Reacción de Las Peroxidasas y Actividad Pseudoperoxidasa

REACCIÓN DE LAS PEROXIDASAS Y ACTIVIDAD PSEUDOPEROXIDASA
Marcela Peña, Sebastián Izquierdo

Espacio de laboratorio de Bioquímica, Facultad de Ciencias Naturales
RESUMEN:
Objetivos:
 Distinguir el responsable de la actividad peroxidasa en tres materiales biológicos distintos, y

averiguar si esta actividad es debida o no a una enzima.
Consultas previas
 ¿Cómo explica usted que la sangre presenta actividad pseudoperoxidasa?
La hemoglobina es una proteína de la sangre que tiene como función principal transportar el oxígeno
desde los órganos respiratorios hasta los tejidos, y el dióxido de carbono desde los tejidos hasta los
pulmones para que sea eliminado. La hemoglobina está formada por 4 globinas, cadenas
polipeptídicas a las cuales se une un grupo hemo, cuyo átomo de hierro es capaz de unir de forma
reversible una molécula de oxígeno1. Este grupo hemo tiene la capacidad de sustituir la peroxidasa y
así descomponer el peróxido de hidrogeno por eso se dice que tiene una actividad
pseudopreoxidasa.
 ¿Por qué cambia el color de la solución de bencidina cuando reacciona con el oxígeno?
El oxígeno al reaccionar con la bencidina produce una reacción química de oxidación- reducción. El
oxígeno oxida la bencidina produciendo una coloración azul intenso. El oxígeno en esta reacción es
capaz de convertir un compuesto incoloro como la bencidina en un producto azul. esta cambio de
color ocurre ya que la bencidina, cuando pasa a su forma oxidada cambia de color. Esta característica
se aprovecha para poder comprobar la presencia de peroxidasas en una muestra, puesto que la
reacción no se produciría si no existe catalizador.
1
http://es.wikipedia.org/wiki/Hemoglobina
RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
Tabla 1: Detección de actividad peroxidasa en pruebas nativas de espinaca, rábano y sangre.

# del
Observaciones después de agregar 0,5ml de
tubo de Contenido del tubo de ensayo
Bencidina y 2ml de H2O2
ensayo
Se precipita la parte solida de la solución, y la parte
5ml de espinaca macerada en
1 liquida queda en el fondo con un color verde oscuro
2ml de agua destilada
translucido.
5ml de rábano macerado en La solución toma un color amarillo ocre y se ven
2
2ml de agua destilada algunas partículas sólidas.
La solución toma primero un color azul oscuro,
Sangre diluida en 1ml de agua luego cambia a verde oscuro, se torna un poco más
3
destilada claro, y finalmente queda un color café claro
translucido.
Tabla 2: detección de actividad peroxidasa en pruebas desnaturalizadas de espinaca, rábano y sangre.

#Del
Observaciones después de calentar la sustancia a
tubo de Contenido del tubo de ensayo
100°C y agregarle 0,5ml de bencidina y 2ml de h2o2
ensayo
Se concentra más la espinaca solida de la solución en
5ml de espinaca macerada en
4 la superficie y el líquido de la solución queda en el
2ml de agua destilada
fondo con un color verde translucido.
5ml de rábano macerado en La solución se pone azul primero y luego toma un
5
2ml de agua destilada color amarillo translucido.
Sangre diluida en 1ml de agua La solución primero toma un color blanco y luego se
6
destilada pone café claro translucido.
Figura 1: primero se observa la detección de actividad

peroxidasa en muestras nativas, luego se muestra la
actividad peroxidasa en pruebas desnaturalizadas, y
por ultimo se comparan ambos resultados.
Las peroxidasas son un tipo de enzimas que pertenecen a la categoría de las oxidorreductasas. Tienen
una gran importancia en los seres vivos ya que reducen al peróxido de hidrógeno usando distintos
sustratos reductores. Si lo anterior no ocurre y esta sustancia se acumula, ocasiona un desequilibrio
orgánico que genera radicales libres, y luego lleva a la destrucción de membranas y a posibles causas de
cáncer y otras enfermedades 2. Por lo general estas enzimas catalizan reacciones de tipo redox
(reducción- oxidación), es decir, una reacción química en la cual una sustancia pierde electrones dejando
como resultado un número de oxidación más positivo, y otra sustancia gana electrones volviendo su
número de oxidación más negativo.
En vegetales como el rábano esta enzima está presente. Por lo anterior, tal como se describe en la tabla
1, cuando se le agregaron 0,5ml de peróxido de hidrogeno y 2ml de Bencidina al tubo de ensayo #2 que
contenía rábano, se pudo apreciar la actividad peroxidasa. En este caso el peróxido de hidrogeno era la
sustancia oxidante y la bencidina la sustancia reductora de la reacción redox. La peroxidasa descompone
el peróxido de hidrogeno dejando O 2 libre que luego oxida la bencidina, la enzima cataliza la
transferencia de electrones desde la bencidina (agente reductor) hacia el peróxido de hidrogeno (agente
oxidante). La bencidina al pasar a su forma oxidada cambia de color y es lo que le da el color amarillo
ocre a la solución que se ve en la figura 1.
Se pueden apreciar ciertas diferencias cuando se comparan los resultados mencionados anteriormente
con los resultados obtenidos para la solución de rábano y agua que había sido desnaturalizada y se
muestra en la tabla 2. Después de que se calentara la muestra a 100°C, y más adelante se le agregaran
0,5ml de bencidina y 2ml de H 2O2, se puede observar que la sustancia toma primero un color azul oscuro
y luego rápidamente cambia a un color amarillo translucido. En los resultados explicados de la tabla 1, se
demostró que evidentemente la enzima peroxidasa estaba presente en el rábano. Ya se dijo previamente
que la enzima presente en el rábano era un tipo de proteína, por lo tanto, esta proteína cuando se
somete a cambios de presión, pH, concentración de ligandos, cambios de solvente o cambios de
temperatura, puede sufrir cambios conformacionales, es decir se desnaturaliza. En este caso, este
cambio conformacional de la enzima se produjo cuando se calentó la muestra a 100°C. Normalmente la
actividad enzimática se incrementa cuando aumenta la temperatura y llega a un punto óptimo en donde
la temperatura por lo general no pasa de los 50°C y la enzima es demasiado eficiente en su acción
enzimática. Cuando la temperatura pasa de este nivel, se observa una disminución en la actividad debido
a la desnaturalización de su estructura proteica.
Se sabe que una proteína es una cadena de aminoácidos con una secuencia es específica. Esta cadena de
aminoácidos comienza a plegarse sobre sí misma para tomar una conformación espacial necesaria que
realiza correctamente una función específica. Al calentar la proteína, y por lo tanto agregarle energía a la
muestra, lo que sucedió fue que gracias a esa energía se rompieron los enlaces que mantienen la
estructura secundaria, terciaria y a veces cuaternaria de la proteína. Cuando se rompen estos enlaces y
se pierde la estructura nativa, también cambian las propiedades físicas y químicas de esa proteína, y por
lo tanto cambia su función o ya no la puede hacer. Lo anterior fue lo que sucedió con la peroxidasa del
rábano, al calentarse se produjo la desnaturalización y por lo tanto ya no pudo cumplir con su función
2
http://www.umanizales.edu.co/publicaciones/campos/medicina/archivos_medicina/html/publicaciones/
edicion_9/6_actividad_enzimat.pdf
enzimática. Como no pudo catalizar el proceso que descomponía el peróxido de hidrogeno al agregar
bencidina, se produce la coloración diferente al tubo 2 en el cual si se produce la reacción.
En el tubo 3 de ensayo que contenía la sangre diluida, cuando se agregan 0,5ml de Bencidina y 2ml de
H2O2, la solución toma primero un color azul oscuro, luego cambia a verde oscuro, se torna un poco más
claro, y finalmente queda un color café claro translucido. Lo anterior sucede ya que se está produciendo
una reacción que descompone el peróxido de hidrogeno como ya se ha explicado previamente. A
diferencia de las demás muestras de la tabla 2, se puede observar que al calentar la sangre diluida y
luego agregarle los 0,5ml de Bencidina y 2ml de H2O2, la reacción seguía ocurriendo en el tubo de
ensayo. Como en los demás tubos de ensayo la reacción ocurría gracias a la enzima peroxidasa que al
calentarse y desnaturalizarse perdía su función, el hecho de que la sangre siguiera produciendo la
reacción después de calentarse, demostraba que la sustancia encargada de realizar la reacción no era la
enzima peroxidasa. En el caso de la sangre, la sustancia encargada de realizar la reacción era el grupo
hemo de la hemoglobina.
La hemoglobina es una proteína de la sangre encargada de transportar el oxigeno desde los pulmones
hasta los tejidos, y el dióxido de carbono desde los tejidos hasta los pulmones. Esta proteína es una
heteroproteina, es decir, tiene una parte proteica que serian las cuatro cadenas polipeptídicas o
globinas, y una parte no proteica o grupo prostético que en este caso sería el grupo hemo, cuyo átomo
de hierro es capaz de unir de forma reversible una molécula de oxígeno. Este grupo funcional tiene la
característica de que es capaz de descomponer el peróxido de hidrogeno de forma no enzimática, y a
esta característica se le conoce como actividad pseudoperoxidasa. Aquí el peróxido de hidrógeno se une
a la proteína gracias al hierro, y desplaza a la molécula de agua. Al descomponer el peróxido de
hidrógeno se produce una liberación de oxígeno que a su vez oxida a la bencidina. Ya hemos dicho
anteriormente que al generarse la forma oxidada de la bencidina, se produce la coloración descrita
previamente y mostrada en la figura 1. Esta actividad pseudoperoxidasa no se ve afectada por el calor
como se ve en los otros tubos de ensayo, ya que la actividad de la pseudoperoxidasa de la hemoglobina
es termoestable, resiste temperaturas elevadas por un determinado tiempo.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
 Stryer, Lubert, Berg, Jeremy M. Bioquímica. Séptima edición.

 Fundamentos teóricos y prácticos de la Histoquímica. Edición: Ricardo Martínez Rodríguez;
Raquel de los Reyes Gragera Martínez.
 Hipertexto Santillana, química 10.
 http://www.umanizales.edu.co/publicaciones/campos/medicina/archivos_medicina/html/
publicaciones/edicion_9/6_actividad_enzimat.pdf

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 Distinguir el responsable de la actividad peroxidasa en tres materiales biológicos distintos, y

 ¿Cómo explica usted que la sangre presenta actividad pseudoperoxidasa?

Tabla 1: Detección de actividad peroxidasa en pruebas nativas de espinaca, rábano y sangre.

Tabla 2: detección de actividad peroxidasa en pruebas desnaturalizadas de espinaca, rábano y sangre.

Figura 1: primero se observa la detección de actividad

 Stryer, Lubert, Berg, Jeremy M. Bioquímica. Séptima edición.

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