UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

“EVALUACION DE MICROORGANISMOS INDICADORES EN

SUPERFICIES DE CONTACTO CON ALIMENTOS EN PLANTAS DE
EMPAQUE DE MANZANAS DEL ESTADO DE WASHINGTON”

TRABAJO DE SUFICIENCIA PROFESIONAL PARA OPTAR EL

TÍTULO DE INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

BLANCA ELIA RUIZ LLACSAHUANGA

LIMA - PERÚ
2022

La UNALM es titular de los derechos patrimoniales de la presente investigación

(Art. 24 - Reglamento de Propiedad Intelectual)
 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA
LA MOLINA
FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

“EVALUACION DE MICROORGANISMOS INDICADORES EN

SUPERFICIES DE CONTACTO CON ALIMENTOS EN PLANTAS DE
EMPAQUE DE MANZANAS DEL ESTADO DE WASHINGTON”

TRABAJO DE SUFICIENCIA PROFESIONAL PARA OPTAR EL TÍTULO DE

INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

Presentada por:

BLANCA ELIA RUIZ LLACSAHUANGA

Sustentada y aprobada por el siguiente jurado:

Dr. Marcial Ibo Silva Jaimes

PRESIDENTE

Mg.Sc. Carlos Elías Peñafiel Mg.Sc. Beatriz Hatta Sakoda

MIEMBRO MIEMBRO

Dra. Patricia Glorio Paulet

ASESORA
Lima-Perú
2022
 Dedicatoria
A mi familia: Mamá Maria Julia, Papá Axel G., Hermana Ketty, Hermano Axel D.
Por todo su amor y apoyo incondicional
 AGRADECIMIENTOS

- A la Dra. Faith Critzer, jefa del laboratorio de Inocuidad de Alimentos de Washington

State University, por su excelente mentoría y la oportunidad de realizar esta investigación
bajo su dirección.
- A la Dra. Patricia Glorio Paulet, por su apoyo y dirección durante la elaboración y
revisión de esta monografía.
- A Washington Tree Fruit Research Commission por financiar económicamente esta
investigación, además de colaborar en el reclutamiento de plantas de empaque de manzanas.
- A las cinco plantas de empaque de manzana del estado de Washington que siempre
estuvieron dispuestas a colaborar en todos los días de muestreo.
- A mis compañeros de laboratorio y muestreo: Critzer crew! por toda su ayuda durante
los días de muestreo y procesamiento de muestras.
- A mi familia y amigos en Perú, por sus continuas muestras de amor y apoyo a la
distancia.
- A todos mis amigos de Washington y Georgia por todo su apoyo durante todos estos
años de estadía en EE.UU.
 ÍNDICE GENERAL
RESUMEN
ABSTRACT
I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1
II. REVISIÓN DE LITERATURA ......................................................................... 3
2.1. Microorganismos indicadores .............................................................................. 3
2.1.1. Aerobios mesófilos totales ................................................................................... 4
2.1.2. Enterobacteriaceae .............................................................................................. 4
2.1.3. Coliformes ............................................................................................................ 5
2.1.4. Escherichia coli.................................................................................................... 6
2.2. Uso de microorganismos indicadores en la industria de productos agrícolas
frescos .................................................................................................................. 6
2.3. Límites microbiológicos aceptables de microorganismos indicadores según
normas nacionales e internacionales en productos agrícolas frescos ................... 8
2.4. Métodos tradicionales para la evaluación de limpieza y desinfección de
superficies ............................................................................................................ 8
2.5 Métodos tradicionales para la evaluación de limpieza y desinfección de
superficies .......................................................................................................... 11
2.5.1 Placas Petrifilm .................................................................................................. 11
2.6 Métodos rápidos para la evaluación de limpieza y desinfección de superficies 12
2.6.1 Prueba de Bioluminiscencia ............................................................................... 12
2.7 Rutas de contaminación microbiana en la industria de empaque de manzanas
frescas................................................................................................................. 13
III. METODOLOGÍA ............................................................................................. 15
3.1. Lugar de Ejecución ............................................................................................ 15
3.2. Superficies muestreadas ..................................................................................... 15
3.3. Materiales, Equipos y Reactivos ........................................................................ 15
3.4. Métodos de Análisis ........................................................................................... 16
3.5. Metodología Experimental ................................................................................. 17
IV. RESULTADOS Y DISCUSION ...................................................................... 30
4.1 Recuentos de microorganismos indicadores ...................................................... 30
4.1.1 Aerobios mesófilos totales ................................................................................. 34
4.1.2 Enterobacteriaceae ............................................................................................ 35
4.1.3 Coliformes .......................................................................................................... 36
4.1.4 Escherichia coli ................................................................................................. 36
4.2 Límites microbiológicos recomendados según regulaciones nacionales e
internacionales ................................................................................................... 37
4.3 Aplicación de las competencias profesionales ................................................... 39
V. CONCLUSIONES ............................................................................................ 42
VI. RECOMENDACIONES .................................................................................. 43
VII. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 44
VIII. ANEXOS ............................................................................................................ 52
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Límites microbiológicos de microorganismos indicadores aceptables según normas

nacionales e internacionales ................................................................................................. 9
Tabla 2. Número y tipos de superficies de contacto con alimentos seleccionadas en cada
operación unitaria del proceso de empaque de manzanas .................................................. 23
Tabla 3. Ejemplos de superficies de contacto con alimentos muestreados en las plantas de
empaque de manzanas ........................................................................................................ 24
Tabla 4. Población promedio de microorganismos indicadores (Promedio ± desviación
estándar) (Log UFC/100 cm2) en cada operación unitaria del proceso de empaque de
manzanas ............................................................................................................................ 31
Tabla 5. Población promedio de microorganismos indicadores (Log UFC/100 cm2) por
superficie en el proceso de empaque de manzanas............................................................. 32
Tabla 6. Límites microbiológicos recomendados en superficies de contacto con alimentos en
plantas de empaque de manzanas luego de procedimientos de limpieza y desinfección ... 38
Tabla 7. Cursos y conocimientos adquiridos y aplicados en el desempeño laboral ........... 40
Tabla 8. Cursos y conocimientos adquiridos y aplicados en la evaluación de
microorganismos indicadores ............................................................................................. 41
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de empaque de manzanas................................... 18

Figura 2. Operación unitaria de lavado .............................................................................. 19
Figura 3. Operación unitaria de lavado/enjuague/desinfección.......................................... 19
Figura 4. Operación unitaria de secado por ventiladores ................................................... 20
Figura 5. Operación unitaria de encerado ........................................................................... 20
Figura 6. Operación unitaria de secado por túnel ............................................................... 21
Figura 7. Operación unitaria de clasificación .................................................................... 21
Figura 8. Operación unitaria de empacado ......................................................................... 22
Figura 9. Esquema de protocolo de procesamiento de muestras para el recuento de
microorganismos indicadores ............................................................................................. 28
 ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1. NÚMERO DE SUPERFICIES MUESTREADAS SEGÚN TIEMPO DE

ALMACENAMIENTO DE MANZANAS, ESTACIÓN DEL AÑO EN QUE SE REALIZÓ
EL MUESTREO Y OPERACIÓN UNITARIA DEL PROCESO DE EMPAQUE DE
MANZANAS ..................................................................................................................... 53
ANEXO 2. LÍMITE SUPERIOR DE CONTROL (LSC) DE RECUENTOS DE AEROBIOS
MESÓFILOS TOTALES EN SUPERFICIES DE CONTACTO CON ALIMENTOS DE
PLANTAS DE EMPAQUE DE MANZANA LUEGO DE PROCEDIMIENTOS DE
LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN ........................................................................................ 54
ANEXO 3. LÍMITE SUPERIOR DE CONTROL (LSC) DE RECUENTOS DE
ENTEROBACTERIACEAE EN SUPERFICIES DE CONTACTO CON ALIMENTOS DE
PLANTAS DE EMPAQUE DE MANZANA LUEGO DE PROCEDIMIENTOS DE
LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN ........................................................................................ 55
ANEXO 4. LÍMITE SUPERIOR DE CONTROL (LSC) DE RECUENTOS DE
COLIFORMES EN SUPERFICIES DE CONTACTO CON ALIMENTOS DE PLANTAS
DE EMPAQUE DE MANZANA LUEGO DE PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA Y
DESINFECCIÓN ............................................................................................................... 56
ANEXO 5. LÍMITE SUPERIOR DE CONTROL (LSC) DE RECUENTOS DE E. COLI EN
SUPERFICIES DE CONTACTO CON ALIMENTOS DE PLANTAS DE EMPAQUE DE
MANZANA LUEGO DE PROCEDIMIENTOS DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN ... 57
ANEXO 6. EJEMPLO DE CÁLCULO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS
(UFC) EN PLACAS PETRIFILM .................................................................................... 58
 RESUMEN

El estado de Washington es el primer productor de manzanas en los Estados Unidos (EE.

UU). El incremento de brotes alimentarios y retiros de producto del mercado causados por
contaminación cruzada entre manzanas frescas y superficies de contacto con alimentos han
incrementado las medidas de inocuidad alimentaria en la industria de empaque de manzanas.
Los microorganismos indicadores son usados para el monitoreo de higiene a través de la
validación de procedimientos de limpieza y desinfección de superficies. Sin embargo,
actualmente no existen estándares que definan limites microbiológicos para un nivel
aceptable de microorganismos indicadores en superficies de contacto con alimentos. Por
ello, los objetivos de esta investigación fueron determinar la población promedio y límites
microbiológicos de microorganismos indicadores como aerobios mesófilos totales,
Enterobacteriaceae, coliformes y Escherichia coli en superficies de contacto con alimentos
luego de procedimientos de limpieza y desinfección en cinco plantas de empaque de
manzanas del estado de Washington, EE. UU. Además, evaluar los recuentos
microbiológicos a través de cada operación unitaria y tipo de superficie. Se muestrearon 741
superficies pertenecientes a todo el proceso de empaque de manzanas durante una temporada
de empaque (setiembre 2018 – julio 2019). El análisis microbiológico se realizó mediante el
recuento en placas Petrifilm 3MTM. Se establecieron los rangos de límites microbiológicos
(Log UFC/100 cm2) de todos los microorganismos indicadores a través de cada operación
unitaria del proceso de empaque de manzanas. Respecto al recuento de aerobios mesófilos
totales, las operaciones unitarias de encerado y segundo secado por túnel mostraron valores
significativamente mayores a la operación de lavado. En cuanto a las poblaciones de
Enterobacteriaceae y coliformes, se obtuvieron mayores recuentos en las operaciones de
lavado y desinfección. Los recuentos de E. coli fueron bajos en todas las operaciones
unitarias y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ellas.

Palabras clave: Aerobios mesófilos totales, Enterobacteriaceae, coliformes, E. coli

 ABSTRACT

Washington state is the leading producer of apples in the United States (US). The increasing
association of foodborne outbreaks and recalls of fresh apples caused by cross-contamination
between food contact surfaces of equipment used for packing and fresh apples, have
emphasized the focus on food safety interventions within the apple packing industry.
Indicator organisms are used for hygiene monitoring of surfaces, through the validation of
cleaning and disinfection procedures. However, there are currently no standards that define
microbiological limits for an acceptable level of indicator organisms on food contact
surfaces. Therefore, the objectives of this research were to determine the average population
and microbiological limits of indicator organisms such as aerobic plate count,
Enterobacteriaceae, coliforms and Escherichia Coli on food contact surfaces after cleaning
and sanitation procedures in five commercial apple packing facilities located in Washington
State, US. In addition, to assess those microbial counts throughout each unit operation of the
packing process and by type of surface. Overall, 741 surfaces belonging to all unit operations
were sampled during a whole packing season (september 2018 – july 2019). Microbiological
analysis was performed using 3MTM Petrifilm plates. Ranges of microbial counts (Log
CFU/100 cm2) were established for each indicator organism throughout each unit operation
of the apple packing process. In regard to aerobic plate counts, the waxing and second tunnel
drying unit-operations showed significantly higher values than the washing operation.
Higher Enterobacteriaceae and coliforms populations were obtained in the washing and
sanitation unit operations. E. coli counts were low throughout all unit operations and no
statistically significant differences were found between them.

Key words: Aerobic plate count, Enterobacteriaceae, coliforms, E. coli

 I. INTRODUCCIÓN

Desde el año 2014, el incremento de brotes alimentarios (Centers for Disease Control and
Prevention (CDC), 2015; Marus et al., 2019) y el retiro de productos del mercado (U.S Food
and Drug Administration, 2017b, 2017c, 2019, 2020) asociado con manzanas frescas, junto
con la implementación de la nueva regulación “Acto de Modernización Seguridad
Alimentaria” (por sus siglas en inglés FSMA) en los Estados Unidos (EE. UU) han
intensificado las medidas de inocuidad alimentaria en la industria de empaque de manzanas.
El brote de listeriosis del año 2014 asociado con el consumo de manzanas acarameladas y
manzanas frescas causó siete muertes y 34 hospitalizaciones en los EE. UU, impactando
significativamente a la industria de manzanas frescas. La causa principal de este brote
alimentario fue una contaminación cruzada entre superficies de contacto con alimentos como
cepillos de pulido, cintas transportadoras, y contenedor de manzanas dentro de una planta de
empaque de manzanas (Angelo et al., 2017). Desde entonces se puso en evidencia que la
deficiencia de procedimientos de limpieza y desinfección pueden causar contaminación
cruzada y desencadenar así un brote alimentario. Estas situaciones representan problemas de
salud pública y pérdidas económicas que afectan la cadena de suministros en la industria de
manzanas. Se ha demostrado que una de las medidas para el efectivo control de patógenos
alimentarios como Listeria monocytogenes en plantas de procesamiento de alimentos es
mantener un estricto programa de higiene y saneamiento (Hoelzer et al., 2012; Wu et al.,
2020). Así, de manera preventiva se busca minimizar las condiciones que promuevan el
establecimiento y proliferación de este patógeno en superficies de contacto con alimentos
(Tortorello, 2003; U.S Food and Drug Administration, 2017a).

Los microorganismos indicadores se definen como un organismo o grupo de

microorganismos, cuya presencia en números que sobrepasen los límites establecidos
indican una falla en los procedimientos de limpieza y desinfección (Cordier, 2013). Por ello,
los microorganismos indicadores son ampliamente usados en la industria alimentaria para el
monitoreo y validación de higiene. Algunos ejemplos de microorganismos indicadores son
aerobios mesófilos totales, Enterobacteriaceae, coliformes y Escherichia coli (Moberg &
Kornacki, 2015). La evaluación de estos microorganismos indicadores es imprescindible
como parte de un programa de monitoreo ambiental con el fin de verificar la efectividad de
los procedimientos de limpieza y saneamiento en superficies (De Oliveira Mota et al., 2021;
Magdovitz et al., 2020; Ruiz-Llacsahuanga et al., 2021). No se recomienda la evaluación
directa de patógenos como L. monocytogenes debido a que los resultados pueden ser
engañosos. Los patógenos se encuentran en baja frecuencia y no distribuidos
uniformemente. Además, los métodos de detección son más costosos y se requiere de mayor
tiempo para obtener resultados (Moberg & Kornacki, 2015; U.S Food and Drug
Administration, 2017a).El estado de Washington es el principal productor de manzanas en
los EE. UU, con un 79% de su producción destinada al mercado fresco (U.S. Department of
Agriculture, National Agricultural Statistics Service, 2019). Por ello, es esencial
implementar controles preventivos de limpieza y desinfección efectivos y límites
microbiológicos a través de todo el proceso de empaque de manzanas, con el fin de prevenir
una contaminación cruzada entre superficies y la fruta a empacar. Actualmente, no existen
estándares que definan limites microbiológicos para un nivel aceptable de microorganismos
indicadores en superficies de contacto con alimentos. En consecuencia, cada tipo de industria
o planta de alimentos debe construir sus propios límites microbiológicos para validar sus
procedimientos de limpieza y desinfección. Por lo tanto, el objetivo general de esta
investigación fue determinar la población promedio y los límites microbiológicos de
microorganismos indicadores como aerobios mesófilos totales, Enterobacteriaceae,
coliformes y E. coli en superficies de contacto con alimentos de equipos utilizados en el
empaque de manzanas en cinco plantas de empaque de manzanas del estado de Washington,
EE. UU, luego de procedimientos de limpieza y desinfección.

Para ello se tuvo como objetivos específicos:

- Identificar las operaciones unitarias con la mayor población de microorganismos
indicadores en el proceso de empaque de manzanas.
- Identificar las superficies de contacto con alimentos con la mayor población de
microorganismos indicadores en el proceso de empaque de manzanas

2
 II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Microorganismos indicadores

Los microorganismos indicadores se definen como microorganismos, grupos de

microorganismos o metabolitos cuya presencia en números por encima de los límites
definidos indicaría una falla en el cumplimiento de Buenas Prácticas de Higiene. Los
microorganismos indicadores tienen la función de indicar una desviación de las medidas de
control de higiene implementadas (Cordier, 2013). A la vez, algunos grupos de
microorganismos indicadores pueden ser utilizados como microorganismos índices, es decir,
como predictores de la presencia de un patógeno (microorganismos índices e indicadores a
la vez) (Cordier, 2013). Algunos ejemplos de microorganismos indicadores son recuentos
de aerobios mesófilos totales, Enterobacteriaceae, coliformes, E. coli, Listeria especies,
levaduras y mohos (Moberg & Kornacki, 2015).

Los microorganismos indicadores generalmente se utilizar para evaluar los procesos de

limpieza y desinfección debido a que están presentes en poblaciones más altas que los
patógenos, se pueden obtener resultados dentro de 24 a 48 h, y los métodos de detección son
sencillos (Baylis et al., 2011). Los factores que deben considerarse antes de seleccionar qué
microorganismos indicadores se evaluaran son (Moberg & Kornacki, 2015):

- La naturaleza fisicoquímica del producto alimentario

- La microflora nativa del producto
- El grado de procesamiento del alimento
- El efecto que se esperaría que tuviera el procesamiento en uno o más de los
microorganismos indicadores evaluados
- La fisiología de los microorganismos indicadores
- La precisión con la que el método de prueba puede identificar los microorganismos
indicadores
2.1.1. Aerobios mesófilos totales

El recuento de aerobios mesófilos totales cuantifica todas las bacterias que crecen en
condiciones aerobias y a temperaturas mesofílicas (20-45 ºC) (Ryser & Schuman, 2015).
Dentro del grupo de microrganismos mesofílicos, también se encuentran las bacterias
psicotróficas, que se definen como bacterias que pueden crecer a temperaturas refrigeradas
(0-7 ºC), y que tienen una temperatura de crecimiento optimo a temperaturas superiores a
20ºC (Da Silva et al., 2013).

Los microorganismos aerobios mesófilos totales proveen un estimado total de la población

microbiana presente en la superficie y puede ser monitoreado antes y después de los
procedimientos de limpieza y desinfección para medir su eficacia (Ginny Moore, 2003). Sin
embargo, estos microorganismos indicadores no pueden distinguir los tipos de bacteria que
están presentes, además de que no especifican la presencia o ausencia de un patógeno
alimentario o toxina por lo tanto no son indicadores de inocuidad alimentaria (Ryser &
Schuman, 2015).

2.1.2. Enterobacteriaceae

La familia Enterobacteriaceae está conformada por microorganismos Gram-negativos y

anaerobios facultativos. Estos microorganismos tienen la habilidad de fermentar glucosa a
ácido, y entre otras características bioquímicas posee reacciones de oxidasa – negativa,
catalasa-positiva y reducen nitrato. Algunas especies son motiles, mientras que otras poseen
flagelos (Kornacki et al., 2015).

Las especies de Enterobacteriaceae se pueden encontrar tanto en fuentes intestinales como

no intestinales en animales y humanos. Por ello, la presencia de microorganismos de esta
familia no está asociados directamente con contaminación fecal (Baylis et al., 2011). La
familia Enterobacteriaceae incluye a los coliformes totales, coliformes fecales y E. coli
dentro de éste. Por lo tanto, los recuentos de Enterobacteriaceae deben ser mayores que las
poblaciones de Coliformes y E. coli (Baylis et al., 2011).

4
Otros géneros incluidos dentro de la familia Enterobacteriaceae son Citrobacter,
Cronobacter, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Salmonella, Shigella, Yersinia, etc.
(Adeolu et al., 2016). Los patógenos transmitidos por alimentos que están incluidos dentro
del grupo Enterobacteriaceae son Salmonella enterica, Shigella dysenteriae, Yersinia
enterocolitica, y varias especies patogénicas de E. coli, incluyendo E. coli O157: H7. Sin
embargo, la detección de Enterobacteriaceae no significa necesariamente la presencia de
ninguno de estos patógenos (Baylis et al., 2011).

El uso de Enterobacteriaceae como microorganismos indicadores son útiles debido a que

estos tienen la habilidad de establecerse en superficies donde los procedimientos de limpieza
y desinfección son inadecuados. Además, los químicos usados para la desinfección pueden
fácilmente inactivar estos microorganismos (Kornacki et al., 2015). La ausencia de
microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae es también usado como un
indicador de buenas prácticas de manufactura. Sin embargo, las especies de
Enterobacteriaceae están ampliamente distribuidos en el ambiente por lo que se espera que
estén presentes en productos agrícolas como parte de la microflora natural (Samish et al.,
1963).

2.1.3. Coliformes

Los coliformes son microorganismos Gram-negativos, anaerobios facultativos, no

esporulados (Kornacki et al., 2015) que fermentan lactosa con producción de ácido y gas
dentro de 48 horas de incubación a 35 ºC (Kornacki et al., 2015). Estos microorganismos se
encuentran en el medio ambiente, suelo, y tracto gastrointestinal de animales y humanos
(Baylis et al., 2011).

Los coliformes son usados como microorganismos indicadores en la industria alimentaria

para validar la efectividad de procedimientos de limpieza y saneamiento (Ginny Moore,
2003). Dentro de los coliformes se incluyen especies que no son necesariamente asociadas
con la presencia de contaminación fecal. Específicamente, los coliformes de tipo fecales son
asociados con contaminación fecal y a diferencia de los coliformes, estos fermentan lactosa
a una temperatura de 45 ºC (Feng et al., 2018).

5
2.1.4. Escherichia coli

E. coli es una bacteria Gram-negativa, anaerobia facultativa y posee forma de bastón. Este
microorganismo está generalmente presente el tracto gastrointestinal de animales y humanos
(Bell & Kyriakides, 2009; Odonkor & Ampofo, 2013). Por ello, E. coli es usado como un
indicador de contaminación fecal en la industria de alimentos y agua (Feng et al., 2018).
Algunas especies como E. coli enterohemorrágica O157:H7, E. coli verotoxigénica, E. coli
enteropatogénica son patógenos alimentarios. Sin embargo, las pruebas para la evaluación
de E. coli como un indicador organismo evalúan solo E. coli genérico y no un patógeno
específico.

En el caso de productos crudos, E. coli es considerado como el indicador de contaminación

fecal más valido. Aunque debido a la naturaleza ubicua de E. coli en el medio ambiente, éste
también puede ser encontrado en agua de riego, suelo, y bio aerosoles (Brandl, 2006; Van
Elsas et al., 2011), siendo no necesariamente indicadores directos de contaminación fecal.
E. coli es un buen indicador de la eficacia de los procedimientos de limpieza y desinfección
y puede ser controlado en el campo mediante el cumplimiento de las Buenas Prácticas de
Agricultura. Además, los programas de limpieza y desinfección deberías ser suficientes para
evitar el crecimiento y establecimiento de E. coli en las líneas de procesamiento (United
Fresh Produce Association, 2018).

2.2. Uso de microorganismos indicadores en la industria de productos agrícolas

frescos

En un ambiente de procesamiento de productos agrícolas frescos se sugiere monitorear

varios microorganismos indicadores (Heredia et al., 2016). Los productos frescos abarcan
una amplia gama de diferentes propiedades biológicas (microbiota natural), propiedades
químicas (ej., pH y Aw) (Moberg & Kornacki, 2015) y las propiedades físicas de frutas y
verduras, que afectan la forma en que los microrganismos se transfieren a las superficies de
los equipos e instalaciones (Heredia et al., 2016). Otro factor que influye en la presencia de
un microorganismo indicador en las instalaciones de empaque de productos es la operación
unitaria en la que se toma la muestra (Kornacki et al., 2015).

6
En los productos frescos, las altas poblaciones de estos microorganismos no significan baja
calidad del producto. Sin embargo, después de pasos como el lavado o la desinfección, que
se llevan a cabo con el fin de disminuir las cargas microbianas, se deben detectar poblaciones
más bajas de microorganismos indicadores (Kornacki et al., 2015).
En plantas de procesamiento de alimentos, con fines de monitoreo microbiológico, el área
de proceso/empaque se divide en 4 zonas basados en el nivel de riesgo de contaminación
(International Commission on Microbiological Specifications for Foods Staff (ICMSF),
2002):

- Zona 1 - Superficies en contacto con alimentos. Superficies que están en contacto

directo con los productos alimenticios. Algunos ejemplos son los rodillos, cepillos
de lavado, cintas transportadoras y las mesas de clasificación.
- Zona 2 - Superficies que no entran en contacto con alimentos. Superficies adyacentes
a superficies en contacto con alimentos. Algunos ejemplos son la estructura del
equipo, el exterior de los transportadores y los paneles de control.
- Zona 3 - Superficies que no entran en contacto con alimentos. Superficies en el
entorno de procesamiento. Ejemplos: paredes, pisos, techos, puertas, paletas y
montacargas.
- Zona 4 - Superficies que no entran en contacto con alimentos. Áreas alejadas del
procesamiento de producto. Algunos ejemplos son los baños, las salas de descanso,
los vestuarios y las áreas de oficina.

El proceso de zonificación es importante como concepto para una gestión eficaz del riesgo,
ya que mitiga la potencial entrada de patógenos transitorios externos al entorno de
procesamiento, y asegura que la zona 1 (área de mayor nivel de riesgo de contaminación del
producto final) no se convierta en un punto de refugio para patógenos transmitidos por los
alimentos (U.S Food and Drug Administration, 2017a). Además, la zonificación higiénica
reduce la probabilidad de contaminación cruzada entre zonas y facilita la selección de sitios
de muestreo.

Se recomienda realizar las pruebas de microorganismos indicadores en superficies en

contacto con alimentos (zona 1) porque los resultados de dichas pruebas proporcionan
información valiosa sobre el estado microbiológico general de la superficie (Moberg &
7
Kornacki, 2015). La prueba directa de un patógeno en la zona 1 puede ser engañosa debido
a una mala interpretación de un resultado negativo (Moberg & Kornacki, 2015). Además, la
determinación directa de patógenos implica más tiempo y costo en comparación con el
organismo indicador (Baylis et al., 2011; G. Moore & Griffith, 2002). Sin embargo,
tambiénes importante realizar pruebas de microorganismos indicadores en superficies que
no entran en contacto con los alimentos, ya que la contaminación cruzada puede ocurrir
indirectamente de las zonas 2, 3 y 4 a la zona 1. Diferentes causas como condensación,
aerosoles, ventilación, y el movimiento del producto puede transferir contaminación entre
zonas durante la producción (Estrada et al., 2020; Moberg & Kornacki, 2015).

2.3. Límites microbiológicos aceptables de microorganismos indicadores según

normas nacionales e internacionales en productos agrícolas frescos

Actualmente no existen normativas o regulaciones que establezcan límites microbiológicos

aceptables en superficies de contacto con alimentos específicamente para el sector de
productos agrícolas frescos. En la Tabla 1, se realizó una recopilación de normativas
nacionales e internacionales vigentes respecto a limites microbiológicos aceptables de
microorganismos indicadores. Sin embargo, todas las normas están enfocadas en industrias
dedicadas al sector de alimentos listos para el consumo humano que generalmente han
pasado por un proceso de tratamiento térmico para la reducción de microorganismos como
cocción o pasteurización.

2.4. Métodos tradicionales para la evaluación de limpieza y desinfección de superficies

Los métodos tradicionales para evaluar los procedimientos de limpieza y desinfección en

superficies proveen información cuantitativa (cantidad de carga microbiana) o cualitativa
(presencia/ausencia) de los microorganismos presentes en las superficies (Davidson et al.,
1999). Estos métodos están basados en el cultivo de microorganismos indicadores en medios
de cultivo requiriendo periodos de incubación de entre 18 a 48 horas para obtener resultados
(Ginny Moore & Griffith, 2002). Los métodos tradicionales incluyen, hisopados de
superficies, métodos de contacto con agar, y plaqueado de agar directo en superficies
(Davidson, 2001).

8
Tabla 1. Límites microbiológicos de microorganismos indicadores aceptables según normas nacionales e internacionales

Tipo de Aerobios Enterobacter

Norma Tipo de industria Coliformes E. coli
superficie mesófilos totales iaceae

Superficies <25 UFC/superficie (100 cm2)

Alimentos y bebidas NA* NA NA
RM 461-2007 inertes irregulares (1.4 Log UFC/100 cm2)
destinadas para el
(Perú) (2007)
consumo humano Superficies <100 UFC/100cm2 (2 Log
NA NA NA
inertes regulares UFC/100 cm2)

Alimentos que se
NOM-093- <400 UFC/
ofrecen en 2
<200 UFC/ cm2 (4.3 Log
SSA1-1994 NA cm (4.6 Log NA NA
establecimientos fijos UFC/100 cm2
(México) (1994) UFC/100 cm2)
(ej. Comedores)
Alimentos que se
BC Centre for <5 UFC/ cm2
ofrecen en
Disease Control– NA (2.7 Log/100 NA NA NA
establecimientos fijos
(Canadá) (2010) cm2)
(ej. Comedores)
*NA: Información no disponible
«Continuación»

Tipo de Aerobios Enterobacteri

Norma Tipo de industria Coliformes E. coli
superficie mesófilos totales aceae

Public Health Servicios de

<10/cm2 (3 Log
services (EE. comedores de NA NA NA NA
UFC/100 cm2)
UU) (1984) alimentos

*NA: Información no disponible

2.5 Métodos tradicionales para la evaluación de limpieza y desinfección de superficies

Los métodos tradicionales para evaluar los procedimientos de limpieza y desinfección en

superficies proveen información cuantitativa (cantidad de carga microbiana) o cualitativa
(presencia/ausencia) de los microorganismos presentes en las superficies (Davidson et al.,
1999). Estos métodos están basados en el cultivo de microorganismos indicadores en medios
de cultivo requiriendo periodos de incubación de entre 18 a 48 horas para obtener resultados
(Ginny Moore & Griffith, 2002). Los métodos tradicionales incluyen, hisopados de
superficies, métodos de contacto con agar, y plaqueado de agar directo en superficies
(Davidson, 2001).

El hisopado de superficies convencional implica tomar muestras sobre un área de superficie

designada utilizando esponjas o hisopos estériles, seguido del cultivo de los
microorganismos objetivos en los medios de cultivo.

Los métodos de contacto con agar consisten en presionar un medio de cultivo de agar estéril
contra el área de superficie a muestrear y luego incubar [ej. placas de contacto RODAC
(Replicate Organism Direct Agar Contact) y placas de deslizamiento (dip-slides)]. El
plaqueado de agar directo en superficies consiste en verter agar estéril en la superficie a
muestrear, dejar solidificar el medio protegido por una cubierta estéril, y luego incubar
(Davidson, 2001).

2.5.1 Placas Petrifilm

Las placas Petrifilm constituyen una forma de método tradicional de cultivo de

microorganismos indicadores. Estas placas son sistemas de medios de cultivo listos para usar
que constan de dos películas de plástico recubiertos con nutrientes de métodos estándar
basados en el microorganismo a cultivar, un agente gelificante soluble en agua fría y un tinte
indicador que facilita el recuento de colonias (Ryser & Schuman, 2015).

Una muestra diluida obtenida después de muestrear una superficie se inocula en la película
de fondo, mientras que la película superior se presiona contra la inferior para distribuir

11
uniformemente la muestra sobre un área de crecimiento de aproximadamente 20 cm2 (Ginny
Moore, 2003). A diferencia de los métodos de agar convencionales, no se requiere
preparación de medios, y se necesita menos espacio de incubadora y almacenamiento (3M
Food Safety, 2020).

2.6 Métodos rápidos para la evaluación de limpieza y desinfección de superficies

Los métodos microbiológicos convencionales resultan tediosos y requieren mucho tiempo;

por lo tanto, surgieron métodos de prueba rápidos para reducir el lapso de tiempo entre el
muestreo de superficie y obtención de resultados (Ginny Moore, 2003).

2.6.1 Prueba de Bioluminiscencia

Las pruebas rápidas de ATP se basan en la detección de una molécula llamada adenosín
trifosfato (ATP). El ATP forma parte de todas las células vivas (como bacterias y residuos
de alimentos), siendo un elemento fundamental componente en reacciones bioquímicas para
la síntesis de material celular (Betts & Blackburn, 2009).

Esta prueba rápida bioluminiscente de ATP cuantifica la emisión de luz después de que el
ATP presente en una superficie reacciona con un complejo enzima-sustrato llamado
luciferina-luciferasa (Griffiths, 1997). La producción de luz se mide en unidades relativas de
luz (RLU), y esta prueba requiere un dispositivo adicional, un luminómetro, para leer los
resultados (Ginny Moore & Griffith, 2002).

Actualmente, las pruebas de ATP son ampliamente utilizadas dentro de la industria

alimentaria, ya que se consideran una herramienta rápida para el monitoreo de la higiene y
evaluar la eficacia de los procedimientos de limpieza y saneamiento in-situ, obteniendo
resultados en menos de cinco minutos (Ginny Moore, 2003). Además, las pruebas de ATP
pueden detectar alérgenos alimentarios, que de otro modo no podrían detectarse con los
métodos microbiológicos tradicionales (Griffith, 2016).

La mayoría de las pruebas de ATP disponibles en la industria contienen como parte de la

formulación el enzima-sustrato luciferina/luciferasa, iones de magnesio, amortiguadores,

12
sustratos, estabilizadores y extractantes (utilizados para extraer ATP de células vivas)
(Griffith, 2005).

Las pruebas de ATP ocurren regularmente después de la limpieza y antes de los

procedimientos de saneamiento, para asegurar de que la superficie esté limpia antes de
aplicar los desinfectantes. Esto solo es factible debido a la rapidez del ensayo en la
evaluación de resultados en tiempo real para tomar medidas correctivas (Griffith, 2016).

2.7 Rutas de contaminación microbiana en la industria de empaque de manzanas

frescas

La contaminación de los productos agrícolas y superficies puede ocurrir debido a la

contaminación en cualquier punto de la cadena de suministros. Es decir, puede ocurrir
durante la precosecha, cosecha o post- cosecha.
Durante la precosecha y cosecha, ejemplos de fuentes de contaminación incluyen agua de
irrigación, suelo, animales silvestres y domésticos, fertilizantes, bio aerosoles, herramientas
y envases de cosechas, y manipulación del hombre (Alegbeleye et al., 2018; Brandl, 2006;
Brooks & Gerba, 2014).

Antes de la cosecha, la presencia y poblaciones de diferentes microorganismos como

bacterias, levaduras, mohos, parásitos y virus se ven afectados por el tipo de cultivo,
prácticas agrícolas, ubicación geográfica y condiciones climáticas (Beuchat, 2002; Critzer
& Doyle, 2010). El tipo del cultivo influye en la ecología de las bacterias debido a la
morfología única de la superficie del producto, interacciones del microbiota vegetal,
composición interna, presencia de antimicrobianos naturales y el contenido de nutrientes de
los diferentes productos (Beuchat, 2002; Critzer & Doyle, 2010).

En el caso específico de las manzanas, la morfología de la superficie de la manzana juega un

papel clave en el refugio y crecimiento de patógenos. Estudios de adhesión de bacterias como
Listeria innocua y E. coli O157: H7 en la superficie de manzanas mostraron que las áreas
del tallo y el cáliz son los sitios más probables de refugio de bacterias (Burnett et al., 2000;

13
Pietrysiak & Ganjyal, 2018), probablemente debido a la protección física proporcionada en
estas regiones (Burnett et al., 2000).

En las superficies de las manzanas, L. innocua se adhiere a microestructuras como

microfisuras, lenticelas, y tricomas (Pietrysiak & Ganjyal, 2018). Las microestructuras
influyen en la adhesión de Listeria actuando como nichos de refugio a través del
atrapamiento físico causado por la motilidad flagelar de Listeria (Pietrysiak & Ganjyal,
2018). Además, se ha reportado que E. coli se adhiere a la cutícula de cera y lenticelas
(Burnett et al., 2000). Internamente, se encontró que E. coli se adhiere al tubo floral, semillas,
pericarpio cartilaginoso y tricomas internos mediante infiltración. La internalización de
patógenos en las manzanas puede ocurrir por la acción capilar del agua desde el tallo o cáliz
hacia el núcleo (Burnett et al., 2000).

En la post-cosecha, las posibles fuentes de contaminación incluyen el agua de lavado de los

productos (Lynch et al., 2009), contaminación cruzada por superficies de equipos,
contenedores, montacargas y manipuladores en todo el proceso de empaque,
almacenamiento y distribución (Beuchat, 2002; Harris et al., 2003).

En las plantas de empaque, el entorno de procesamiento se compone de muchos factores que

pueden ser fuentes o vectores potenciales de contaminación, incluyendo: áreas que acumulan
agua, flujo de producto, flujo de aire, trabajadores o equipos que atraviesan áreas de
productos crudos y procesados/empacados; diseño de equipos; el programa de
mantenimiento y reparación de instalaciones/equipos, etc. (United Fresh Produce
Association, 2018).

14
 III. METODOLOGÍA

3.1. Lugar de Ejecución

El presente trabajo se llevó a cabo en cinco plantas de empaque de manzanas ubicadas en el

valle Columbia, estado de Washington, Estados Unidos. El periodo de ejecución fue desde
setiembre 2018 hasta julio 2019.

3.2. Superficies muestreadas

Se muestrearon superficies de contacto con alimentos pertenecientes a los equipos

empleados en el proceso de empaque de manzanas, luego de procesos de limpieza y
desinfección.

3.3. Materiales, Equipos y Reactivos

3.3.1. Materiales
- Placas petrifilm Aerobios mesófilos totales (3MTM, Estados Unidos)
- Placas petrifilm Enterobacteriaceae (3MTM, Estados Unidos)
- Placas petrifilm colifomes/ E. coli (3MTM, Estados Unidos)
- Muestrador de esponja estéril conteniendo 10 ml de caldo neutralizante Dey/Engley
EZ- Reach (World Bioproducts, Estados Unidos)
- Mango de extensión adaptador para toma de muestras con esponja (World
Bioproducts, Estados Unidos)
- Pipeteador electrónico de 5 ml (3MTM, Estados Unidos)
- Pipetas descartables de 5 ml (3MTM, Estados Unidos)
- Guantes descartables de nitrilo libres de polvo (ThermoFisher, Estados Unidos)
- Caja cooler con ruedas para transporte de muestras (Igloo 52 QT, Estados Unidos)
- Materiales de escritorio: lapicero, plumón indeleble, regla
- Software estadístico JMP® Pro 12.2.0

3.3.2. Equipos
- Equipo de recuento de placas Petrifilm automatizado modelo 6499 (3MTM, Estados
Unidos)
- Incubadora microbiológica de aire forzado modelo 89511-430 (VWR International,
Estados Unidos)
- Cámara fotográfica Nikon D5600
- Laptop Lenovo yoga C940
- Impresora HP Color laser jet pro M281fdw
- Laminadora de papel Fellowes Saturn 3i 125

3.3.3. Guías/normativas
- Guía para el control de Listeria monocytogenes en alimentos listos para el consumo
(U.S Food and Drug Administration, 2017a)
- Guía de estrategias para el control de Listeria en plantas de empaque de frutos de
árbol (United Fresh Produce Association, 2018)

3.3.4. Reactivos
- Agua desionizada esterilizada
- Etanol al 70% (ThermoFisher, Estados Unidos) para desinfección de materiales
usados durante el muestreo

3.4. Métodos de Análisis

- Método AOAC 990.12 Recuento de aerobios mesófilos totales en alimentos
- Método AOAC 2003.01 Recuento de Enterobacteriaceae en alimentos seleccionados
- Método AOAC 991.14 Recuento de coliformes en alimentos
- Método AOAC 991.14 Recuento de Escherichia coli en alimentos

16
3.5. Metodología Experimental

3.5.1. Etapa 1: Reclutamiento de plantas de empaque de manzana

Se reclutaron plantas de empaque de manzana a través de la Washington Tree Fruit Research

Commission, entidad que desarrolla diversos proyectos de investigación con productores y
plantas de empaque de manzanas en el estado de Washington, EE. UU. Se explicó el proceso
de investigación a la gerencia de distintas plantas de empaque, de las cuales cinco aceptaron
colaborar con el proyecto. Las plantas de empaque seleccionadas cuentan con un plan de
inocuidad alimentaria, como lo estipula la regulación “Acto de Modernización de Seguridad
Alimentaria” (FSMA). Asimismo, se acordó mantener la confidencialidad sobre la identidad
de las plantas de empaque de manzanas.

3.5.2. Etapa 2: Visita a plantas de empaque y descripción del proceso de empaque de

manzanas

Se visitaron las plantas de empaque con el fin de observar el proceso de empaque de

manzanas y se desarrolló el diagrama de flujo y descripción de las distintas operaciones
unitarias en cada planta de empaque.

En el proceso de empaque de manzanas se identificaron siete operaciones unitarias. Además,

en base a la presencia o ausencia de agua durante la operación, se establecieron áreas
húmedas y secas. Las cinco primeras operaciones unitarias se llevan a cabo en el área
húmeda, mientras que las dos últimas en el área seca.

A continuación, en la Figura 1 se describe el diagrama de flujo del proceso de empaque de

manzanas. Además, se realizó la descripción de cada operación unitaria como se observa en
las figuras 2-8.

17
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de empaque de manzanas
a. Lavado
Los contenedores de manzana son vertidos en un tanque de lavado que contiene agua
recirculada con desinfectantes como cloro (50-200 ppm) o ácido peroxiacético (máx. nivel
permisible 80 ppm) para mantener la calidad del agua. El objetivo de este paso es remover
hojas, suciedad y materia orgánica de las manzanas, además del primer descarte de fruta
podrida manualmente.

Figura 2. Operación unitaria de lavado

b. Lavado/enjuague/desinfección
La segunda operación unitaria se lleva a cabo en camas de cepillos en el que, jabón, agua, y
desinfectantes como cloro o ácido peroxiacético son aplicados mediante aplicadores de
spray. El objetivo de este paso es remover residuos restantes de la fruta y reducir la carga
microbiana.

Figura 3. Operación unitaria de lavado/enjuague/desinfección

19
c. Primer secado
En esta operación se realiza un primer secado por dos a tres minutos mediante el uso de
ventiladores con el fin de preparar a las manzanas para el encerado.

Figura 4. Operación unitaria de secado por ventiladores

d. Encerado
Se aplica cera de grado alimentario como carnauba o shellac mediante aplicadores de spray.
Generalmente se emplea 0.1% de cera (L cera/ kg fruta). La cera se utiliza para retener
humedad de la manzana, y mejorar la apariencia al incrementar el brillo de las manzanas,
junto con el uso de cepillos de pulido.

Figura 5. Operación unitaria de encerado

20
e. Segundo secado
El segundo secado se realiza en un secador de túnel que generalmente opera a una
temperatura entre 30-50 oC por aproximadamente dos minutos, dependiendo de la variedad
de manzana. Esta operación se considera como el punto de transferencia entre el área húmeda
y área seca.

Figura 6. Operación unitaria de secado por túnel

f. Clasificación
En esta operación las manzanas son clasificadas según su tamaño, grado, desordenes internos
o externos, utilizando un equipo automático de imagen óptico e infrarrojo. Asimismo, los
stickers de identificación de lote son colocados en cada manzana de forma automatizada con
el fin de asegurar la trazabilidad.

Figura 7. Operación unitaria de clasificación

21
g. Empacado
Finalmente, las manzanas son empacadas de acuerdo con el calibre y tamaño, en cajas o
bolsas para distribución. Este paso se realiza manualmente o con máquinas embolsadoras
dependiendo de la presentación.

Figura 8. Operación unitaria de empacado

3.5.3. Etapa 3: Selección de superficies a muestrear

Un promedio de 27 a 50 superficies de contacto con alimentos se seleccionó en cada planta

de empaque. La selección de las superficies de muestreo se realizó en base al número de
equipos pertenecientes a cada operación unitaria, tipo de material de la superficie,
configuración de diseño y ubicación de equipos en cada planta de empaque, requerimientos
y necesidades de la planta de empaque y recomendaciones de la guía para la industria
“Control de Listeria monocytogenes en alimentos listos para el consumo” (U.S Food and
Drug Administration, 2017) y la guía de estrategias para el control de Listeria en plantas de
empaque de frutos de árbol (United Fresh Produce Association, 2018). De acuerdo con esto,
como se observa en la Tabla 2 y Anexo 1, se seleccionó un mayor número de superficies a
muestrear en la operación unitaria de clasificación. Esto debido a que, en todas las plantas
de empaque de manzanas, esta operación unitaria consta de una mayor cantidad de equipos
y diversos tipos de materiales de superficies que están en contacto con las manzanas.

22
Las superficies a muestrear se fotografiaron y describieron a detalle con el fin de asegurar
consistencia durante todos los muestreos. En la Tabla 3 se detallan ejemplos de superficies
de contacto con alimentos muestreados en las distintas plantas de empaque de manzana.

Tabla 2. Número y tipos de superficies de contacto con alimentos seleccionadas

en cada operación unitaria del proceso de empaque de manzanas

Operación unitaria Número de Superficie de contacto con

superficies alimentos
1. Lavado 70 Tanque de lavado, Rodillos de PVC

2. Lavado/enjuague/desinfección 79 Cepillos, divisores

3.Primer secado (Ventiladores) 75 Cepillos, divisores
4. Encerado 50 Cepillos de pulido
5. Segundo secado (Secador de túnel) 85 Rodillos de secador, puntos de
transferencia
6. Clasificación 302 Cintas transportadoras lisas y
entrelazadas, rodillos de cerdas,
rieles, cintas de teflón, puntos de
transferencia de teflón y plástico,
contenedores de clasificación, etc.
7. Empacado 80 Mesas de empaque, Cintas
transportadoras
Total de superficies muestreadas 741

23
 Tabla 3. Ejemplos de superficies de contacto con alimentos muestreados en las
plantas de empaque de manzana

1. Cepillos 2. Cepillos de pulido

3. Rodillos de cerdas 4. Rodillos de cloruro de polivinilo (PVC)

5. Rodillos de secador de túnel 6. Cepillos de clasificación

«Continuación»

7. Cintas transportadoras entrelazadas 8. Cintas transportadoras lisas

9. Rieles guía de plástico 10. Contenedores de clasificación

11. Tanque de lavado 12. Divisores

«Continuación»

13. Cintas o puntos de transferencia de teflón

14. Solapas de plástico y puntos de transferencia

3.5.4. Etapa 4: Ejecución del muestreo

La recolección de muestras se realizó durante la temporada de empaque 2018 (setiembre

2018 – julio 2019) luego de procedimientos de limpieza y desinfección. Adicionalmente,
dado que las manzanas son almacenadas hasta por 12 meses en atmósfera controlada (0-2oC;
2% O2; 1% CO2) luego de ser cosechadas, cada planta de empaque fue visitada cuatro veces
al año con el fin de obtener información que represente superficies que estuvieron en
contacto con manzanas almacenadas a diferentes tiempos de almacenamiento y que fueron
empacadas en distintas estaciones del año. En el Anexo 1 se describe el número de muestras
evaluadas según el tiempo de almacenamiento de manzanas y estación del año, a través de
cada operación unitaria.

El área de superficie muestreada fue de 10 cm x 10 cm (100 cm 2), y se utilizó una esponja

EZ- Reach conteniendo 10 ml de caldo neutralizante Dey/Engley previamente rotulada. En
el caso de las superficies no lisas o regulares como rodillos o puntos de transferencia, se
realizó una estimación aproximada del área de muestreo. El muestreo se realizó desde el área
húmeda hacia el área seca con el fin de evitar cualquier riesgo de contaminación cruzada.
Todas las muestras recolectadas fueron transportadas en un envase refrigerado con el fin de
mantener la cadena de frío de 4-7 ºC, y analizadas en el laboratorio de inocuidad de alimentos
de Washington State University.

3.5.5. Etapa 5: Recuento de microorganismos indicadores

En la Figura 9, se describe la metodología empleada para el recuento de microorganismos

indicadores. A cada esponja que contenía 10 ml de caldo neutralizante se le añadió dos ml
de agua desionizada esterilizada con el fin de proveer suficiente cantidad de siembra para
todos los microorganismos objetivos. Debido a que el muestreo de superficies se realizó
luego de la limpieza y desinfección en donde se esperaba bajos recuentos de
microorganismos, y por el número elevado de muestras evaluadas, no se realizaron
posteriores diluciones. Previos estudios reportan metodologías de recuento similar sin
emplear diluciones (Cosby et al., 2008; Wang et al., 2021; Williamson et al., 2018; Xiong,
2017). Se sembró 1 ml en cada placa Petrifilm 3MTM para el recuento de aerobios mesófilos

27
totales, Enterobacteriaceae, Coliformes, y E. coli. Las placas Petrifilm para el recuento de
aerobios mesófilos totales se incubaron a 35 oC por 24 horas, mientras que las placas
Petrifilm para el recuento de Enterobacteriaceae, coliformes, y E. coli se incubaron a 35 oC
por 48 horas.

El recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) se realizó con un equipo

automatizado para el recuento de colonias 3MTM. Todos los valores de recuento se
expresaron como UFC/100 cm2. Cuando el valor de número de colonias era muy numeroso
de contar se empleó el valor estándar 999, según lo especificado por el equipo de recuento
de placas 3M y metodologías reportadas en previos estudios (Elmoslemany et al., 2010;
Nygaard & Charnock, 2018).

Figura 9. Esquema de protocolo de procesamiento de muestras para el recuento

de microorganismos indicadores

28
3.6. Análisis Estadístico

Para el análisis estadístico se utilizó el software JMP® Pro 12.2.0 (SAS Institute Inc., Cary,
NC, USA). Los valores de recuento de microorganismos indicadores se normalizaron usando
Log 10. Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA), y se realizó una comparación
múltiple de medias de poblaciones de microorganismos indicadores a través de cada
operación unitaria y tipo de superficie empleando un análisis de varianzas y prueba de Tukey
con un nivel de significancia α=0.05. Para determinar los límites microbiológicos de cada
microorganismo indicador se determinaron los límites superiores de control (LSC)
(promedio + 3σ) en base al total de muestras (n=741).

29
 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Recuentos de microorganismos indicadores

En base a las visitas realizadas a las cinco plantas de empaque de manzanas, los rangos de
valores de recuentos microbiológicos de aerobios mesófilos totales, Enterobacteriaceae,
Coliformes y E. coli determinados luego de procedimientos de limpieza y desinfección se
presentan en la Tabla 4 según cada operación unitaria identificada en el proceso de empaque
de manzanas. En promedio, se establecieron los siguientes rangos de límites
microbiológicos (Promedio ± desviación estándar) (Log UFC/100 cm2) en superficies de
contacto con alimentos de equipos utilizados en el empaque de manzanas: Aerobios
mesófilos totales (2.7 ± 1.2 - 3.3 ± 0.9), Enterobacteriaceae (1.0 ± 1.0 - 1.7 ± 1.5),
coliformes (0.6 ± 0.9 - 1.4 ± 1.3), y E. coli (0.2 ± 0.4 - 0.3 ± 0.6). Estos valores variaron de
acuerdo con cada una de las operaciones unitarias del proceso de empaque de manzanas.

Como se observa en la Tabla 4, para todas las operaciones unitarias las poblaciones mayores
fueron obtenidas para el microorganismo indicador aerobios mesófilos totales, seguidos por,
en orden de tamaño de población, Enterobacteriaceae, coliformes y E. coli. Asimismo, se
identificó qué operaciones unitarias presentaron valores estadísticamente diferentes según
cada tipo de organismo indicador.

Otro de los objetivos fue evaluar los recuentos de los microorganismos indicadores según el
tipo de superficie. En la Tabla 5, se reportaron dichos valores y al igual que los resultados
de cada operación unitaria, cada tipo de superficie presentó recuentos estadísticamente
diferentes según el tipo de microorganismo indicador. Por lo tanto, no se determinó una
superficie específica que presente valores significativamente mayores para los cuatro
microorganismos indicadores.
Tabla 4. Población promedio de microorganismos indicadores (Promedio ± desviación estándar) (Log UFC/100 cm2) en cada
operación unitaria del proceso de empaque de manzanas

Promedio ± desviación estándar (Log UFC/100 cm2)

A
Operación unitaria n Aerobios Enterobacteriaceae Coliformes E. coli
mesófilos totales
Lavado 70 2.7 ± 1.2 (b)B 1.7 ± 1.5 (a) 1.4 ± 1.3 (ab) 0.2 ± 0.5 (a)
Lavado/enjuague/desinfección 79 2.8 ± 1.2 (ab) 1.6 ± 1.3 (a) 1.4 ± 1.3 (a) 0.2 ± 0.4 (a)
Primer secado (Ventiladores) 75 2.9 ± 1.1 (ab) 1.3 ± 1.2 (ab) 0.9 ± 1.1 (bcd) 0.3 ± 0.5 (a)
Encerado 50 3.3 ± 0.9 (a) 1.3 ± 1.3 (ab) 1.0 ± 1.1 (abcd) 0.2 ± 0.4 (a)
Segundo secado (Secador de 85 3.2 ± 0.8 (a) 1.5 ± 1.2 (a) 1.1 ± 1.1 (abc) 0.2 ± 0.4 (a)
túnel)

Clasificación 302 3.0 ± 0.8 (ab) 1.0 ± 1.0 (b) 0.6 ± 0.9 (d) 0.2 ± 0.4 (a)

Empacado 80 3.0 ± 0.7 (ab) 1.0 ± 1.0 (b) 0.8 ± 0.9 (cd) 0.3 ± 0.6 (a)
A
Número de muestras (n total = 741)
B
Los valores dentro de cada columna que no están seguidas por la misma letra son significativamente diferentes (p ≤ 0.05)
Tabla 5. Población promedio de microorganismos indicadores (Log UFC/100 cm2) por superficie en el proceso de empaque de manzanas

A
Superficie de contacto con alimentos n Aerobios mesófilos Enterobacteriaceae Coliformes E. coli
totales
Rodillos de cerdas 40 3.3 (a) B 1.7 (ab) 1.4 (abc) 0.3 (a)
Cintas y puntos de transferencia de teflón 101 3.2 (a) 1.3 (abc) 0.8 (bcd) 0.2 (a)
Solapas y puntos de transferencia de plástico 86 3.2 (a) 1.2 (abc) 0.9 (abcd) 0.3 (a)
Mesa/contenedor de empaque 16 3.1 (ab) 0.8 (abc) 0.8 (abcd) 0.1 (a)
Cinta transportadora entrelazada 63 3.1 (ab) 0.8 (c) 0.6 (d) 0.1 (a)
Rodillos de secador de túnel 23 3.1 (ab) 1.4 (abc) 1.1 (abcd) 0.2 (a)
Tazas de clasificación 31 3.1 (ab) 0.8 (abc) 0.7 (abcd) 0.2 (a)
Cepillos de lavado 59 3.0 (ab) 1.7 (a) 1.5 (a) 0.2 (a)
Bordes laterales de equipos 34 2.9 (ab) 0.8 (bc) 0.7 (abcd) 0.2 (a)
Divisores 24 2.9 (ab) 0.8 (abc) 0.6 (bcd) 0.1 (a)
A
Número de muestras (n total = 741)
B
Los valores dentro de cada columna que no están seguidas por la misma letra son significativamente diferentes (p ≤ 0.05)
«Continuación»

A
Superficie de contacto con alimentos n Aerobios mesófilos Enterobacteriaceae Coliformes E. coli
totales

Cepillos de pulido 23 2.9 (ab) 1.5 (abc) 0.9 (abcd) 0.1 (a)
Cinta transportadora lisa 45 2.9 (ab) 0.8 (bc) 0.6 (cd) 0.2 (a)
Cepillos de clasificación 48 2.9 (ab) 0.9 (abc) 0.6 (d) 0.3 (a)
Tanque de lavado 27 2.7 (ab) 1.8 (ab) 1.6 (ab) 0.2 (a)
Cepillos bajo ventiladores 45 2.7 (ab) 1.3 (abc) 0.9 (abcd) 0.2 (a)
Rieles guía de plástico 19 2.6 (ab) 0.7 (abc) 0.6 (abcd) 0.1 (a)
Rodillos de clasificación 41 2.5 (ab) 1.1 (abc) 0.7 (bcd) 0.2 (a)
Bandas de tracción 16 2.4 (ab) 1.4 (abc) 1.2 (abcd) 0.2 (a)
A
Número de muestras (n total = 741)
B
Los valores dentro de cada columna que no están seguidas por la misma letra son significativamente diferentes (p ≤ 0.05)
4.1.1 Aerobios mesófilos totales

Las poblaciones de aerobios mesófilos totales reportadas en promedio de las cinco plantas
de empaque de manzanas evaluadas variaron entre 2.7 ± 1.2 - 3.3 ± 0.9 Log UFC/100 cm2
luego de procesos de limpieza y desinfección. En previos estudios, donde se evaluaron
superficies de contacto con alimentos luego de procedimientos de lavado y desinfección, se
encontraron recuentos similares. Por ejemplo, en una planta de empaque de arándanos el
valor promedio de aerobios mesófilos totales fue de 3.8 Log UFC/100 cm 2 (Gazula et al.,
2019). Asimismo, en una planta procesadora de zanahorias y lechugas se obtuvieron
poblaciones promedio de aerobios mesófilos totales de 3.4 a 3.5 Log UFC/100 cm2 (Lehto
et al., 2011). En contraste, en una plata de empaque de duraznos frescos, se determinó un
valor mayor de 4.3 Log UFC/100 cm2 (Wang et al., 2021). La diferencia en los valores
reportados en este estudio puede ser explicado por factores específicos asociados al tipo de
producto. Específicamente, a diferencia de los duraznos, las manzanas tienen una superficie
semilisa, con una capa protectora de cera natural y por lo tanto es menos propensa a los
daños mecánicos durante la cosecha.

Las operaciones unitarias que presentaron valores estadísticamente diferentes fueron la

operación de lavado (menor valor) y las operaciones de encerado y secado por túnel
(mayores valores) (Tabla 4). Según el flujo de proceso de empaque de manzanas (Figura 1),
en la operación de lavado las manzanas ingresan a un tanque de acero inoxidable que
contiene desinfectantes como cloro o ácido peroxiacético. Estos desinfectantes han sido
previamente reportados como efectivos para eliminar la contaminación cruzada entre
manzanas y agua de lavado (Pietrysiak et al., 2019). Según las visitas realizadas a las plantas
de empaque, la concentración de estos desinfectantes es monitoreada constantemente
mediante sistemas automatizados de inyección de desinfectantes o kits de muestreo.

En contraste, la operación de encerado y secado por túnel no reciben una introducción

constante de desinfectantes y poseen superficies más complicadas de limpiar y desinfectar.
Por ejemplo, los cepillos de pulido acumulan cera entre las cerdas de los cepillos. Se ha
demostrado que la cera puede causar atrapamiento de microorganismos y humedad, creando
un microambiente que causa las condiciones favorables para el crecimiento de
microorganismos como Listeria monocytogenes (Glass et al., 2015). Sin embargo, en otros

34
estudios se ha reportado la actividad antibacteriana de las ceras usadas en el empaque de
manzanas contra L. monocytogenes (Macarisin et al., 2019), E. coli O157: H7 (Kenney &
Beuchat, 2002) y Salmonella Muenchen (Kenney & Beuchat, 2002), posiblemente debido a
uno de los componentes de la cera comercial: alcohol isopropílico o alcohol etílico
(Macarisin et al., 2019). Similarmente, en el secador por túnel, los rodillos están forrados
con material de teflón, en los que se observó bordes desgastados y hendiduras, que facilitan
la acumulación de residuos y posiblemente niches para el crecimiento de microorganismos.

4.1.2 Enterobacteriaceae

Las poblaciones de Enterobacteriaceae variaron entre 1.0 ± 1.0 - 1.7 ± 1.5 Log UFC/100
cm2 a lo largo del proceso de empaque de manzanas. Previos estudios sobre
Enterobacteriaceae en superficies de contacto con alimentos en otras plantas de
procesamiento de alimentos obtuvieron poblaciones mayores de entre 3.0 y 3.3 Log
UFC/100 cm2 (Lehto et al., 2011) y 2.1 y 2.5 Log UFC/100 cm2 (Gómez et al., 2012) en
plantas de procesamientos de carnes y vegetales, respectivamente. Estas diferencias de
resultados se explican por las condiciones de crecimiento, cosecha y manipulación de estos
productos, que, a diferencia de las frutas de árbol como manzanas, son comúnmente
asociados con contaminación fecal y de suelo.

Respecto a los recuentos microbiológicos en base a cada operación unitaria. las operaciones
unitarias de clasificación y empacado (área seca de la planta de empaque) presentaron
valores estadísticamente significativamente menores a las operaciones unitarias de lavado.
Esto se atribuyó a la eliminación de posibles fuentes de Enterobacteriaceae que vienen en
la fruta desde el campo, y que son parte del microbiota regular de las manzanas (Wassermann
et al., 2019), en el área húmeda de lavado y desinfección. Por lo tanto, hay un menor arrastre
de estos microorganismos hacia el área seca de la planta de empaque. Las especies de
Enterobacteriaceae son bacterias que son fácilmente inactivadas con el uso de desinfectantes
(Kornacki et al., 2015).

35
De igual forma, los tipos de superficies que presentaron mayores recuentos de
Enterobacteriaceae fueron los cepillos de lavado, en comparación con las superficies
pertenecientes a las operaciones de clasificación y empacado como cintas transportadoras.

4.1.3 Coliformes

Los valores de coliformes que se obtuvieron variaron entre 0.6 ± 0.9 - 1.4 ± 1.3 Log UFC/100
cm2. En un estudio en plantas de empaque de pimientos, se reportó un valor de coliformes
similar de 0.6 ± 0.2 Log UFC/100 cm2 en superficies como rodillos, cintas transportadoras
y contenedores para empaque (Soto-Beltrán et al., 2015). En contraste con los resultados
obtenidos, en dos estudios que evaluaron superficies de contacto con alimentos en sistemas
de clasificación automatizados de empaque de duraznos reportaron mayores recuentos de
Coliformes de 2.9 Log UFC/100 cm2 y 2.5 Log UFC/cm2, respectivamente (Wang et al.,
2021; Williamson et al., 2018). Según los autores, este valor fue esperado ya que representa
microbiota natural presente en los duraznos, que también fueron evaluados, además de las
diferencias físicas entre duraznos y manzanas previamente descrito.
Similar con los recuentos obtenidos de Enterobacteriaceae, se reportaron recuentos menores
de coliformes en el área seca (operaciones unitarias de clasificación y empacado), en
comparación con la operación de lavado.

4.1.4 Escherichia coli

Los valores de E. coli fueron bajos a través de todo el proceso de empaque entre 0.2 ± 0.4 -
0.3 ± 0.6 Log UFC/100 cm2 y no reportaron diferencias significativas tanto entre operaciones
unitarias como tipos de superficie. Similar a lo reportado en previos estudios donde se
evaluaron superficies en contacto con alimentos, la variabilidad de recuentos de E. coli fue
elevada. Parish (1998), detectó en una procesadora de naranjas niveles de E. coli (MPN/unit)
desde <0.3 a 5700 en diversos puntos de muestreo de la planta. Asimismo, Soto-Beltrán et
al., (2015), reportó niveles de contaminación de E. coli desde 0.3 – 2.6 log CFU/400cm2.
Tradicionalmente los frutos de árbol como las manzanas contienen niveles bajos de E. coli
(Frankish et al., 2021) debido a que no son un producto agrícola que este en contacto con el
suelo. Por ello, una menor introducción de este microorganismo debe ser previsto durante el
empaque de manzanas. Sin embargo, la mayor variabilidad de recuentos de E. coli puede

36
explicarse por la introducción aleatoria de este microorganismo indicador proveniente de la
fruta que ingresa con una mayor carga de contaminación debido a heces de animales, agua
de irrigación, etc, similar a lo reportado en una planta de empaque de duraznos (Wang et al.,
2021). Asimismo, las propiedades físicas y químicas de los diferentes materiales de las
superficies de los equipos afectan los niveles de contaminación microbiana y la efectividad
de los desinfectantes utilizados (Gazula et al., 2019).

E. coli es usado como indicador de contaminación fecal y es regularmente empleado para

verificar la calidad del agua (Baylis et al., 2011). A pesar de que todas las plantas de
empaque de manzanas muestreadas utilizan agua recirculada en sus tanques de lavado, no
se encontraron mayores valores de E. coli en esta operación unitaria. Esto se explica a lo
previamente reportado respecto al uso de desinfectantes como cloro y ácido peroxiacético
en el tanque de lavado de manzanas. Similarmente, en un estudio en el que se evaluaron
concentraciones microbianas en diferentes tipos de procesamiento postcosecha de productos
agrícolas, no se detectó E. coli en el agua de lavado (Ailes et al., 2008).

4.2 Límites microbiológicos en superficies de contacto con alimentos en plantas de

empaque de manzana luego de procedimientos de limpieza y desinfección

En la Tabla 6 y Anexos 2-5 se representan los límites superiores de control (LSC) para cada
uno de los microorganismos indicadores evaluados luego de procedimientos de limpieza y
desinfección. Los LSC se determinaron en base a las 741 muestras evaluadas y representan
el promedio de recuento de colonias + 3σ. En el Anexo 2 para el microorganismo indicador
bacterias aerobias mesófilas totales, Anexo 3 para el microorganismo indicador
Enterobacteriaceae y el Anexo 4 para el microorganismo indicador coliformes, el máximo
recuento de colonias obtenido se representó mediante el valor 4.1 Log CFU/100 cm2. En el
Anexo 5 donde se representa el LSC para E. coli, el máximo valor de recuento de colonias
reportado fue de 2.3 Log CFU/100 cm2. El valor mínimo de recuento de colonias obtenido
para todos los microorganismos indicadores se representó mediante el valor 0.1 Log
CFU/100 cm2. Este valor se obtuvo según los procedimientos descritos en el Anexo 6.

37
 Tabla 6. Límites microbiológicos recomendados en superficies de contacto con
alimentos en plantas de empaque de manzanas luego de procedimientos de
limpieza y desinfección

Microorganismo indicador Log UFC/100 cm2

Aerobios mesófilos totales < 3.1

Enterobacteriaceae < 1.3

Coliformes < 1.0

E. coli < 0.3

Actualmente, en los EE. UU no existen regulaciones que definan estándares específicos de

los niveles aceptables de cargas microbianas de microorganismos indicadores en superficies
de contacto de alimentos para la industria de productos agrícolas frescos. Estos estándares
deberían abordar las diferencias que puedan surgir según el método de muestreo empleado,
el área de la superficie muestreada, el tipo de producto que se ha procesado y la operación
unitaria en la que se tomen las muestras. Por lo tanto, se recomienda que cada tipo de
industria construya los limites microbiológicos para aceptar o rechazar la limpieza de una
superficie en base a los estándares objetivos obtenidos después de un procedimiento de
limpieza y desinfección validado que se ha realizado de manera correcta (Blackburn, 2003;
Forsythe S.J, 2000).

Las cinco plantas de empaque muestreadas cuentan con un plan de higiene y saneamiento
además de un programa de monitoreo ambiental, por lo que sus procesos de limpieza y
desinfección se encuentran validados. Generalmente, cada planta de empaque emplea
distintos detergentes y desinfectantes como cloro, acido peracético y amonio cuaternario
dependiendo del tipo de superficie o área (húmeda o seca), para llevar a cabo estos procesos.

De acuerdo con esto, éstas cinco plantas de empaque representan una situación general de la
industria de empaque de manzanas en el estado de Washington. Por ello, los rangos de
poblaciones de organismos indicadores obtenidos en este estudio son específicos para la

38
industria de empaque de manzanas frescas y se basó en cada operación unitaria del proceso
de empaque.

Al comparar los límites microbiológicos aceptables (Tabla 6) con otras regulaciones

nacionales e internacionales descritos en la Tabla 1, se determinó que los valores obtenidos
en este estudio cumplen con la mayoría de los límites aceptables reportados por regulaciones
internacionales y nacionales basados en industrias de alimentos listos para el consumo
humano. Por ejemplo, respecto a los recuentos de aerobios mesófilos totales, los valores
obtenidos en esta investigación se encuentran dentro de límite aceptable según la norma
Mexicana NOM- 093- SSA1-1994 (Secretaria de Salud, 1995) y la norma de EE. UU
(Favero et al., 1984). Sin embargo, la norma de Canadá (BC Centre for Disease Control,
2010) reporta valores más estrictos, por lo que los valores obtenidos para la industria de
manzanas estarían por encima del límite aceptable. Cabe resaltar que estas normativas están
basadas en establecimientos que expenden alimentos listos para el consumo que muchas
veces pasan por operaciones de tratamiento térmico como pasteurización, cocción, etc., que
tienen el fin de reducir la carga microbiana. A diferencia del proceso de empaque de
manzanas, en el que no existe ninguna operación en el que se realice algún proceso de
tratamiento térmico para la eliminación de microorganismos.

Respecto a los niveles de coliformes, los valores reportados en este estudio estuvieron dentro
del límite aceptable según las regulaciones peruana (MINSA, 2007) y mexicana.
Actualmente la norma peruana solo especifica limites microbiológicos del organismo
indicador coliformes mediante el muestreo por método de esponja. Asimismo, no se
encontró ninguna normativa que especifique un valor aceptable para el microorganismo
indicador E. coli.

4.3 Aplicación de las competencias profesionales

El presente Trabajo de Suficiencia Profesional se encuentra enmarcado dentro de las

actividades realizadas por la Bachiller en Ciencias – Industrias Alimentarias en la institución
Washington State University, desempeñando el cargo de asistente de investigación de

39
postgrado. La carrera de Industrias Alimentarias permite el correcto desenvolvimiento
dentro de la institución, tanto en conocimientos como en competencias adquiridas.

En la realización de una investigación relacionada con el recuento de microorganismos

indicadores en plantas de empaque de manzanas se realiza la elaboración de flujogramas
de las operaciones unitarias pertenecientes a todo el proceso de empaque de manzanas, el
muestreo microbiológico en superficies en contacto con alimentos, y la evaluación de
normas regulatorias internacionales.

Estas funciones se desempeñaron apropiadamente ya que se ponen en práctica los

conocimientos adquiridos durante los años de estudio, tal como se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7. Cursos y conocimientos adquiridos y aplicados en el desempeño laboral

Cursos Conocimientos adquiridos puestos en

práctica
Microbiología de Alimentos Técnicas de microbiología aplicada
Introducción a la ingeniería de Elaboración de flujogramas
Alimentos
Gestión de la Calidad de Alimentos Normas alimentarias nacionales e
internacionales
Tecnología de alimentos I Procesamiento de frutas y hortalizas

Asimismo, en el presente Trabajo de Suficiencia Profesional se puso en práctica el recuento

de microorganismos indicadores en superficies de contacto con alimentos en plantas de
empaque de manzanas, aplicando conocimientos específicos de análisis microbiológicos,
elaboración de flujogramas y evaluación de normas alimentarias internacionales, que
guardan relación con las asignaturas mostradas en la Tabla 8.

40
 Tabla 8. Cursos y conocimientos adquiridos y aplicados en la evaluación de
microorganismos indicadores

Cursos Conocimientos adquiridos puestos en

práctica

Microbiología de Alimentos Técnicas de muestreo de superficies y

recuento de bacterias

Tecnología de alimentos I Procesamiento postcosecha de frutas

Introducción a la ingeniería de Alimentos Determinación de operaciones unitarias y

elaboración de flujogramas

Gestión de la Calidad de Alimentos Normas alimentarias nacionales e

internacionales

Control de Calidad de Alimentos Determinación de limites críticos de

control

Finalmente, el desarrollo de capacidades y competencias durante la carrera, tales como

trabajo en equipo, búsqueda y redacción apropiada de información técnico-científica,
comunicación, empatía y responsabilidad en el trabajo, entre otros, permitió un correcto
desenvolvimiento del bachiller en el centro laboral, así como en la ejecución exitosa de las
labores y actividades encomendadas.

41
 V. CONCLUSIONES

1. Se determinaron las poblaciones promedio y rangos (Promedio ± desviación estándar)

(Log UFC/100 cm2) de los microorganismos indicadores Aerobios mesófilos totales
(2.7 ± 1.2 - 3.3 ± 0.9), Enterobacteriaceae (1.0 ± 1.0 - 1.7 ± 1.5), coliformes (0.6 ± 0.9
- 1.4 ± 1.3) y E. coli (0.2 ± 0.4 - 0.3 ± 0.6), en superficies de contacto con alimentos
de equipos utilizados en el empaque de manzanas en cinco plantas de empaque de
manzanas del estado de Washington, EE. UU, luego de procedimientos de limpieza y
desinfección.
2. Los límites microbiológicos de los microorganismos indicadores (Log UFC/100 cm2)
encontrados en superficies de contacto con alimentos, de equipos utilizados en el
empaque de manzanas en base a cinco plantas de empaque de manzanas del estado de
Washington, EE. UU, luego de procedimientos de limpieza y desinfección fueron:
Aerobios mesófilos totales (< 3.1), Enterobacteriaceae (< 1.3), coliformes (< 1.0), y
E. coli (< 0.3).
3. El recuento de aerobios mesófilos totales en las superficies de contacto con alimentos
de los equipos pertenecientes a las operaciones unitarias de encerado y segundo secado
por túnel mostraron valores significativamente mayores a la operación unitaria de
lavado.
4. Las poblaciones de Enterobacteriaceae y coliformes, las poblaciones mayores fueron
observadas en las superficies de contacto con alimentos de los equipos pertenecientes
a operaciones unitarias asociadas al área húmeda (operaciones de lavado y
desinfección) en comparación con las operaciones de clasificación y empacado.
5. Los recuentos de E. coli fueron bajos en las superficies de contacto con alimentos de
los equipos pertenecientes a todas las operaciones unitarias y no se encontraron
diferencias estadísticamente significativas entre ellas.
6. Se reportaron diferentes tipos de superficie de contacto con alimentos con mayores
recuentos estadísticamente significativos según el tipo de microorganismo indicador.
 VI. RECOMENDACIONES

- Evaluar la correlación entre los microorganismos indicadores evaluados y el

microorganismo indicador Listeria especies y otros patógenos alimentarios.
- Evaluar la correlación entre la prevalencia de microorganismos indicadores y el uso de
pruebas rápidas comúnmente utilizados en la industria alimentaria como
bioluminiscencia ATP.
 VII. BIBLIOGRAFIA

3M Food Safety. (2020). 3MTM PetrifilmTM Plates and plate reader. Recuperado de:
https://multimedia.3m.com/mws/media/1505478O/3m-petrifilm-plates-
brochure.pdf
Adeolu, M., Alnajar, S., Naushad, S., & Gupta, R. S. (2016). Genome-based phylogeny and
taxonomy of the ‘Enterobacteriales’: Proposal for enterobacterales ord. nov. divided
into the families Enterobacteriaceae, Erwiniaceae fam. nov., Pectobacteriaceae fam.
nov., Yersiniaceae fam. nov., Hafniaceae fam. nov., Morgane. International Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology, 66(12), 5575–5599.
https://doi.org/10.1099/ijsem.0.001485
Ailes, E. C., Leon, J. S., Jaykus, L. A., Johnston, L. M., Clayton, H. A., Blanding, S.,
Kleinbaum, D. G., Backer, L. C., & Moe, C. L. (2008). Microbial concentrations on
fresh produce are affected by postharvest processing, importation, and season.
Journal of Food Protection, 71(12), 2389–2397. https://doi.org/10.4315/0362-028X-
71.12.2389
Alegbeleye, O. O., Singleton, I., & Sant, A. S. (2018). Sources and contamination routes of
microbial pathogens to fresh produce during field cultivation: A review. Food
Microbiology, 73(January), 177–208.
Angelo, K. M., Conrad, A. R., Saupe, A., Dragoo, H., West, N., Sorenson, A., Barnes,
A.,Doyle, M., Beal, J., Jackson, K. A., Stroika, S., Tarr, C., Kucerova, Z., Lance, S.,
Gould, L. H., Wise, M., & Jackson, B. R. (2017). Multistate outbreak of Listeria
monocytogenes infections linked to whole apples used in commercially produced,
prepackaged caramel apples: United States, 2014–2015. Epidemiology and Infection,
145(5), 848–856. https://doi.org/10.1017/S0950268816003083
Baylis, C., Uyttendaele, M., Joosten, H., & Davies, A. (2011). The Enterobacteriaceae and
their significance to the food industry.
BC Centre for Disease Control. (2010). Environmental hygiene monitoring -A guide for
environmental health officers. Recuperado de: http://www.bccdc.ca/resource-
gallery/Documents/Guidelines%20and%20Forms/Guidelines%20and%20Manuals/EH/FP
S/Food/EnvMonitoringHygieneGuideforEHOs.pdf
Bell, C., & Kyriakides, A. (2009). Pathogenic Escherichia coli. In C. Blackburn & P.
McClure (Eds.), Foodborne Pathogens: Hazards, Risk Analysis and Control (Second,
pp. 581–626). Woodhead Publishing Limited.
Betts, R., & Blackburn, C. (2009). Detecting pathogens in food. In C. Blackburn & P.
McClure (Eds.), Foodborne Pathogens: Hazards, Risk Analysis and Control (Second,
pp. 17–65). Woodhead Publishing Limited.
Beuchat, L. R. (2002). Ecological factors influencing survival and growth of human
pathogens on raw fruits and vegetables. Microbes and Infection, 4, 413–423.
https://doi.org/10.1016/S1286-4579(02)01555-1
Blackburn, C. (2003). Microbiological analysis and food safety management: GMP and
HACCP systems. Detecting Pathogens in Food, 3–19.
Brandl, M. T. (2006). Fitness of human enteric pathogens on plants and implications for food
safety. Annual Review of Phytopathology, 44, 67–392.
https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.44.070505.143359
Brooks, J. P., & Gerba, C. (2014). Bioaerosol contamination of produce: Potential issues
from an unexplored contaminant. In K. R. Matthews, G. M. Sapers, & C. P. Gerba
(Eds.), The Produce Contamination Problem: Causes and Solutions (Second edition).
Elsevier. https://doi.org/10.1016/C2012-0-01380-4
Burnett, S. L., Chen, J., & Beuchat, L. R. (2000). Attachment of Escherichia coli O157:H7
to the surfaces and internal structures of apples as detected by confocal scanning laser
microscopy. Applied and Environmental Microbiology, 66(11), 4679–4687.
Centers for Disease Control and Prevention (CDC). (2015). Multistate Outbreak of
Listeriosis Linked to Commercially Produced, Prepackaged Caramel Apples Made
from Bidart Bros. Apples (Final Update). Recuperado de:
https://www.cdc.gov/listeria/outbreaks/caramel-apples-12-14/index.html%0A
Cordier, J.-L. (2013). Microbiological Criteria and Indicator Microorganisms. In M. Doyle
& R. L. Buchanan (Eds.), Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers (Fourth,
pp. 81– 90). ASM Press. https://doi.org/10.1128/9781555818463.ch4
Cosby, C. M., Costello, C. A., Morris, W. C., Haughton, B., Devereaux, M. J., Harte, F., &
Davidson, P. M. (2008). Microbiological analysis of food contact surfaces in child
care centers. Applied and Environmental Microbiology, 74(22), 6918–6922.
https://doi.org/10.1128/AEM.00547-08

45
Critzer, F. J., & Doyle, M. P. (2010). Microbial ecology of foodborne pathogens associated
with produce. In Current Opinion in Biotechnology.
https://doi.org/10.1016/j.copbio.2010.01.006
Da Silva, N., Taniwaki, M., Junqueira, V., Silveira, N., Do Nascimiento, M., & Gomes, R.
(2013). Aerobic plate count. In Microbiological examination methods of food and
water - A Laboratory Manual (First, pp. 57–66). CRC Press.
Davidson, C. A. (2001). An Evaluation of Some Microbiological and ATP Bioluminescence
Methods for the Recovery and Detection of Bacterial Contamination from Food
Contact and Environmental Surfaces. University of Wales.
Davidson, C. A., Griffith, C. J., Peters, A. C., & Fielding, L. M. (1999). Evaluation of two
methods for monitoring surface cleanliness - ATP bioluminescence and traditional
hygiene swabbing. Luminescence, 14, 33–38
De Oliveira Mota, J., Boué, G., Prévost, H., Maillet, A., Jaffres, E., Maignien, T., Arnich,
N., Sanaa, M., & Federighi, M. (2021). Environmental monitoring program to
support food microbiological safety and quality in food industries: A scoping review
of the research and guidelines. Food Control, 130.
https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2021.108283
Elmoslemany, A. M., Keefe, G. P., Dohoo, I. R., Wichtel, J. J., Stryhn, H., & Dingwell, R.
T. (2010). The association between bulk tank milk analysis for raw milk quality and
on-farm management practices. Preventive Veterinary Medicine, 95(1–2), 32–40.
https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2010.03.007
Estrada, E. M., Hamilton, A. M., Sullivan, G. B., Wiedmann, M., Critzer, F. J., & Strawn,L.
K. (2020). Prevalence, persistence, and diversity of listeria monocytogenes and
listeria species in produce packinghouses in three U.S. States. Journal of Food
Protection, 83(2), 277–286. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-19-411
Favero, M. S., Gabis, D. A., & Vesley, D. (1984). Environmental monitoring procedures. In
Compendium of methods for the microbiological examination of foods (pp. 49–54).
American Public Health Association.
Feng, P., Weagant, S. D., Grant, M. A., & Burkhardt, W. (2018). Enumeration of Escherichia
coli and the coliform bacteria. In Bacteriological Analytical Manual. U.S. Food and
Drug Administration.
Forsythe S.J. (2000). The microbiology of safe food (First edition). Recuperado de:
https://ntserver1.wsulibs.wsu.edu:2171/lib/wsu/reader.action?docID=351572

46
Frankish, E. J., Bozkurt, H., Ross, T., Phan-thien, K., Luning, A., Bell, T. L., & Mcconchie,
R. (2021). An observational assessment of Australian apple production
practices for microbial control. Food Control, 123, 107767.
https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2020.107767
Gazula, H., Quansah, J., Allen, R., Scherm, H., Li, C., Takeda, F., & Chen, J. (2019).
Microbial loads on selected fresh blueberry packing lines. Food Control,
100(January), 315– 320. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2019.01.032
Glass, K. A., Golden, M. C., Wanless, B. J., Bedale, W., & Czuprynski, C. (2015). Growth
of listeria monocytogenes within a caramel-coated apple microenvironment. MBio,
6(5), 2–6. https://doi.org/10.1128/mBio.01232-15
Gómez, D., Ariño, A., Carramiñana, J. J., Rota, C., & Yangüela, J. (2012). Sponge versus
mini-roller for the surface microbiological control of Listeria monocytogenes, total
aerobic mesophiles and Enterobacteriaceae in the meat industry. Food Control, 27(1),
242–247. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.03.031
Griffith, C. (2005). Improving surface sampling and detection of contamination. In
Handbook of Hygiene Control in the Food Industry (pp. 588–618). Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1533/9781845690533.3.588
Griffith, C. (2016). Surface sampling and the detection of contamination. In Handbook of
Hygiene Control in the Food Industry (Issue 44, pp. 673–696). Woodhead Publishing
Series.
Griffiths, M. (1997). Rapid Microbiological Methods with Hazard Analysis Critical Control
Point. Journal of AOAC International, 80(6), 1143–1150.
Harris, L. J., Farber, J. N., Beuchat, L. R., Parish, M. E., Suslow, T. V., Garrett, E. H., &
Busta, F. F. (2003). Outbreaks associated with fresh produce: incidence, growth, and
survival of pathogens in fresh and fresh-cut produce. Comprehensive Reviews in
Food Science and Food Safety, 2, 78–141. https://doi.org/10.1111/j.1541-
4337.2003.tb00031.x
Heredia, N., Caballero, C., Cárdenas, C., Molina, K., García, R., Solís, L., Burrowes, V.,
Bartz, F. E., de Aceituno, A. F., Jaykus, L.-A., García, S., & Leon, J. (2016).
Microbial Indicator Profiling of Fresh Produce and Environmental Samples from
Farms and Packing Facilities in Northern Mexico. Journal of Food Protection, 79(7),
1197–1209. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-15-499
Hoelzer, K., Pouillot, R., Gallagher, D., Silverman, M. B., Kause, J., & Dennis, S. (2012).
Estimation of Listeria monocytogenes transfer coefficients and efficacy of bacterial

47
 removal through cleaning and sanitation. International Journal of Food
Microbiology, 157(2), 267–277. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2012.05.019
Kenney, S. J., & Beuchat, L. R. (2002). Survival of Escherichia coli O157:H7 and
Salmonella Muenchen on apples as affected by application of commercial fruit
waxes. International Journal of Food Microbiology, 77(3), 223–231.
https://doi.org/10.1016/S0168-1605(02)00113-7
Kornacki, J. L., Gurtler, J. B., & Stawick, B. A. (2015). Enterobacteriaceae, Coliforms, and
Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In Y. Salfinger & M. L. Tortorello
(Eds.), Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods
(Fifth, pp. 103–120). American Public Health Association.
International Commission on Microbiological Specifications for Foods Staff (ICMSF).
(2002). Sampling to assess control of the environment. In Microbiological Testing in
Food Safety Management (pp. 199–224). https://doi.org/10.1007/978-1-4684-8369-
7_11
Lehto, M., Kuisma, R., Määttä, J., Kymäläinen, H. R., & Mäki, M. (2011). Hygienic level
and surface contamination in fresh-cut vegetable production plants. Food Control,
22(3–4), 469–475. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2010.09.029
Lynch, M. F., Tauxe, R. V, & Hedberg, C. W. (2009). The growing burden of foodborne
outbreaks due to contaminated fresh produce: risks and opportunities. Epidemiology
and Infection, 137(3), 307–315. https://doi.org/10.1017/S0950268808001969
Macarisin, D., Sheth, I., Hur, M., Wooten, A., Kwon, H. J., Gao, Z., De Jesus, A., Jurick II,
W., & Chen, Y. (2019). Survival of outbreak, food, and environmental strains of
Listeria monocytogenes on whole apples as affected by cultivar and wax coating.
Nature Research, 9(January), 1–11. https://doi.org/10.1038/s41598-019-48597-0
Magdovitz, B. F., Gummalla, S., Thippareddi, H., & Harrison, M. A. (2020). Evaluating
environmental monitoring protocols for Listeria spp. And Listeria monocytogenes in
Frozen Food Manufacturing Facilities. Journal of Food Protection, 83(1), 172–187.
https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-19-190
Marus, J. R., Bidol, S., Altman, S. M., Oni, O., Parker-Strobe, N., Otto, M., Pereira, E.,
Buchholz, A., Huffman, J., Conrad, A. R., & Wise, M. E. (2019). Notes from the
field: Outbreak of Listeriosis likely associated with prepackaged caramel apples -
United States, 2017. Morbidity and Mortality Weekly Report, 68(3), 76–77.
https://doi.org/10.15585/mmwr.mm6803a5

48
MINSA. (2007). Guía técnica para el Análisis Microbiológico de Superficies en contacto
con Alimentos y Bebidas (RM/461-2007). El Peruano.
https://www.saludarequipa.gob.pe/desa/archivos/Normas_Legales/alimentos/RM_4
61_200 7.pdf
Moberg, L., & Kornacki, J. (2015). Microbiological Monitoring of the Food Processing
Environment. In Yvonne Salfinger & M. Tortorello (Eds.), Compendium of methods
for the microbiological examination of foods (Fifth, pp. 27–43). American Public
Health Association.
Moore, G., & Griffith, C. (2002). A comparison of surface sampling methods for detecting
coliforms on food contact surfaces. Food Microbiology, 19(1), 65–73.
https://doi.org/10.1006/fmic.2001.0464
Moore, Ginny. (2003). Rapid Methods for Assessing Surface Cleanliness within the Food
Industry: Their Evaluation, Design and Comparison to Traditional Techniques.
University of Wales.
Moore, Ginny, & Griffith, C. (2002). A comparison of traditional and recently developed
methods for monitoring surface hygiene within the food industry: An industry trial.
International Journal of Environmental Health Research, 12(4), 317–329.
https://doi.org/10.1080/0960312021000056429
Nygaard, A. B., & Charnock, C. (2018). Longitudinal development of the dust microbiome
in a newly opened Norwegian kindergarten. Microbiome, 6(1).
https://doi.org/10.1186/s40168-018-0553-x
Odonkor, S. T., & Ampofo, J. K. (2013). Escherichia coli as an indicator of bacteriological
quality of water: an overview, 5–11. https://doi.org/10.4081/mr.2013.e2
Parish, M. (1998). Coliforms, Escherichia coli and Salmonella serovars associated with a
citrus-processing facility implicated in a salmonellosis outbreak. Journal of Food
Protection, 61(3), 280–284. https://doi.org/10.4315/0362-028X-61.3.280
Pietrysiak, E., & Ganjyal, G. M. (2018). Apple peel morphology and attachment of Listeria
innocua through aqueous environment as shown by scanning electron microscopy.
Food Control, 92, 362–369. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.04.049
Pietrysiak, E., Smith, S., & Ganjyal, G. M. (2019). Food safety interventions to control
Listeria monocytogenes in the fresh apple packing industry: A review.
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 0, 1–22.
https://doi.org/10.1111/1541- 4337.12496

49
Ruiz-Llacsahuanga, B., Hamilton, A., Zaches, R., Hanrahan, I., & Critzer, F. (2021). Utility
of rapid tests to assess the prevalence of indicator organisms (Aerobic plate count,
Enterobacteriaceae, coliforms, Escherichia coli, and Listeria spp.) in apple
packinghouses. International Journal of Food Microbiology, 337, 108949.
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108949
Ryser, E., & Schuman, J. (2015). Mesophilic Aerobic Plate Count. In Y Salfinger & M.L.
Tortorello (Eds.), Compendium of methods for the microbiological examination of
foods (Fifth, pp. 95–101). American Public Health Association.
Samish, Z., Etinger-Tulczynska, R., & Bick, M. (1963). The microflora within the tissue of
fruits and vegetables. Journal of Food Science, 28, 259–266.
https://doi.org/10.1111/j.1365- 2621. 1963.tb00194.x
Secretaria de Salud. (1995). Norma Oficial Mexicana 093-SSA1-1994, Bienes y servicios.
Prácticas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en
establecimientos fijos.
Tortorello, M. L. (2003). Indicator Organisms for Safety and Quality-Uses and Methods for
Detection: Minireview. Journal of AOAC International, 86(6), 1208–1217.
https://academic.oup.com/jaoac/article/86/6/1208/5657037
U. S. Department of Agriculture, National Agricultural Statistics Service, & Northwest
Regional Field Office. (2019). 2019 Washington Annual Statitiscal Bulletin.
https://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/Washington/Publications/Annual_St
atistica l_Bulletin/2019/WA_ANN_2019.pdf
U.S Food and Drug Administration. (2017a). Draft guidance for industry: control of Listeria
monocytogenes in ready-to-eat foods. Recuperado de: http://www.regulations.gov.
U.S Food and Drug Administration. (2017b). Fresh Pak Inc. recalls lot specific sliced apple
products because of possible health risk. Recuperado de:
https://www.fda.gov/safety/recalls-market- withdrawals-safety-alerts/fresh-pak-inc-
recalls-lot-specific-sliced-apple-products-because- possible-health-risk
U.S Food and Drug Administration. (2017c). Jack Brown Produce, Inc. Recalls Gala, Fuji,
Honeycrisp and Golden Delicious apples due to possible health risk.
Recuperado de:https://www.fda.gov/safety/recalls-market-withdrawals-safety-
alerts/jack-brown-produce-inc-recalls-gala-fuji-honeycrisp-and-golden-delicious-
apples-due-possible-health
U.S Food and Drug Administration. (2019). North Bay Produce voluntarily recalls fresh
apples because of possible health risk. Recuperado de:

50
 https://www.fda.gov/safety/recalls-market- withdrawals-safety-alerts/north-bay-
produce-voluntarily-recalls-fresh-apples-because- possible-health-risk
U.S Food and Drug Administration. (2020). Country Fresh expands voluntary recall.
Recuperado de: https://www.fda.gov/safety/recalls-market-withdrawals-safety-
alerts/country-fresh-expands-voluntary-recall#:~:text=Country
United Fresh Produce Association. (2018). Strategies for Listeria Control in Tree Fruit
packinghouses. Recuperado de: https://wstfa.org/wstfa-assets/uploads/Strategies-
for-Listeria-Control-in-Tree-Fruit-Packinghouses.pdf
Van Elsas, J. D., Semenov, A. V., Costa, R., & Trevors, J. T. (2011). Survival of Escherichia
coli in the environment: Fundamental and public health aspects. ISME Journal, 5(2),
173– 183. https://doi.org/10.1038/ismej.2010.80
Wang, P., Quansah, J. K., Pitts, K. B., & Chen, J. (2021). Hygiene status of fresh peach
packing lines in Georgia. Lwt, 139(November 2020), 110627.
https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.110627
Wassermann, B., Müller, H., & Berg, G. (2019). An Apple a Day: Which Bacteria Do We
Eat with Organic and Conventional Apples? Frontiers in Microbiology, 10(July), 1–
13. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01629
Williamson, K., Pao, S., Dormedy, E., Phillips, T., Nikolich, G., & Li, L. (2018). Microbial
evaluation of automated sorting systems in stone fruit packinghouses during peach
packing. International Journal of Food Microbiology, 285(July), 98–102.
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2018.07.024
Wu, S. T., Burnett, J., Wang, J., Hammons, S. R., Veenhuizen, D. R., & Oliver, H. F. (2020).
Infrastructure, sanitation, and management practices impact Listeria monocytogenes
prevalence in retail grocery produce environments. Food Control (109), 106911.
https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2019.106911
Xiong, J. (2017). Food Safety Knowledge and Practices of College Students. College of
Saint Benedict/Saint John's University. Recuperado de:
https://digitalcommons.csbsju.edu/elce_cscday

51
VIII. ANEXOS
Anexo 1. Número de superficies muestreadas según tiempo de almacenamiento de manzanas, estación del año en que se realizó el
muestreo y operación unitaria del proceso de empaque de manzanas

Estación del año Otoño Invierno Primavera Verano Número de

Tiempo de almacenamiento de 1 a 3 4a6 7a9 10 a 12 superficies
manzanas (meses) muestreadas
Operación unitaria
Lavado 18 18 17 17 70
Lavado/enjuague/desinfección 20 20 20 19 79
Primer secado (Ventiladores) 19 19 19 18 75
Encerado 12 12 12 11 50
Segundo secado (Sec. túnel) 22 22 22 22 85

Clasificación 76 76 75 75 302
Empacado 20 20 20 20 80

Número de superficies muestreadas 187 187 185 182 741

Anexo 2. Límite Superior de Control (LSC) de recuentos de aerobios mesófilos totales en superficies de contacto con alimentos de
plantas de empaque de manzana luego de procedimientos de limpieza y desinfección
Anexo 3. Límite Superior de Control (LSC) de recuentos de Enterobacteriaceae en superficies de contacto con alimentos de plantas de
empaque de manzana luego de procedimientos de limpieza y desinfección
Anexo 4. Límite Superior de Control (LSC) de recuentos de coliformes en superficies de contacto con alimentos de plantas de empaque
de manzana luego de procedimientos de limpieza y desinfección
Anexo 5. Límite Superior de Control (LSC) de recuentos de E. coli en superficies de contacto con alimentos de plantas de empaque de
manzana luego de procedimientos de limpieza y desinfección
Anexo 6. Ejemplo de cálculo de unidades formadoras de colonias (UFC) en placas
Petrifilm

- Petrifilm Aerobios mesófilos totales:

Según el contador de recuento de colonias automático, este Petrifilm contenía 80 UFC.

Debido a que se sembró 1 ml del total (10 ml D/E caldo neutralizante contenido en la esponja
+ 2 ml de agua estéril desionizada añadida= 12 ml) en la placa Petrifilm y no se realizaron
diluciones posteriores, el cálculo para determinar cuántas UFC se encontraban en el total de
superficie muestreada (100 cm2), se realizó de la siguiente manera:

80 UFC →1 ml de siembra en Petrifilm

“X” UFC → 12 ml total (10 ml D/E caldo neutralizante contenido en la esponja + 2
ml de agua estéril desionizada añadida)

Por lo tanto: “X” = 960 UFC/100cm2

Se aplicó Log10: 2.98 UFC/100cm2

58