuesto por el Laboratorio de Control
Biológico.
Cuadro 22: Medias de la concentración (Log UFC/g) después de formulados los prototipos y durante
seis meses de almacenamiento, a dos temperaturas.
Medias y Rangos de Significación
Prototipos (P)
Granulo
8.75 A 8.71 A 8.04 B 7.54 B 6.47 C 5.93 D 4.23 D
dispersable (P1)
Gránulo cubierto
8.51 B 8.26 B 7.83 BC 7.44 B 7.38 B 7.41 B 7.34 B
(P2)
Polvo mojable
8.78 A 8.72 A 8.44 A 8.52 A 8.48 A 8.19 A 8.13 A
(P3)
Concentrado
8.81 A 8.40 B 7.68 C 7.56 B 7.5 B 7.06 C 6.40 C
emulsionable (P4)
Temperaturas (T) Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes
4°C (T1) 8.72 A 8.61 A 8.42 A 8.44 A 8.48 A 8.46 A 8.44 A
30°C (T2) 8.70 A 8.43 B 7.58 B 7.09 B 6.43 B 5.83 B 4.60 B
Prototipos x
Temperaturas
P1T1 8.83 A 8.79 A 8.48 A 8.45 AB 8.59 A 8.54 A 8.46 AB
P1T2 8.68 AB 8.63 AB 7.60 B 6.62 C 4.35 C 3.33 E 0.00 F
P2T1 8.46 B 8.35 CD 8.19 A 8.28 B 8.31 A 8.28 A 8.26 B
P2T2 8.55 AB 8.16 D 7.47 B 6.60 C 6.45 B 6.54 C 6.42 D
P3T1 8.79 AB 8.8 A 8.56 A 8.63 A 8.56 A 8.55 A 8.57 A
P3T2 8.77 AB 8.63 AB 8.32 A 8.41 AB 8.39 A 7.83 B 7.68 C
P4T1 8.81 AB 8.51 BC 8.43 A 8.52 A 8.48 A 8.47 A 8.47 A
P4T2 8.80 AB 8.28 CD 6.93 C 6.71 C 6.52 B 5.64 D 4.32 E
* Medias con una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0,02); Tukey: (p > 0,05);
Dunnette: alfa 0,05 (en meses sin varianzas constantes).
Los bioformulados WG, CG, WP y EC presentaron concentración de colonias iniciales de 5.88x108,

3.92x108, 6,16x108 y 6.48x108UFC/g, respectivamente. Después de seis meses de almacenamiento
a 4°C y 30°C se obtuvo una reducción de concentración de colonias de 50.51%, 100.0%, 99.52%,
38
99.30%, 38.96%, 91.99% y 53.39% y 99.99%, respectivamente para cada prototipo y temperaturas
de almacenamiento (Cuadro 23).
Los prototipos granulados almacenados a 4°C mantuvieron una estabilidad del microorganismo
conservando una concentración de colonias superior a 1x108 en el gránulo dispersable y 1x105 en
la formulación de gránulo cubierto, la reducción de la estabilidad del principio activo en estos
formulados especialmente en gránulo cubierto se originó por efecto del elevado porcentaje de
humedad con que fue almacenado el producto, recomendándose la extensión del tiempo de secado
antes de empaque para asegurar la cobertura del bioformulado.
Cuadro 23: Concentración de colonias (UFC/g) de los bioformulados, antes y después de seis meses
de almacenamiento, a dos temperaturas.
Concentración de colonias en UFC/g

Prototipos
Inicial 6to mes
4°C 2.91x108
8
Gránulo Dispersable (WG) 5.88x10
30°C 0.00
Gránulo Cubierto 4°C 1.85x106

8
3.92x10
(CG) 30°C 2.71x106
Polvo Mojable 4°C 3.76x108

6.16x108
(WP) 30°C 4.93x107
Concentrado Emulsionable 4°C 3.02x108

6.48x108
(EC) 30°C 2.18x104
Corpoica (2010), mencionó que Trichoderma konongiopsis Th003, en formulaciones de polvo

mojable mostró mayor estabilidad y vida útil cuando fue almacenado a una temperatura de 4°C,
presentándose una disminución de los valores a medida que aumentó a 28°C.
En estudios similares Zhang et al., (2006), observaron una viabilidad del principio activo entre 7.8 y
8 Log UFC/g cuando el producto fue almacenado a 4°C, mientras que a 25°C hubo una reducción
hasta valores inferiores a 5 Log UFC/g, luego de 14 semanas.
Por consiguiente, solo prototipos almacenados en refrigeración presentaron una vida útil y
estabilidad por seis meses, asegurando la estabilidad de las conidias de Trichoderma asperellum. El
almacenamiento a temperaturas elevadas reduce la estabilidad del microrganismo corroborando
la reducción de su viabilidad después de 24 horas.
5.1.3. Pureza
El contenido de contaminantes en una formulación puede acarrear una pérdida en la eficacia del
ingrediente activo por un efecto de competencia con los microorganismos contaminantes, los
cuales pueden ocasionar un efecto inhibitorio, debido a la producción de metabolitos secundarios
(Torres, 2009).
39
Según el Senasa (1999), el nivel de contaminantes no debe ser mayor al 0.1% y bajo ninguna
circunstancia se deben encontrar patógenos de plantas o animales en las formulaciones biológicas.
Los niveles de contaminantes encontrados en las bioformulaciones desarrolladas a base de conidias
de Trichoderma asperellum fueron menores a 0.1% en todos los meses de almacenamiento,
considerando que en el mes de manufacturación (inicial) se determinó mayor presencia de
contaminantes (Gráfico 1).
Porcentaje de contamiación (%)
0,02
0,01
0,00
Gránulo Dispersable Gránulo Cubierto

Polvo Mojable Concentrado Emulsionable
Gráfico 1: Porcentaje de contaminación de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento.
100,00
90,00
Pureza de los bioformulados (%)
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Gránulo Dispersable Gránulo Cubierto Polvo Mojable Concentrado Emulsionable
Gráfico 2: Porcentaje de pureza de los bioformulados, antes y después de seis meses de

almacenamiento.
Los prototipos WG, WP y EC presentaron mayor porcentaje de impurezas después de su

elaboración, esto se pudo deber a que en el área de formulación se trabajó al mismo instante con
otro microorganismo como Purpureocillium lilacinum, el cual puede permanecer en mínimas
cantidades en el ambiente del Laboratorio de Control Biológico. Por otro lado, CG no presentó
40
contaminación alguna en ningún mes, durante el almacenamiento se evidenció que a partir del 3er
mes hasta el 6to mes el nivel de contaminación se redujo al 0% para todos los prototipos y
registrando una pureza del 100%, esto nos indicó que los contaminantes se redujeron con el
tiempo, es decir pierden viabilidad. El porcentaje de pureza en todos los prototipos fue superior al
90 %, antes y después de seis meses de almacenamiento (Gráfico 2).
Figura 16: Presencia de Purpureocillium lilacinum en las formulaciones a base de Trichoderma

asperellum y aislamiento del contaminante.
Fuente: La autora
El nivel de pureza presente en las cuatro bioformulaciones cumplió con el estándar de calidad
establecido, sugiriendo que la estabilidad y viabilidad del microorganismo no se vio afectado por
otros microorganismos durante la etapa de almacenamiento a dos temperaturas.
5.1.4. Nivel de eficiencia del proceso de formulación
La eficiencia del proceso de formulación se evaluó después de la formulación de los prototipos,
para lo cual se registró la cantidad del microorganismo con su respectiva concentración de colonias
en UFC/g, la cantidad de excipientes y la concentración real de colonias en la formulación medida
en UFC/g. El nivel de eficiencia evaluado al mes de manufacturación no presentó normalidad, ni
varianzas constantes, realizando su análisis mediante pruebas no paramétricas según Kruskal Wallis
al 5% (Cuadro 24). La misma prueba indicó que existió diferencias significativas entre los
tratamientos. Con un p-valor de 0.0209.
Cuadro 24: Medias del nivel de eficiencia del proceso de formulación (%) después de
manufacturación en los cuatro bioformulados a base de Trichoderma asperellum.
Medias y rangos de significación
TRATAMIENTOS
Inicial/ tratamiento Inicial/ prototipo
Tratamiento T1: P1T1 99.83 AB
97.08
97.40
Tratamiento T4: P2T2 100.00 A
100.00
93.98
Tratamiento T8: P4T2 91.28 B
P1T1: gránulo dispersable a 4°C, P1T2: gránulo dispersable a 30°C, P2T1: gránulo cubierto a 4°C, P2T2: gránulo
cubierto a 30°C, P3T1: polvo mojable a 4°C, P3T2: polvo mojable a 30°C, P4T1: concentrado emulsionable a
4°C, P4T2: concentrado emulsionable a 30°C.
41
Los cuatro prototipos desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum presentaron un
porcentaje de nivel de eficiencia superior al 90%, siendo mejor el bioformulado polvo mojable con
100% de eficiencia, seguido por los granulados WG y CG, con 97.08% y 97.40% respectivamente y
con menor porcentaje de eficiencia el concentrado emulsionable con 93.98%.
Según los parámetros establecidos por el Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC, una
buena formulación debe presentar un porcentaje de eficiencia en el proceso de formulación
superior al 60%, por lo anterior, los productos a base de Trichoderma asperellum en sus
presentaciones sólidas y líquida se encuentran sobre el límite de aceptación.
Se debe considerar que los productos biológicos que no alcanzaron el 100% de eficiencia en
manufacturación pudieron presentar daño del ingrediente activo y consecuente reducción de
viabilidad por incorrecta manipulación, incompatibilidad con los excipientes o estrés durante el
proceso de formulación, así como daño por el tiempo de secado.
5.2. Caracterización fisicoquímica de los prototipos

Las características fisicoquímicas como densidad apisonada, porcentaje de humedad, valor de pH,
suspendibilidad y tamaño de la partícula no presentaron normalidad y homogeneidad de la
varianza, por lo que se realizó su análisis mediante prueba no paramétrica según Kruskall Wallis al
5%.
5.2.1. Densidad apisonada
La densidad apisonada es una característica que permite calcular el tamaño del empaque y la
capacidad de almacenamiento en bodegas o vehículos de transporte (Silva, 2001). Esta variable se
evaluó el mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento para los prototipos sólidos.
El prototipo correspondiente a gránulo dispersable presentó una densidad apisonada inicial

promedio correspondiente a 0.64 g/ml y después de almacenamiento a dos temperaturas, se
evidenció una variación mínima, obteniendo al 6to mes una densidad apisonada promedio de
0.63g/ml (Cuadro 26). El gránulo cubierto inicialmente obtuvo una densidad apisonada promedio
de 1g/ml, misma que permaneció constante durante los seis meses de almacenamiento a dos
temperaturas, según Padin, et al (2013), esto se produce porque el material base de prototipos
granulares tiene partículas homogéneas que no presentan espacios de aire libres entre ellas,
manteniendo constante su rango de compactación. El prototipo de polvo mojable presentó una
densidad apisonada inicial promedio de 0.73 g/ml y después de seis meses de almacenamiento a
4°C y 30°C, obtuvo una densidad apisonada promedio de 0.71 g/ml y 0.72 g/ml, respectivamente
(Cuadro 26).
Por lo tanto, los valores de densidad apisonada (g/ml) en los meses de almacenamiento para los
prototipos formulados presentaron diferencias estadísticas entre sí, según la prueba de Kruskall
Wallis (Cuadro 25). Sin embargo, según la comparación de medias el prototipo con mejor respuesta
a la variable después de seis meses de almacenamiento fue gránulo cubierto almacenado a 4°C y
30°C, por mantener valores de densidad apisonada constante.
42
Cuadro 25: Análisis de la densidad apisonada según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de
p-valor1
Variable
Densidad
apisonada 0.00011 0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001
(g/ml)
Cuadro 26: Medias y rangos de significación para densidad apisonada (g/ml), evaluados en
prototipos sólidos WP, WG, CG a partir del mes de formulación y durante seis meses de
almacenamiento.
TRATAMIENTOS Medias1 y rangos de significación2

Tratamiento T1: 0.641 C2 0.68 C 0.63 BC 0.63 B 0.63 B 0.63 B 0.63 C
P1T1
Tratamiento T2: 0.64 BC 0.70 AB 0.62 C 0.63 B 0.63 B 0.63 B 0.63 C
P1T2
Tratamiento T3: 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A
P2T1
Tratamiento T4: 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A 1.00 A
P2T2
Tratamiento T5: 0.73 AB 0.72 AB 0.79 AB 0.75 AB 0.72 AB 0.71 AB 0.71 AB
P3T1
Tratamiento T6: 0.72 BC 0.78 BC 0.76 ABC 0.74 AB 0.73 AB 0.72 AB 0.75 BC
P3T2
P1: Gránulo Dispersable; P2: Gránulo Cubierto; P3: Polvo Mojable; T1: 4°C; T2: 30°C; inicial: mes de
formulación. * Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas.
En un estudio similar realizado por Quiroga (2009), al desarrollar una formulación granular en base
a Granulovirus encontró que la densidad presentó un promedio de 628.33g/L, valor que
consideraron adecuado para un gránulo dispersable en agua.
Según Padin, et al., (2013) la densidad apisonada óptima para granulados a base de un vehículo
compacto se encuentra dentro de un rango de 1000 g/L y para polvos mojables los limites oscilan
entre 220 y 250 g/L. Valores apropiados para obtener un buen manipuleo, transporte y
almacenamiento.
Por consiguiente, se determinó que los prototipos sólidos a base de Trichoderma asperellum
evaluados al mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento presentaron una
densidad apisonada promedio que oscila entre 630 g/L y 700 g/L para gránulos dispersables en
agua, permaneciendo dentro de los parámetros de calidad establecidos. El gránulo cubierto
presentó un valor constante de 1000g/L, adecuado para este tipo de granulados. El prototipo de
polvo mojable presentó una densidad apisonada de 710g/L a 780g/L, valores que se encuentran
sobre los limites recomendables. Sin embargo, el producto mostró un adecuado comportamiento
43
al ser reconstituido. En consecuencia, los rangos obtenidos para cada prototipo sólido no
presentaran problemas en operaciones de formulación a gran escala.
5.2.2. Humectabilidad
Se refiere a la capacidad que tiene un sólido para humedecerse completamente al hacer contacto
con el agua (Vélez et al., 1997). La humectabilidad condiciona la eficacia de los prototipos
reconstituidos en agua, debido a que determina la rapidez con la cual se libera el principio activo.
Se considera adecuado un tiempo de humectabilidad inferior a 1 minuto (Salazar, 2003).
La humectabilidad se analizó cualitativamente observando el tiempo que tardaron los prototipos

de polvo mojable y gránulo dispersable en humectarse completamente, el tiempo registrado fue
mayor a 1 min durante los seis meses de almacenamiento a las dos temperaturas evaluadas. Este
resultado indica que no existió efecto en la humectabilidad entre los prototipos formulados y entre
las temperaturas de almacenamiento.
Durante la evaluación de humectabilidad en el WP se observó que el producto se mantuvo sobre el

agua sin romper la tensión superficial, por un periodo superior a un minuto, como se observa en la
figura 17.
Figura 17: Humectabilidad de WP.

Fuente: La autora.
Durante la evaluación de humectabilidad en el prototipo de gránulo dispersable se observaron que

los gránulos al hacer contacto con el agua no se humedecían homogéneamente y precipitaban hacia
el fondo del vaso a diferentes tiempos, sobrepasando el minuto al caer el último gránulo. Este
fenómeno se debe a las diferencias en la porosidad y tamaño de cada gránulo, precipitándose
inmediatamente los gránulos con mayor densidad y retardando la humectación en los gránulos con
menor densidad (Helman, 1982).
44
Figura 18: Humectabilidad de WG.
Fuente: La autora.
La humectabilidad que presentó el WG a base de Trichoderma asperellum fue mayor a 1 minuto a

comparación de resultados obtenidos por Quiroga (2009) en la cual las granulaciones tuvieron un
tiempo de humectación que osciló entre 52 y 62 segundos durante los seis meses de
almacenamiento.
Por lo descrito anteriormente, los prototipos sólidos (WP y WG) a base de Trichoderma asperellum,
no se encuentran dentro del tiempo de humectación adecuado para bioformulaciones y de acuerdo
Abraham y Casillas, (2014). Se deberá mejorar esta propiedad con adición de humectantes o
disminuyendo la cantidad de aglutinantes y aumentando la humedad del gránulo.
5.2.3. Humedad
El contenido de humedad en una formulación genera efectos importantes sobre las características
y conservación del ingrediente activo durante el periodo de almacenamiento (Quiroga, 2009). El
porcentaje de humedad en los prototipos sólidos al inicio de las evaluaciones presentó diferentes
valores debido al tipo de formulación, componentes inertes y cantidad del ingrediente activo.
La humedad inicial promedio determinada para el prototipo gránulo dispersable fue de 5.59% y
después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, los porcentajes de humedad fueron
del 5.22% y 4.95% para 4°C y 30°C, respectivamente (Cuadro 28). El prototipo de gránulo cubierto
presentó un valor promedio inicial de 6.14% y después de seis meses de almacenamiento los
porcentajes de humedad a 4°C y 30°C fueron de 5.94% y 5.73%, respectivamente. El polvo mojable
presentó una humedad promedio inicial de 2.21% y después de seis meses de almacenamiento a
dos temperaturas, los porcentajes de humedad fueron 2.79% y 2.82%, respectivamente (Cuadro
28).
Por lo tanto, durante los meses de almacenamiento y evaluación presentaron diferencias

estadísticas entre sí según la prueba de Kruskall Wallis (Cuadro 27). Según la comparación de
medias utilizando Dunnette, el prototipo que presentó mínima variación de humedad después de
seis meses de almacenamiento fue, el polvo mojable almacenado a 4°C.
45
Cuadro 27: Análisis del porcentaje de humedad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de
p-valor1
Variable
Porcentaje de
0.00031 0.0006 0.0002 0.0001 0.0004 0.0001 0.0001
humedad (%)
Cuadro 28: Medias y rangos de significación para porcentaje de humedad (%), evaluados en
almacenamiento.
Medias1 y rangos de significación2

TRATAMIENTOS 1er 2do
Inicial 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes
mes mes
Tratamiento T1:
5.461 BC2 6.19 A 5.64 BC 5.64 CD 6.11 A 5.70 BC 5.22 BCD
P1T1
Tratamiento T2:
5.71 A 5.72 A 6.33 A 5.19 BC 4.98 BC 4.79 AB 4.95 ABC
P1T2
Tratamiento T3:
6.15 A 5.71 A 6.08 A 6.17 A 5.81 A 6.08 A 5.94 A
P2T1
Tratamiento T4:
6.14 A 5.88 A 5.75 BC 5.79 CD 5.76 A 6.05 BC 5.73 CD
P2T2
Tratamiento T5:
2.19 C 2.05 C 2.20 B 2.21 D 2.20 C 2.25 C 2.79 D
P3T1
Tratamiento T6:
2,.2 AB 2.14 C 2.61 B 2.60 AB 2.71 AB 2.64 c 2.82 AB
P3T2
Contreras (2003), determinó que la humedad del granulado a base de microorganismos

biocontroladores después de manufactura fue de 5.67%, siendo este valor próximo a los obtenidos
en los prototipos granulados a base de Trichoderma asperellum, con 5.59% para WG y 6,14% para
CG, valores que se acercan al rango de aceptación de 3 a 5% propuesto por Vélez et al., (1997).
De acuerdo con Marín y Bustillo (2016), productos liofilizados o formulados a base de hongos
entomopatógenos como B. bassiana y M. anisopliae con adhesión de materiales inertes como
talco, bentonita, leche y tierra de diatomáceas deben presentar porcentajes de humedad entre 3,0
y 15 %.
Otros autores como Corpoica (2010), después de evaluar formulaciones de polvo mojable a base
de Trichoderma koningiopsis Th003 obtuvieron valores de humedad que oscilaron entre 4 y 7%, los
cuales consideraron aceptables para bioplaguicidas.
En esta investigación, el polvo mojable a base de Trichoderma asperellum alcanzó una humedad de
2.21% al mes de formulación y 2.79% después de seis meses de almacenamiento a 4°C
encontrándose dentro del límite establecido por Gato (2010), el mencionado autor considera que
46
la temperatura y humedad relativa son los parámetros más importantes durante el
almacenamiento los cuales garantizan un formulado viable de tres a seis meses, recomendando
una temperatura de refrigeración a 5°C y humedad hasta de 1%.
Por lo expuesto, se concluye que la humedad de los prototipos sólidos fue adecuada y estable
durante el almacenamiento y se espera no exista efectos sobre la viabilidad de Trichoderma
asperellum, compactación o aglomeración de las partículas en las formulaciones dentro de las
fundas metalizadas.
5.2.4. pH
El valor de pH en una formulación debe ser ligeramente ácido para facilitar el crecimiento de hongos
benéficos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos (Góngora, Marín, &
Benavides, 2009). Los valores promedio de pH después de la manufacturación en los cuatro
prototipos a base de Trichoderma asperellum presentaron un rango de pH de 5.0 a 7.0 evidenciando
ligera acidez en las formulaciones.
El pH promedio inicial registrado en el prototipo WG fue de 6.57 y después de seis meses de

almacenamiento a dos temperaturas, los valores de pH fueron de 6.99 y 6.96 para 4°C y 30°C,
respectivamente (Cuadro 30). El gránulo cubierto presentó un valor de pH promedio inicial de 6.51
y después de seis meses de almacenamiento los valores a 4°C y 30°C fueron 6.84 y 6.77,
respectivamente. El polvo mojable presentó un valor de pH promedio inicial de 5,79 y después de
seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, los valores fueron 6.22 y 6.13,
respectivamente. Para el concentrado emulsionable los valores de pH registraron un promedio
inicial de 5.43 y después de seis meses de almacenamiento los valores a 4°C y 30°C fueron 5.58 y
5.57, respectivamente (Cuadro 30).
El valor de pH durante los seis meses de almacenamiento presentó diferencias estadísticas entre sí,
condición similar se observó en el valor inicial en cada uno de los prototipos tanto sólidos como el
líquido, según la prueba de Kruskall Wallis (Cuadro 29). Sin embargo, según la comparación de
medias realizada mediante Dunnette al 5%, el prototipo con mejor respuesta a la variable de pH
después de seis meses de almacenamiento fue gránulo dispersable a almacenado a 4°C y 30°C.
Cuadro 29: Análisis del pH según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de almacenamiento, a
dos temperaturas.
p-valor1
Variable
Valor de pH <0.00011 <0.0001 <0.0001 0.0003 0.0006 <0.0001 <0.0001
47
Cuadro 30: Medias y rangos de significación para el valor de pH, evaluados en los cuatro prototipos
WP, WG, CG y EC, a partir del mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento.

TRATAMIENTOS
Tratamiento T1:
6.711 A2 6.66 A 6.58 DE 5.84 BC 6.11 BC 6.47 DE 6.99 A
P1T1
Tratamiento T2:
6.43 CDE 6.85 A 6.85 A 5.93 A 6.26 A 6.82 A 6.96 A
P1T2
Tratamiento T3: 5.70 5.99
6.55 DE 6.45 A 6.26 CDE 5.59 C 6.84 BC
P2T1 ABC CDE
Tratamiento T4: 5.79
6.47 DE 6.29 BC 6.14 CD 5.59 C 5.65 C 6.77 BC
P2T2 ABC
Tratamiento T5: 5.88
6.12 BCD 5.62 AB 6.14 BCD 5.93 A 5.68 AB 6.22 AB
P3T1 BCD
Tratamiento T6:
5.46 AB 5.67 C 5.75 E 5.63 AB 5.66 C 5.83 BC 6.13 AB
P3T2
Tratamiento T7:
5.45 ABC 5.58 AB 5.83 AB 5.57 C 5.59 C 5.55 E 5.58 C
P4T1
Tratamiento T8:
5.40 E 5.61 AB 5.87 ABC 5.60 C 5.56 C 5.65 AB 5.57 C
P4T2
P1: Gránulo Dispersable; P2: Gránulo Cubierto; P3: Polvo Mojable; P4: Concentrado Emulsionable; T1: 4°C;
T2: 30°C; inicial: mes de formulación. * Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias
significativas.
Cenicafé (2012) recomienda que el pH para productos biológicos se encuentre en un rango entre
5.5 a 7.5 con un óptimo de 6,6 debido a que este límite ayuda a mantener la integridad de las
células. Otros autores como Góngora, Marín, & Benavides, (2009) determinaron que el rango de
pH adecuado para formulaciones con hongos entomopatógenos es de 5.5 a 7.0.
Otros autores como Corpoica (2010), después de evaluar formulaciones de polvo mojable a base
de Trichoderma koningiopsis Th003 obtuvieron valores de pH que oscilaron entre 5.0 -7.0 los cuales
se consideraron aceptables para bioplaguicidas, sugiriendo que aquellos cuyo valor era mayor a 7
no debían ser utilizados o se debería utilizar un auxiliar de formulación como regulador de pH.
Según Marín y Bustillo ( 2016), los valores extremos de pH influyen en la germinación del hongo,
retardándola.
Por consiguiente, los valores de pH determinados en los cuatro prototipos tanto sólidos como el
líquido a base de Trichoderma asperellum se encuentran dentro de los rangos de aceptación,
manteniendo estables las formulaciones y sin efectos negativos en la germinación del hongo.
5.2.5. Estabilidad del concentrado emulsionable

El prototipo de concentrado emulsionable se analizó cualitativamente a partir del mes de
formulación y durante seis meses de almacenamiento a dos temperaturas de evaluación. El
concentrado no presentó separación de fases entre aceite y agua, al realizar su reconstitución en
medio acuoso. El sistema inicialmente presentó una coloración verde oscura y en la primera hora
de evaluación se observaron valores iniciales de cremado (aproximadamente de 2 ml) que se
48
presentaron en la parte superior de la emulsión; 24 horas después se observó la formación de
cremado (aproximadamente de 3 ml) y se observó una coloración verde pálida ocasionado por la
sedimentación de material en la base de la probeta. El cremado es un fenómeno fácilmente
reversible que se presentó de manera constante tanto a 4°C y 30°C por el periodo de seis meses de
almacenamiento (Figura 18).
Figura 19: Estabilidad del concentrado emulsionable cremado a) 1 hora b) 24 horas.

Fuente: La autora.
Según Quiroga (2009), el cremado es un fenómeno común que se observa en emulsiones aceite en
agua, debido a que las gotas de aceite son menos densas que la fase acuosa, por lo que se trasladan
a la superficie del sistema y forman una capa denominada crema.
El IICA (1998), dispone que la estabilidad de la emulsión a la media hora no deberá tener más de 2
ml de cremado y a las dos horas 4 ml. Después de 24 horas un concentrado emulsionable estable
debe ser capaz de reemulsificarse fácilmente.
Otros autores como Leiva (2013) mencionan que una buena estabilidad del formulado permite
mantener una homogeneidad de la suspensión una vez disuelta en agua (agitación por retorno) y
asegura la cobertura al hacer contacto con el área de aplicación. Tomando en cuenta que la primera
reacción del sistema una vez en contacto con el agua es tornase de color lechoso, lo cual demuestra
que la emulsión se forma con éxito.
Los resultados obtenidos en estabilidad del concentrado emulsionable muestran que la cantidad
de cremado obtenido en la primera hora y 24 horas después de reconstituido el sistema en agua se
encuentra dentro de los rangos permitidos para formulaciones en aceite, sin encontrarse
diferencias por efecto de la temperatura o el periodo de almacenamiento. Sin embargo, no existe
reacción de cambio de color de la formulación al hacer contacto con el agua, lo que puede sugerir
que la emulsión no es completamente efectiva y se debe mejorar mediante adición de agentes
emulsificantes.
49
5.2.6. Suspendibilidad
La suspendabilidad es una característica fisicoquímica que presentan las formulaciones para
asegurar que una cantidad suficiente del ingrediente activo este homogéneamente disperso en
todo el volumen del medio acuoso, a fin de mantener una mezcla satisfactoria y eficaz durante su
aplicación, evitando además el taponamiento de boquillas (Hidalgo, 2014).
La suspendibilidad se evaluó en los prototipos sólidos con capacidad de disolverse en agua WP y

WG a partir del mes de manufacturación y durante seis meses de almacenamiento a dos
temperaturas.
La suspendabilidad inicial promedio para gránulo dispersable presentó un valor de 97.51% y

después de seis meses de almacenamiento obtuvo una suspensión de 98.23% y 98.50% a 4 °C y
30°C, respectivamente (Cuadro 32). El polvo mojable registró un valor de suspendibilidad inicial
promedio de 97.18% y después de seis meses de almacenamiento presentó una suspensión de
97.90% a 4 °C y 97.26% a 30 °C. La suspensión de los prototipos almacenados durante seis meses a
dos temperaturas presentó valores que oscilan entre 94% y 98.80%.
La suspendibilidad en los prototipos WP y WG según la prueba de Kruskall Wallis (Cuadro 31) no

presentó diferencias estadísticas en relación con el valor inicial y los seis meses de almacenamiento
a dos temperaturas.
Cuadro 31: Análisis de la suspendibilidad según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de
p-valor1
Variable
Suspendibilidad 0.16661 0.4135 0.5897 0.8308 0.9128 0.8098 0.8728
Cuadro 32: Medias y rangos de significación para suspendibilidad (%), evaluados en prototipos
sólidos WP y WG a partir del mes de formulación y durante seis meses de almacenamiento.
Medias
TRATAMIENTOS
Tratamiento T1: P1T1 97.08 94.75 98.66 97.79 98.32 98.57 98.23
Tratamiento T2: P1T2 97.95 94.57 97.97 97.24 98.41 98.14 98.50
Tratamiento T5: P3T1 94.95 97.17 99.16 97.47 97.34 97.90 97.90
Tratamiento T6: P3T2 99.41 97.70 97.63 97.35 97.28 97.52 97.26
P1: Gránulo Dispersable; P3: Polvo Mojable; T1: 4°C; T2: 30°C; inicial: mes de formulación.
50
100
80
Suspendibilidad (%) 60
40
20
0
Tratamiento T1: P1T1 Tratamiento T2: P1T2

Tratamiento T5: P3T1 Tratamiento T6: P3T2
Gráfico 3: Suspendibilidad en porcentaje del WP y WG, después de manufacturación y

almacenamiento por seis meses a dos temperaturas.
Quiroga (2009), obtuvo valores de suspendibilidad para gránulo dispersable entre 67.80% y 78.88%,
considerados bajos del límite de aceptación utilizado por el Laboratorio de Control Biológico de
Corpoica que exige una estabilidad mínima del 80%.
Hidalgo (2014), considera que formulaciones de tipo polvo mojable y gránulo dispersable deben
presentar suspensiones de no menos del 60% para asegurar homogeneidad en la aplicación.
Cermeli y Díaz (2016), mencionan que los materiales con mayor tendencia a la suspendibilidad en
agua son el caolín, talco, carbonato cálcico y bentonita la cual presenta la más alta suspendibilidad,
sin embargo, por su acción de recubrir el principio activo puede tender a disminuir la eficiencia de
la formulación.
Por consiguiente, los prototipos WP y WG a base de Trichoderma asperellum, presentan un

porcentaje de suspendibilidad adecuado para formulaciones de reconstitución en agua y aplicación
con equipos de aspersión. La suspendibilidad se mantuvo superior al 90% a partir de la elaboración
de los formulados y durante los seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, presentando
valores de suspensión que oscilan entre 94% y 99%, superiores al 60% y 80% límites establecidos
en investigaciones similares. Por lo tanto, se sugiere que los porcentajes obtenidos en la
suspendibilidad de los prototipos se debe al material base de las formulaciones.
5.2.7. Tamaño de la partícula
El tamaño que presenta una partícula en su formulación sólida es una característica de importancia
debido a que puede inferir en otras propiedades del formulado tales como uniformidad del
contenido, textura, color y estabilidad en almacenamiento (Quiroga, 2009). La característica
fisicoquímica tamaño de partícula para prototipos sólidos WP, WD y CG se determinó mediante
granulometría a partir de su elaboración y durante seis meses de almacenamiento a dos
temperaturas.
51
El gránulo dispersable presentó un porcentaje de retención de partículas inicial de 95.64% y
después de seis meses de almacenamiento a 4°C y 30°C mostró una retención de material de
89.98% y 96.0%, respectivamente (Cuadro 34). La mayor cantidad de producto se encontró en el
tamiz con tamaño de poro correspondiente a 250 µm, determinando que el tamaño de partícula
osciló entre 1.70 mm y 250 µm. Por lo tanto, los gránulos fueron homogéneos en las dos
temperaturas, reduciendo la tendencia a la aglomeración o segregación del producto durante el
almacenamiento (Gráfico 3).
El tamaño de la partícula determinado por el porcentaje de material retenido en diferentes tamices

para prototipos sólidos WG, CG y WP, según la prueba de Kruskall Wallis al 5% (Cuadro 33)
presentaron diferencias estadísticas en relación con el valor inicial y los seis meses de
almacenamiento a dos temperaturas.
Cuadro 33: Análisis del tamaño de partícula según Kruskall Wallis antes y durante seis meses de
p-valor1
Variable
Tamaño de
0.00011 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 <0.0001
partícula
Cuadro 34: Medias y rangos de significación correspondiente a tamaño de la partícula (%), en

almacenamiento.

Tratamientos
2do
Inicial 1er mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes
mes
Tratamiento 94.751
94.34CD 94.59BC 95.13 CD 94.33 CD 94.71 A 89.98BC
T1: P1T1 CD2
Tratamiento
96.54 A 97.16 A 97.56 A 95.71 A 96.57 A 96.14 A 96.00 A
T2: P1T2
Tratamiento
66.32 D 66.74AB 66.39 C 65.60AB 64.00 AB 60.20 C 63.20 C
T3: P2T1
Tratamiento
67.16AB 66.49AB 66.54 C 64.91 D 58.06 D 59.26C 62.80 C
T4: P2T2
Tratamiento
76.69BC 76.52BCD 76.11AB 76.16BCD 76.15BCD 76.30BC 76.66BC
T5: P3T1
Tratamiento
75.84ABC 74.19ABC 74.03AB 74.07ABC 74.61ABC 74.01AB 74.11AB
T6: P3T2
52
100,00
90,00
80,00
70,00
Material retenido (%)
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
2 2,00 - 1,70 1,70 - 250 250 - 150 150 - 53 < 53
mm um
Gráfico 4: Distribución del material retenido (%) de WG, a partir de su elaboración (inicial) y
almacenamiento por seis meses.
El prototipo gránulo cubierto presentó una retención inicial promedio de 66.74%, mientras que a
los seis meses de almacenamiento a dos temperaturas obtuvo valores de 62.80% y 63.20% a 4°C y
30°C, respectivamente. De acuerdo con el tamiz de 250 µm en el cual se concentró la mayor
cantidad de gránulos se determinó que las partículas del formulado tuvieron un tamaño que osciló
entre 1.70 mm y 250 µm, similar al tamaño de gránulo dispersable, sin embargo, existió una menor
homogeneidad debido a que presentó elevados porcentajes de material retenido en otros tamices.
Se observó desprendimiento o excesos de la cobertura del gránulo al encontrar más de 40% de
material retenido entre 150 µm y 53 µm (Gráfico 4).
100,00
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
2 2,00 - 1,70 1,70 - 250 250 - 150 150 - 53 < 53
mm um
Gráfico 5: Distribución del material retenido (%) de CG, a partir de su elaboración (inicial) y
53
Polvo mojable, presentó una retención de material inicial promedio de 76.40% en la base de la
columna de tamices, determinando que el tamaño de partícula del formulado es inferior a 53 µm.
Después de seis meses de almacenamiento los valores de material retenido fueron 76.66% y 74.11%
a 4°C y 30°C, respectivamente, indicando que la formulación se mantuvo estable a dos
temperaturas y seis meses de almacenamiento (Gráfico 5).
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
500 500-250 250-150 150-106 106-53 < 53 um
Gráfico 6: Distribución del material retenido (%) de WP, a partir de su elaboración (inicial) y
Morales (1996) y Díaz (2011), propusieron que las formulaciones granuladas en un soporte
preformado, como vermiculita, caolinita, zeolita, etc. deberían presentar tamaños de partícula que
oscilen entre 0.2 mm y 1.5 mm, para aprovechar la capacidad de absorción y recubrimiento de este
tipo de minerales.
Estudios realizados por diversos autores como Corpoica, (2010) y Grijalba, Gómez, y Zuluaga, (2014)
después de evaluar formulaciones de polvo mojable a base de microorganismos como Trichoderma
koningiopsis Th003 y Isaria fumosorosea coincidieron que el tamaño de partícula para este tipo de
bioplaguicidas fue inferior a 100 µm.
Prototipos sólidos como polvos y granulados de aplicación directa, restringen el contenido de

partículas de tamaños no deseables, sin embargo, no presentan límites generales. En cuanto a
gránulos dispersables estos deben asegurar una proporción homogénea de la formulación, a fin de
minimizar la segregación o separación de las partículas durante el transporte, manipulación y
aplicación, por lo tanto, no menos del 85% de la formulación debe estar dentro del rango nominal
(Hidalgo, 2014).
Por lo expuesto anteriormente, el tamaño de la partícula para formulaciones sólidas como polvo
mojable y gránulo cubierto no presentan límites definidos de aceptación y se tomó como válidos
los rangos obtenidos para los prototipos desarrollados: Polvo mojable en base a Trichoderma
asperellum presentó uniformidad del tamaño de partícula siendo inferior a 53µm, tamaño que
permite un adecuado envase y almacenamiento. El gránulo cubierto presentó una homogeneidad
de tamaño que osciló entre 1.70 mm y 250 µm, con un porcentaje de material uniforme retenido
superior al 50%, sin embargo, existieron residuos de polvo en tamices inferiores, que sugieren se
54
debe mejorar la cobertura del gránulo. El tamaño de partícula que presentó el gránulo dispersable
osciló entre 1.70mm y 250µm con más del 90% de homogeneidad del material uniforme retenido,
encontrándose dentro de los rangos establecidos y asegurando que no existe problemas de
segregación o aglomeración de partículas. Las dos temperaturas y período de almacenamiento no
influyeron en el tamaño de la partícula de los prototipos.
5.2.8. Actividad de agua

La actividad de agua (aw), es una característica fisicoquímica que determina, la germinación,
crecimiento y esporulación de microorganismos. La disminución de aw puede reducir drásticamente
la germinación de conidios dejándolos en latencia por periodos extensos de tiempo, sin embargo,
un descenso extremo en la aw podría ocasionar efectos adversos (Aguirre, Villamizar, Espinel, &
Cotes, 2009).
La evaluación de la actividad de agua en los bioformulados sólidos y el líquido desarrollados a base

de conidias de Trichoderma asperellum se realizó inmediatamente después de la formulación y
durante seis meses de almacenamiento. Los prototipos polvo mojable y concentrado emulsionable,
se analizaron inmediatamente después de su elaboración, mientras que los granulados se
analizaron el día de envasado, debido a que estos pasan por un tiempo previo de secado.
La aw presentó normalidad antes y durante cinco meses de almacenamiento a dos temperaturas,

sin embargo, no hubo varianzas constantes en todos los meses de almacenamiento (Cuadro 35).
Por lo anterior, se analizaron los resultados paramétricos mediante ANOVA y pruebas de
comparación de medias según DMS para prototipos (P), temperaturas (T) y al presentarse
interacción P x T se utilizó Tukey con un alfa 0.05%. Las medias para los meses con resultados no
paramétricos se determinaron mediante Dunnette al 5%.
Cuadro 35: Normalidad y varianzas constantes de la aw de los bioformulados, antes y durante los
seis meses de almacenamiento a dos temperaturas.
Actividad de agua (aw) Normalidad Varianzas constantes

Inicial 0.3748 0.3281
1er mes 0.3181 Na
2do mes Na
3er mes 0.7109 0.4824
4to mes 0.4410 0.3746
5to mes 0.6107 0.0748
6to mes 0.194 0.1762
La aw inicial presentó diferencias altamente significativas entre los prototipos, sin encontrar
diferencias estadísticas entre temperaturas o la interacción P x T (Cuadro 36 y Cuadro 37), esto se
debe a que la temperatura inicial es la misma, considerando que la muestra para evaluación se
tomó antes de que los formulados ingresen a almacenamiento a 4° y 30°C.
Se evaluó mensualmente la variable aw después de almacenar los prototipos a dos temperaturas y

por el periodo de seis meses encontrándose que a partir del primer mes de almacenamiento
existieron diferencias estadísticas tanto en los prototipos, las temperaturas y la interacción.
55
Cuadro 36: ANOVA correspondiente a la aw después de formulados los prototipos y durante tres
meses de almacenamiento, a dos temperaturas.
Cuadrados medios1 y p – valor2

Fuentes de variación Gl
Inicial 1er mes 3er mes
Total 39
Prototipos (P) 3 0.281 <0.0001***2 0.2 <0.0001*** 0.15 <0.0001***
Temperatura (T) 1 9E4 0.8091 0.01 0.0446* 0.0042 0.1401
PxT 3 0.0014 0.4273 0.01 0.0003*** 0.01 0.0012**
Error 32 0.0015 0.0017 0.0018
Promedio 0.09 0.06 0.04
significativas.
Cuadro 37: ANOVA correspondiente a la aw del 4to al 6to mes de los bioformulados almacenados,
a dos temperaturas.
Cuadrados medios1 y p – valor2

Fuentes de variación Gl
3 4to mes 5to mes 6to mes

Total
9
Prototipos (P) 3 0.131 <0.0001***2 0. 12 <0.0001*** 0.06 <0.0001***
Temperatura (T) 1 0.01 0.0001*** 0.0001 0.6328 0.01 0.0071**
PxT 3 0.04 <0.0001*** 0.03 <0.0001*** 0.0048 0.0014**
3
Error 7.4E4 0.0005 7E4
2
Promedio 0.05 0.04 0.02
Coeficiente de variación
5.60 4.95 6.17
(%)
Al 6to mes de almacenamiento se encontró que los prototipos presentaron diferencias altamente
estadísticas y tanto las temperaturas como la interacción tuvieron diferencias estadísticas (Cuadro
38). Por lo tanto, se comprobó que las temperaturas generan un efecto sobre la aw durante el
periodo de almacenamiento.
56
Cuadro 38: Medias correspondientes a la aw después de formulados los prototipos y durante seis
meses de almacenamiento a dos temperaturas.
Medias y Rangos de Significación

Prototipos (P)
Granulo
0.59 A 0.58 A 0.58 A 0.58 A 0.56 A 0.55 A 0.50 A
dispersable (P1)
Gránulo cubierto
0.61 A 0.59 A 0.54 A 0.56 A 0.55 A 0.55 A 0.47 B
(P2)
Polvo mojable
0.25 C 0.29 C 0.29 C 0.31 C 0.32 C 0.32 C 0.33 C
(P3)
Concentrado
0.41 B 0.44 B 0.44 B 0.44 B 0.50 B 0.44 B 0.45 B
emulsionable (P4)
Temperaturas (T) Inicial 1er mes 2do mes 3er mes 4to mes 5to mes 6to mes
4°C (T1) 0.46 A 0.49 A 0.47 A 0.48 A 0.50 A 0.47 A 0.42 A
30°C (T2) 0.46 A 0.46 B 0.45 B 0.46 B 0.47 B 0.46 B 0.45 B
Prototipos x
Temperaturas
P1T1 0.61 A 0.61 A 0.57 A 0.63 A 0.66 A 0.62 A 0.50 A
P1T2 0.57 A 0.55 A 0.52 AB 0.53 BC 0.46 D 0.47 C 0.50 A
P2T1 0.61 A 0.58 A 0.60 A 0.57 AB 0.57 B 0.55 B 0.47 A
P2T2 0.60 A 0.60 A 0.56 A 0.54 ABC 0,54 BC 0.55 B 0.47 A
P3T1 0.25 C 0.23 D 0.23 E 0.28 F 0.27 F 0.25 E 0.28 C
P3T2 0.26 C 0.36 C 0.35 D 0.35 EF 0.37 E 0.38 D 0.37 B
P4T1 0.39 B 0.43 B 0.42 CD 0.46 CD 0.52 BCD 0.43 C 0.45 A
P4T2 0.42 B 0.45 B 0.46 BC 0.42 DE 0.49 D 0.44 C 0.45 A
significativas. P1: Gránulo Dispersable; P2: Gránulo Cubierto; P3: Polvo Mojable; T1: 4°C; T2: 30°C; inicial:
mes de formulación. Medias con una letra común no son significativamente diferentes DMS: (p > 0.02);
Tukey: (p > 0.05); Dunnette: alfa 0.05 (en meses sin varianzas constantes).
La prueba de comparación de medias DMS al 5%, para prototipos inicialmente presentó tres rangos
de significación, encontrándose en el primer rango los prototipos granulados WG, CG con medias
de 0.59 y 0.61, respectivamente; seguido de EC con una media de 0.41 y con menor respuesta a la
variable WP. Tanto temperaturas de almacenamiento como la interacción P x T no presentaron
diferencias entre las medias.
Después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas, la prueba de comparación de

medias DMS para prototipos determinó que no existen diferencias estadísticas en comparación al
mes inicial, conservando los tres rangos de significación y los prototipos con mejor respuesta a la
variable son los granulados. La prueba DMS para las dos temperaturas al sexto mes de evaluación
determinaron dos rangos de significación, presentando mejor respuesta a la variable la
temperatura a 4°C con una media de 0.42. La interacción P x T según la prueba de Tukey (0.05%)
presentó al sexto mes de almacenamiento tres rangos de significancia, determinando que los
prototipos granulados y concentrado emulsionable a las dos temperaturas de almacenamiento
57
presentan mejor respuesta a la variable, seguido de polvo mojable a 30°C y con menor respuesta a
la variable polvo mojable almacenado a 4°C.
Autores como Swaminathan, Koten, Henderson, Jackson y Wilson (2016) consideran rangos
adecuados de actividad de agua entre 0.560 y 0.765 para recubrir semillas a base de Trichoderma
spp. Estudios similares de formulaciones en polvo a base de Beauveria y formulaciones líquidas a
base de Trichoderma presentaron valores de actividad de agua entre 0.542-0.596 y 0.425- 0.622,
respectivamente durante tres meses de almacenamiento (Swaminathan & Jackson, 2011).
Por consiguiente, según los análisis estadísticos, los mejores prototipos son los granulados por
presentar mejor respuesta a la variable en la interacción P x T. Sin embargo, al tomar en cuenta los
resultados obtenidos en el análisis de las variables microbiológicas concentración en UFC y
porcentaje de germinación el mejor prototipo es Polvo Mojable (WP) almacenado a 4°C. La
actividad de agua de 0.28 que presentó el WP, mantuvo en mejores condiciones las características
del ingrediente activo, dejando al microorganismo en latencia por mayor tiempo en comparación
con el resto de los prototipos a pesar de ser la aw más baja en comparación con estudios similares.
5.3. Resumen de las características microbiológicas y fisicoquímicas

Los resultados obtenidos en las bioformulaciones y sus respectivas características microbiológicas
y fisicoquímicas después de seis meses de almacenamiento determinaron que 4°C es la mejor
temperatura de conservación para el ingrediente activo en sus respectivas formulaciones,
evidenciando que el polvo mojable generó mejor respuesta a las variables según los parámetros de
calidad establecidos por el Laboratorio de Control biológico INIAP-EESC.
El resumen de la evaluación de las características microbiológicas y fisicoquímicas se muestran en

los Cuadros 39, 40 y 41, respectivamente, apreciando la diferente estabilidad en las cuatro
bioformulaciones generada después de seis meses de almacenamiento a dos temperaturas.
Cuadro 39: Características microbiológicas de los bioformulados a base de Trichoderma asperellum

después de seis meses almacenamiento a 4°C y 30°C.
Gránulo
Polvo mojable Concentrado Gránulo cubierto
Características dispersable
(WP) emulsionable (EC) (CG)
Microbiológicas (WG)
4°C 30°C 4°C 30°C 4°C 30°C 4°C 30°C
Porcentaje de
germinación 87.60 80.80 76.00 0.00 78.28 0.00 80.35 0.00
(%)
Concentración
de colonias 3.76x108 4.93x107 3.02x108 2.18x104 1.85x106 2.71x108 2.91x108 0.00
(UFC)
Pureza (%) < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
Nivel de
eficiencia del
100.00 100.00 96.68 91.28 100.00 94.80 99.83 94.33
proceso de
formulación (%)
58
Cuadro 40: Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma asperellum
después de seis meses almacenamiento a 4°C.
Concentrado Gránulo
Características Polvo mojable Gránulo
emulsionable dispersable
fisicoquímicas (WP) cubierto (CG)
(EC) (WG)
Densidad apisonada
0.72 - 1.00 0.63
(g/ml)
Humectabilidad
>1 >1 >1 >1
(min)
Humedad (%) 2.79 - 5.94 5.22
Valor de pH 6.22 5.58 6.84 6.99
Estabilidad del
concentrado - 3 - -
emulsionable (ml)
Suspendibilidad (%) 97.90 - - 98.23
Tamaño de la
76.66 - 63.20 89.98
partícula (%)
Actividad de agua
0.28 0.45 0.47 0.50
(aw)
Cuadro 41: Características fisicoquímicas de los bioformulados a base de Trichoderma asperellum

después de seis meses almacenamiento a 30°C.
Concentrado Gránulo
Características Polvo mojable Gránulo
emulsionable dispersable
fisicoquímicas (WP) cubierto (CG)
(EC) (WG)
Densidad apisonada
0.71 - 1.00 0.63
(g/ml)
Humectabilidad
>1 >1 >1 >1
(min)
Humedad (%) 2.82 - 5.73 4.95
Valor de pH 6.13 5.57 6.77 6.96
Estabilidad del
concentrado - 3 - -
emulsionable (ml)
Suspendibilidad (%) 97.26 - - 98.50
Tamaño de la
74.11 - 63.80 96.00
partícula (%)
Actividad de agua
0.37 0.45 0.47 0.50
(aw)
59
VI. CONCLUSIONES
• El formulado biológico con mayor estabilidad y preservación de Trichoderma asperellum,

después de seis meses de almacenamiento fue el polvo mojable almacenado a bajas
temperaturas (4°C), escogido por presentar alta viabilidad tanto en germinación con valor
mayor al 85% y concentración de colonias superior al 1x108 UFC/g; límite mínimo establecido
por el Laboratorio de Control Biológico del INIAP-EESC.
• Los prototipos desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum presentaron
mayor viabilidad por seis meses de almacenamiento cuando fueron almacenados en
refrigeración 4°C.
• La temperatura de 30°C afectó la estabilidad de Trichoderma asperellum en las formulaciones
causando en algunos de ellos la pérdida total de la viabilidad.
• Las características fisicoquímicas, porcentaje de humedad, actividad de agua, densidad
apisonada, suspensibilidad, pH y tamaño de la partícula en los prototipos de bioformulaciones
sólidas; polvo mojable, gránulo cubierto y gránulo dispersable se mantuvieron dentro de los
límites establecidos para asegurar la calidad de los productos con excepción de la
humectabilidad que superó el límite para el tiempo de mojadura.
• El bioformulado líquido concentrado emulsionable presentó estabilidad en las características
fisicoquímicas pH y aw después de su manufactura y durante el almacenamiento. Sin embargo,
no se observó una adecuada formación de emulsión, a pesar de que el parámetro de cremado
estuvo dentro de los límites de aceptación.
• El polvo mojable a 30°C fue el único producto que mantuvo su germinación mayor al 80%,
después de seis meses de almacenamiento. Sin embargo, su concentración estuvo bajo del
límite de aceptación, siendo esta una característica de mejora.
• Valores de actividad de agua de hasta 0,20 en formulaciones de polvo mojable mantienen, las
características microbiológicas de Trichoderma asperellum por periodos prolongados.
60
VII. RECOMENDACIONES
• Mejorar la característica de humectabilidad en los prototipos polvo mojable y gránulo

dispersable para disminuir el tiempo de humectación completa de las partículas y asegurar
la inmediata liberación del ingrediente activo.
• Optimizar la estabilidad del concentrado emulsionable mediante la adición de diferentes
productos estabilizantes que mejoren la emulsificación y su posterior aplicación en el
campo.
• Evaluar varios agentes aglutinantes y humectantes para formulación del gránulo
dispersable para disminuir disgregación del producto durante el almacenamiento.
• Estudiar la compatibilidad de más ingredientes inertes con el hongo Trichoderma

asperellum para mejorar las propiedades microbiológicas y fisicoquímicas de las
formulaciones ensayadas.
• Realizar un análisis socio económico del mejor prototipo a base de conidias de Trichoderma
asperellum.
• Estudiar los efectos de la aw sobre Trichoderma asperellum para determinar los mínimos y
máximos valores en los cuales puede sobrevivir el microorganismo en una formulación.
• Implementar ensayos a nivel de invernadero y campo para evaluar aplicación y eficacia del
prototipo en polvo mojable a base de conidias de Trichoderma asperellum.
61
VIII. RESUMEN
Ecuador posee un sistema de producción de cultivos diferenciado por el tamaño de la Unidad
Productiva Agropecuaria (UPA) que presenta diversos factores edafoclimáticos en cada Región del
país los cuales contribuyen al desarrollo de plagas (Vallejo, 2014). Las pérdidas generadas por
patógenos pueden superar el 20% de los costos de producción, dependiendo de la severidad de
ataque razón por la cual se ha impulsado la búsqueda de estrategias de control que sean
alternativas al control químico y eficientes. El control biológico es una opción para minorar el uso
de agroquímicos, mediante la utilización de microorganismos antagonistas sobre otros patógenos
(Bettiol et al.,2014).
Los hongos biocontroladores pertenecientes al género Trichoderma, por su versatilidad,

adaptabilidad y fácil manipulación son capaces de controlar una amplia gama de microorganismos
patógenos (Falconí, 2010), siendo los preferidos para el control biológico. Actualmente se ha
incrementado el uso de hongos antagonistas motivo por el que se buscan maneras de conservar al
microorganismo por mayor tiempo asegurando sus características físicas y microbiológicas. El
desarrollo de bioformulaciones es una herramienta esencial que promueve la producción,
manipulación y aplicación eficiente del microorganismo en campo.
El presente trabajo tuvo como finalidad el desarrollo de cuatro prototipos de bioformulaciones a

base de conidias de Trichoderma asperellum, escogido por sus cualidades de antagonismo y su
amplio mecanismo de acción frente a diversos patógenos, observando que los productos
bioformulados se realizaron a partir de una cepa obtenida en el INIAP-Estación Experimental Litoral
Sur y con la mezcla de ingredientes inertes que ayudaron a la sobrevivencia, actividad, preservación
y almacenamiento del agente biocontrolador.
Las características microbiológicas evaluadas determinaron al mejor prototipo con respecto a su

preservación en el tiempo.
El mejor prototipo considerando la viabilidad y concentración de colonias UFC/g fue polvo mojable
que presentó una reducción mínima de la germinación al cabo de seis meses de almacenamiento a
4°C conservando un 87,6% y una concentración promedia de 3,76x108 UFC/g, valores considerados
aceptables dentro de los parámetros de calidad establecidos por el Laboratorio de Control
Biológico. También se debe considerar que el polvo mojable a 30 °C mantuvo una germinación del
80,8%, lo cual es importante debido a que las formulaciones realizadas tienen como finalidad su
aplicación en la Región Litoral del Ecuador.
El nivel de pureza presente en las cuatro bioformulaciones cumplió con el estándar de calidad
establecido, sugiriendo que la estabilidad y viabilidad del microorganismo no se vio afectado por
otros microorganismos durante la etapa de almacenamiento a dos temperaturas. Los cuatro
prototipos desarrollados a base de conidias de Trichoderma asperellum presentaron un porcentaje
de eficiencia superior al 90%, obteniendo mejor porcentaje el bioformulado polvo mojable con 100
% de eficiencia, es decir los procesos de formulación no afectaron al hongo.
Los resultados de la evaluación de las características fisicoquímicas se analizaron antes y durante

seis meses de almacenamiento, determinaron que existió estabilidad en estas propiedades.
La densidad apisonada promedio para gránulo dispersable oscila entre 630g/L y 670 g/L y gránulo
cubierto tuvo un valor constante de 1000g/L, adecuados para este tipo de productos. El prototipo
62
de polvo mojable presentó una densidad apisonada de 710g/L a 780g/L, valores que se encuentran
sobre los limites recomendables, sin embargo, el producto mostró un adecuado comportamiento
microbiológico. En consecuencia, los rangos obtenidos para cada prototipo sólido sugieren que no
existirán problemas en operaciones de formulación a gran escala.
La humectabilidad de los prototipos sólidos (WP y WG) no presentaron un tiempo de humectación

adecuado para bioformulaciones debido a que exceden el minuto para humedecerse
completamente.
El porcentaje de humedad fue evaluada solo en los prototipos sólidos y según el análisis de los
resultados esta se encuentra entre un rango entre 2 a 5%, niveles adecuados y estables que no
permiten proliferación de agentes contaminantes, así como evitar compactación o aglomeración
de las partículas dentro del envase.
El pH determinado en los cuatro prototipos tanto sólidos como el líquido a base de Trichoderma
asperellum se encuentran en un rango de 5 a 7, valores adecuados para formulaciones biológicas.
El pH mantuvo estables las formulaciones y no influyó negativamente en la germinación del hongo.
La estabilidad del concentrado emulsionable mostró que la cantidad de cremado obtenido en la

primera hora y 24 horas después de reconstituido en agua, estuvo dentro de los rangos permitidos
para formulaciones en aceite. Sin embargo, no existe reacción de cambio de color de la formulación
al hacer contacto con el agua, lo que puede sugerir que la emulsión no es completamente efectiva
y se debe mejorar mediante adición de agentes emulsificantes.
Los prototipos WP y WG a base de Trichoderma asperellum, presentan un porcentaje de

suspendibilidad adecuado para formulaciones de reconstitución en agua y aplicación con equipos
de aspersión. La suspendibilidad se mantuvo superior al 90% a partir de su formulación.
El tamaño de la partícula para formulaciones sólidas como polvo mojable y gránulo cubierto no
presentan límites definidos de aceptación y se tomaron como validos los rangos obtenidos para los
prototipos desarrollados: El polvo mojable presentó uniformidad del tamaño de partícula siendo
inferior a 53µm, tamaño que permite un adecuado envase y almacenamiento. El gránulo cubierto
y gránulo dispersable presentaron una homogeneidad de tamaño que osciló entre 1,70 mm y
250µm- Las temperaturas y período de almacenamiento no produjeron cambios en el tamaño de
la partícula de los prototipos.
La actividad de agua de 0,28 que presentó el WP, mantuvo en mejores condiciones las
características del hongo, dejando al microorganismo en latencia por mayor tiempo en
comparación del resto de prototipos.
Por consiguiente, solo prototipos en refrigeración presentaron una vida útil y estabilidad por seis
meses de almacenamiento, asegurando la sobrevivencia de las conidias de Trichoderma
asperellum. El almacenamiento a temperaturas elevadas reduce la estabilidad del microrganismo
corroborando la reducción su viabilidad después de 24 horas.
63
SUMMARY
Ecuador has a system of crop production differentiated by the size of the Agricultural Productive
Unit (UPA) that presents various edaphoclimatic factors in each region of the country which
contribute to the development of pests (Vallejo, 2014). The losses generated by pathogens can
exceed 20% of production costs, depending on the severity of the attack, which is why the search
for control strategies that are alternatives to chemical control and efficient. Biological control is an
option to reduce the use of agrochemicals, through the use of antagonistic microorganisms on
other pathogens (Bettiol et al.,2014).
The biocontroller fungi belonging to the genus Trichoderma, for their versatility, adaptability and
easy handling are able to control a wide range of pathogenic microorganisms (Falconí, 2010), being
preferred for biological control. Currently, the use of antagonist fungi has been increased, which is
why ways are looking for ways of preserving the microorganism for a longer time assuring its
physical and microbiological characteristics. The development of bioformulations is an essential
tool that promotes the production, handling and efficient application of the microorganism in the
field.
The purpose of this work was to developing four prototypes of bioformulations based on
Trichoderma asperellum, chosen for its antagonistic qualities and its broad mechanism of action
against various pathogens, contemplating that the bioformulated products were made from a strain
obtained at the INIAP- Station Experimental Litoral Sur and with the mixture of inert ingredients
that helped the survival, activity, preservation and storage of the biocontrol agent.
The microbiological characteristics evaluated determined the best prototype with respect to its
preservation over time.
The best prototype based on the viability and concentration of conidia CFU / g was wettable powder
that presented a minimum reduction of germination after six months of storage at 4 ° C, conserving
87.6% and 3.76x108 CFU / g, respectively, values within the quality parameters established by the
Biological Control Laboratory. It should also be taken into account that wettable powder at 30 ° C
maintained a germination of 80.8%, which is important because the formulations made are
intended for application in the Littoral Region of Ecuador.
The level of purity present in the four bioformulations met the established quality standard,
suggesting that the stability and viability of the microorganism was not affected by other
microorganisms during the storage stage at two temperatures. The four prototypes developed
based on conidia of Trichoderma asperellum presented a percentage of efficiency level higher than
90%, obtaining a better percentage of the bioformulated wettable powder with 100% efficiency,
that is, the formulation processes did not affect the fungus.
The results of the evaluation of the physicochemical characteristics were analyzed before and
during six months of storage, determined that there was stability in these properties.
64
The average rammed density for dispersible granule ranges from 630g / L to 670 g / L and covered
granule had a constant value of 1000g / L, suitable for this type of products. The prototype of
wettable powder presented a tamped density of 710g / L to 780g / L, values that are above the
recommendable limits, however, the product showed an adequate microbiological behavior.
Consequently, the ranges obtained for each solid prototype suggest that there will be no problems
in large-scale formulation operations.
The wettability of the solid prototypes (WP and WG) did not present an adequate wetting time for
bioformulations because they exceed one minute to completely moisten.
The percentage of humidity was evaluated only in the solid prototypes and according to the analysis
of the results this is within a range between 2 to 5%, suitable and stable levels that do not allow
proliferation of contaminating agents as well as avoiding without compaction or agglomeration of
the particles in the formulations inside the container.
The pH determined in the four solid prototypes and the liquid based on Trichoderma asperellum
are in a range of 5 to 7 values suitable for biological formulations. The pH kept the formulations
stable and did not influence negatively in the germination of the fungus.
The stability of the emulsifiable concentrate showed that the amount of cream obtained in the first
hour and 24 hours after reconstitution in water was within the allowed ranges for oil formulations.
However, there is no color change reaction of the formulation when making contact with water,
which may suggest that the emulsion is not completely effective and must be improved by the
addition of emulsifying agents.
The prototypes WP and WG based on Trichoderma asperellum, present a percentage of suitable

suspensibility for formulations of reconstitution in water and application with spray equipment.
Suspendability remained above 90% from the time of production.
The particle size for solid formulations such as wettable powder and covered granule do not have
defined limits of acceptance and the ranges obtained for the developed prototypes were taken as
valid: Wettable powder showed uniformity of the particle size being less than 53μm, size that allows
a suitable container and storage. Coated granule and dispersible granule presented a homogeneity
of size that ranged between 1.70 mm and 250 μm- Temperatures and storage period did not change
the particle size of the prototypes.
The water activity of 0.28 presented by WP kept the characteristics of fungus in better conditions,
leaving the microorganism in latency for a longer time compared to the rest of the prototypes.
Therefore, only prototypes in refrigeration presented a shelf life and stability for six months of
storage, assuring the survival of the conidia of Trichoderma Asperellum. Storage at elevated
temperatures reduces the stability of the microorganism by corroborating the reduction of its
viability after 24 hours.
65
IX. REFERENCIAS
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69
X. ANEXOS
Anexo 1. Identificación del aislamiento de Trichoderma asperellum realizado por INIAP-Estación
Experimental Litoral Sur.
70
Anexo 2. Parámetros de calidad para formulaciones biológicas, establecidos por el Laboratorio
de Control Biológico de INIAP-EESC.
Parámetros de calidad
Variables Rango Polvo Concentrad Gránulo Gránulo

aceptación Mojable o Cubierto Dispersabl
Emulsionabl e
e
Concentración de 1x108 1x108 1x108 1x108 1x108
conidias (UFC/g o ml)
Pureza (%) < 0,1 % < 0,1 % < 0,1 % < 0,1 % < 0,1 %
Porcentaje de > 85 % > 85 % > 85 % > 85 % > 85 %
germinación (%)
Nivel de eficiencia (%) > 60 % > 60 % > 60 % > 60 % > 60 %
Porcentaje de humedad 3 a 7% 3a7% NO APLICA 3a5% 3a7%
(%)
Actividad de agua máximo 0,7 máximo máximo 0,7 máximo 0,7 máximo
0,7 0,7
Densidad apisonada hasta 1g/ml 1g/ml NO APLICA 1g/ml 1g/ml
(g/ml)
71
Valor pH 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0 5,0 a 7,0
Tiempo de humectación < 60seg < 60seg NO APLICA NO APLICA < 60seg
(s)
Suspendibilidad (%) > 50 % sólidos > 50 % > 60 % NO APLICA > 50 %
y > 60% CE
Tamaño de la partícula < 50 µm polvo < 50 µm NO APLICA NO APLICA NO APLICA
(%) mojable
Estabilidad Concentrado 1hora ---3ml NO APLICA 3 ml crema NO APLICA NO APLICA
Emulsionable (ml) 24horas - 4ml
Anexo 3. Determinación de la concentración de colonias (UFC/g) en diluciones serias de 104 a 106.
Anexo 4. Determinación del porcentaje de germinación (%) de Trichoderma asperellum.
72
Anexo 5. Conteo de conidias de Trichoderma asperellum germinadas y sin germinar (40x).
Anexo 6. Área de secado de sustrato arroz con deshumificador.
73
Anexo 7. Producción masiva de Trichoderma asperellum en sustrato arroz.
Anexo 8. Procedimiento para medición de la densidad apisonada en productos sólidos.
74
Anexo 9: Determinación de la actividad de agua
Anexo 10: Determinación del porcentaje de humedad de los productos biológicos
75
Anexo 11: Determinación del valor de pH
Anexo 12: Determinación de la suspendibilidad
76

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

DESARROLLO DE CUATRO PROTOTIPOS DE BIOFORMULACIONES EN

Trabajo de titulación previo a la obtención del Título de Ingeniera Agrónoma

AUTORA: Perdomo Quishpe Cynthia Estefania

QUITO, octubre 2018

Yo, CYNTHIA ESTEFANIA PERDOMO QUISHPE, en calidad de autora y titular de los

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de

Cynthia Estefania Perdomo Quishpe

En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por CYNTHIA ESTEFANIA

En la ciudad de Quito, a los 28 días del mes de junio de 2018

Ing. Agr. Jorge Caicedo, M. Sc. __________________________

Lic. Diego Salazar, Mag. __________________________

Ing. Agr. Clara Iza, M. Sc. __________________________

Ing. Agr. Christian Tamayo, M. Sc. __________________________

Este trabajo de titulación lo dedico a Dios y a mis padres Rosa y

A mis sobrinas Katherine y Danna quienes son la fuerza adicional

Agresearch-Nueva Zelanda, en la persona de Trevor Jackson, al

A Jorge Caicedo M. Sc, en calidad de tutor académico, por dirigir mi

A Francisco Báez Ing. Agr. Técnico del Laboratorio de Control

A la Doctora Laura Villamizar de AgResearch–Nueva Zelanda, por su

A mi familia en especial a mis padres y mi tía Geovanna, por su

A mi abuelito Luis, por sus regaños y consejos; a mi abuelita Mercedes

A mis amigos y amigas en especial a Hugo, Cynthia, Diana y Pamela,

2.11.5. Tamaño de la partícula (%) __________________________________________ 11

3.12.3. Densidad apisonada (g/ml) ___________________________________________ 28

1. Porcentaje de contaminación de los bioformulados, antes y después de seis meses

2. Porcentaje de pureza de los bioformulados, antes y después de seis meses de

3. Suspendabilidad en porcentaje del WP y WG, después de manufacturación y

4. Distribución del material retenido (%) de WG, a partir de su elaboración (inicial) y

5. Distribución del material retenido (%) de CG, a partir de su elaboración (inicial) y

6. Distribución del material retenido (%) de WP, a partir de su elaboración (inicial) y

1. Colonias del hongo Trichoderma asperellum. ........................................................ 15

2. Producción masiva de Trichoderma asperellum a) multiplicación in vitro b)

3. Método de extracción y conservación de conidias secas de Trichoderma asperellum.

4. Mezcla de excipientes con el ingrediente activo (conidias puras y secas). ............. 18

5. Prototipo de polvo mojable a base de conidias de Trichoderma asperellum. ......... 18

6. Empaque y etiquetado del producto polvo mojable (WP) a dos condiciones de

7. Formulación del producto concentrado emulsionable (EC) a base de conidias de

8. Empaque y etiquetado de porciones del producto concentrado emulsionable (EC).

9. Elaboración del Gránulo Dispersable (WG). ........................................................... 24

10. Secado del Gránulo Dispersable (WG). .................................................................. 24

11. Empaque y división de gránulos dispersables (WG) para almacenamiento a dos

13. Elaboración y secado del prototipo gránulo cubierto (CG). ................................... 22

15. Esquema de la disposición de las unidades experimentales. ................................... 31

16. Disposición de las unidades experimentales según cada tratamiento a diferentes

17. Humectabilidad de WP. ........................................................................................... 44

18. Humectabilidad de WG. .......................................................................................... 45

19. Estabilidad del concentrado emulsionable cremado a) 1 hora b) 24 horas. ............ 49

2. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del polvo

3. Datos informativos correspondientes al etiquetado del polvo mojable. .................. 19

4. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del

5. Datos informativos correspondientes al etiquetado del concentrado emulsionable. 21

6. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

7. Porcentajes de ingredientes que forman el Biomatrix para gránulo cubierto .......... 21

8. Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo cubierto................ 23

9. Porcentajes de ingredientes inertes y principio activo para elaboración del gránulo

10. Datos informativos correspondientes al etiquetado del gránulo dispersable. .......... 25

11. Medio de cultivo utilizado en el porcentaje de germinación de conidias. ............... 25