Micro Arrays

Universidad Central del Ecuador
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Biología Molecular
Integrantes: Anrango Kevin, Armas Joselyn y Luzón Michael
Fecha: 08/09/2021
Resumen exposición “Técnica Biomolecular Microarrays”
1. Objetivo
Permiten la detección de moléculas de ADN o ARN por hibridación o adherencia de las
moléculas en cuestión de ADN o ARN en un portaobjetos de vidrio, y detección del ADN o
ARN adherido mediante diferentes etiquetas o colores que les permiten ser detectados al
microscopio. Permite monitorizar simultáneamente el nivel de expresión de miles de genes en
un conjunto de células. Es una tecnología que, básicamente, miniaturizan técnicas que se han
utilizado en los laboratorios de genética molecular. (Biesecker, 2020)
2. Fundamento
Los microarrays de ADN es un instrumento que permite cumplir estudios genéticos varios
establecidos en la miniaturización de métodos biológicos. La primera aplicación de esta
tecnología fue para medir el nivel de expresión de miles de genes. El ejercicio de los
microarrays de expresión se basa en la capacidad de las moléculas complementarias de ADN
de hibridar entre sí. Mínimas cantidades de ADN, correspondientes a diversos genes cuya
expresión se desea medir, son depositadas en una base de cristal. Para ello se utilizan robots
de precisión que usan unas agujas especiales para obtener las moléculas de sus recipientes y
depositarlas en las coordenadas adecuadas. A estas muestras de ADN depositadas en el
microarray las denominaremos dianas. En un microarray típico, una superficie de 2 ×2 cm
puede contener más de 10.000 dianas en forma de pequeños puntos separados
adecuadamente. De las células que aspiremos calcular su expresión conseguiremos un tipo
de ARN que se convertirá en ADN complementario (ADNc) y se marcará con una molécula
fluorescente. A esta muestra marcada la denominaremos sonda y se enfrentará a las dianas
del microarray. Cada molécula de ADNc marcada de la sonda se moverá por difusión hacia la
diana que contenga su molécula complementaria para hibridarse con ella y quedar fijada allí.
Después de un tiempo para que la mayoría de las cadenas complementarias hibriden, el
Microarray se lava y se procede a hacer una medición relativa de la cantidad de ADN de la
sonda que ha quedado fijada en cada diana. (Moreno & Solé, 2004)
Tipos de microarrays de la DNA
Los microarrays de la DNA son de cuatro tipos:
1. Microarrays del cDNA: utiliza los cabos complementarios de la DNA formados por
la transcripción del mRNA
2. Microarrays oligos de la DNA: las aplicaciones químicamente sintetizaron la DNA
oliga como antenas
3. Microarrays del CCB: utiliza el patrón amplificado por la reacción en cadena de
polimerasa como la antena
4. Microarrays de SNP: utilizado para descubrir polimorfismos dentro de una población
(Ondarza, 2014)
3. Metodología Secuencial
 Un solo color
 Recolección de muestra: célula o tejido del organismo que deseamos realizar el
estudio. (Gutiérrez, 2013).
 Amplificación por PCR: de las regiones de interés del estudio, las cuales contienen
los SNPs que se van a analizar (Gutiérrez, 2013).
 Minisecuenciación en solución de la muestra de DNA:
Los ddNTP (desoxiribonucleótidos) previamente marcados con fluorescencia se
incorporan en el sitio de SNP en la minisecuenciación (Gutiérrez, 2013).
 Hibridación en una matriz (microarray): puede ser de vidrio, plástico, silicio u
otros materiales. En esta matriz, encontramos una especie de pocillos en lo que hay
unas sondas de DNA monocatenario fijadas en el fondo. Cuando nuestras secuencias
procesadas tienen complementariedad específica con las sondas de la matriz quedan
unidas, mientras que las secuencias que presenten SNPs no complementarios no se
hibridarán y perderán en el posterior lavado para quitar los segmentos sobrantes
(Gutiérrez, 2013).
 Resultado: Los pocillos en los que ha tenido lugar esta hibridación secuencia – sonda
emitirán fluorescencia, esta puede ser observada mediante microscopios específicos
como el microscopio con focal o mediante láser. También existen máquinas que
hacen la lectura de la fluorescencia directa, muy útil cuando utilizamos fluorescencias
de diferentes colores, ya que el análisis es automático y, además, cuantifican la
intensidad de la señal, útil cuando la fluorescencia se ha perdido parcialmente
(Gutiérrez, 2013).
(Gutiérrez, 2013).
 Dos colores
 Preparación de muestras: El ARNm total se extrae de las muestras control y
experimentales (BIOTED, 2017).
 Síntesis de ADNc: Se generan bibliotecas de ADN complementario (ADNc) a partir
de las muestras de ARN usando la enzima transcriptasa inversa (RT) para producir
ADN (BIOTED, 2017).
 Etiquetas: Las bibliotecas de ADNc son etiquetados con sondas fluorescentes. El
ADNc aislado de la muestra control es marcado con una etiqueta fluorescente verde
normalmente, mientras que ADNc aislado de la muestra experimental se marca con
un fluorescente rojo (BIOTED, 2017).
 Hibridación: El ADNc marcado a partir de muestras control y experimentales se
coloca en el chip micromatriz, donde se une (o se hibrida) con el punto que contiene
el oligo con una secuencia complementaria. Estos resultados de hibridación dan lugar
a una hélice de doble cadena de ADN estable. Después de la hibridación, el chip se
lava varias veces para eliminar cualquier ADNc que no se ha unido a un oligo en el
chip (BIOTED, 2017).
 Búsqueda y Análisis de Datos: El chip se escanea con un láser que excita los
marcadores fluorescentes. La información de la fluorescencia en cada punto se recoge
y se procesa mediante un programa especializado que crea una imagen en color de la
micromatriz. La imagen se analiza utilizando un programa que interpreta la
fluorescencia de cada punto (BIOTED, 2017). Por lo tanto, un punto verde revela que
hay menos mRNA presente en la célula de cáncer de lo normal, y el gen se dice que
tiene una "baja expresión". Por el contrario, una mancha roja significaría que el gen
tiene una "elevada expresión" en la muestra experimental (BIOTED, 2017).
(BIOTED, 2017).
4. Estudio de aplicación
EVALUACIÓN DE UNA NUEVA PLATAFORMA COMERCIAL DE
MICROARRAYS PARA LA DETECCIÓN SIMULTÁNEA DE Β-LACTAMASA Y
GENES MCR-1 Y MCR-2 EN ENTEROBACTERIAS
En este estudio se evaluó una nueva plataforma de microarrays CT103XL para la detección
de genes de resistencia a las polimixinas en enterobacteriácea aisladas de humanos, animales
y comida. Se aislaron 106 cepas entre las que tenemos 80 cepas de E. coli, 14 de Klebsiella
pneumoniae y 12 de otras especies.
De todas estas cepas 30 fueron positivas para mcr-1 y 2 positivas para mcr-2, el ADN de
estas se extrajo rápidamente mediante PCR High Pure y se procedió a realizar el análisis
microarrays siguiendo las instrucciones del fabricante. El nuevo CT103XL utiliza una
reacción de detección de ligadura múltiple. En resumen, cada sonda consta de dos brazos que
contienen una secuencia específica del gen diana, un sitio de unión del cebador universal y un
código postal para la hibridación. Las sondas ligadas y amplificadas se hibridan con la micro
matriz, se visualizan utilizando un marcador de biotina incorporado en el cebador y se
interpretan automáticamente mediante software.
Los genes mcr-1 y mcr-2 fueron detectados correctamente por el nuevo sistema de matriz en
los 32 aislamientos. En particular, los portadores de 30 mcr-1 mostraron reacciones positivas
con los tres nuevos puntos de hibridación, correspondientes a la detección de mcr-1. Por otro
lado, ambas cepas portadoras de mcr-2 mostraron resultados positivos con dos de las tres
manchas, revelando mcr-2.
Este trabajo demostró la capacidad y precisión de la nueva matriz CT103XL para identificar
simultáneamente mcr-1 y mcr-2 y genes bla clínicamente importantes. Esta plataforma
reforzada representa, por lo tanto, una herramienta esencial para los laboratorios clínicos,
especialmente para la caracterización rápida de grandes colecciones de bacterias
Gramnegativas multirresistentes, proporcionando datos epidemiológicos esenciales.
(Bernasconi, O. J., Principe, L., Tinguely, R. y otros, 2017)
5. Bibliografía
Bernasconi, O. J., Principe, L., Tinguely, R., Karczmarek, A., Perreten, V., Luzzaro, F., &
Endimiani, A. (2017). Evaluation of a new commercial microarray platform for the
simultaneous detection of β-lactamase and mcr-1 and mcr-2 genes in
Enterobacteriaceae. Journal of clinical microbiology, 55(10), 3138-3141.
BIOTED. (2017). ADN y ARN Microarrays. Obtenido el 08/09/21 de:
https://www.bioted.es/protocolos/ADN-ARN-MICROARRAYS.pdf
Gutiérrez, D. (2013). Microarrays de ADN. Obtenido el 08/09/2021 de:
https://forensemolecular.es.tl/Microarrays-de-DNA.htm
Biesecker, L. G. (2020). National Human Genome Research Institute . Obtenido de
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Tecnologia-de-microarrays#:~:text=La
%20tecnolog%C3%ADa%20de%20microarrays%20es,en%20contacto%20con%20el
%20chip.
Moreno, V., & Solé, X. (2004). elsevier. Obtenido de https://www.elsevier.es/es-revista-
medicina-clinica-2-pdf-13057538
Ondarza, R. N. (07 de Mayo de 2014). Obtenido de
https://apuntesbiologiamol.blogspot.com/2014/05/microarrays-microarreglos.html

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