Universidad Nacional de Salta – Medicina

Introducción a los Estudios de Medicina

ALFABETIZACIÓN ACADÉMICA UNIVERSITARIA

ACTIVIDAD 3

Lea atentamente el texto presentado. Luego responda las consignas del Cuestionario
consultando el texto en forma permanente.
- El cuestionario se habilitará en la fecha y horario indicado en aula virtual.
- Con números se indican los diferentes apartados del texto.

Tecnología del ADN recombinante

El siguiente texto explica en qué consiste la tecnología de ADN recombinante, cómo se
realiza y cuáles son sus aplicaciones en la vida cotidiana.

El nacimiento de una nueva era

1. En la década de 1950 se descubrió que los genes no eran nada más y nada menos
que cadenas de nucleótidos. Un descubrimiento que parece tan sencillo desencadenó,
sin embargo, el nacimiento de una nueva era: la de la tecnología del ADN recombinante.
La primera molécula de ADN recombinante fue creada por Paul Berg, a comienzos de
los 70. Para aquella época, los biólogos moleculares habían aprendido a alterar genes
individuales, cortar y pegar pedazos de ADN de diferentes organismos y moverlos de
uno a otro.
Otros pioneros de esta tecnología fueron Stanley Cohen, un genetista estadounidense,
y Herbert Boyer, un bioquímico de la misma nacionalidad. Cohen estaba interesado en
aprender cómo los genes de plásmidos otorgan resistencia a las bacterias y Boyer
trabajaba con enzimas de restricción, por lo que decidieron trabajar juntos en la
combinación de dos plásmidos resistentes a antibióticos diferentes para crear una
bacteria resistente a ambos.

¿Qué es la tecnología del ADN recombinante?

2. ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos
fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de
técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e
inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal,
vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente
extraña.
Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala,
ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una
superproducción, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida
por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las
bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de
proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. A esto
justamente se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o de
sus productos con fines prácticos.
El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas
de investigación: 1) el conocimiento de las enzimas de restricción, 2) la replicación y
reparación de ADN, 3) la replicación de virus y plásmidos y 4) la síntesis química de
secuencias de nucleótidos.
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¿Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: enzimas de restricción

3. En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas -las
enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como "tijeras
moleculares", cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin
dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al
Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética.
Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa
contra virus y degradan el ADN extraño.
A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción
mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un átomo
específico de ciertos nucleótidos.
Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen
fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un "pegamento
molecular": la enzima ligasa).
Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los
extremos cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras
asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena
complementarios entre sí. Por otro lado, los extremos romos son generados cuando la
enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.
Las enzimas de restricción permiten cortar el genoma de cualquier organismo en
pequeños fragmentos llamados fragmentos de restricción. La colección de miles o
millones de estos fragmentos se llama biblioteca génica.

Figura 1. Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de
extremos. En el primer caso, el corte genera nucléotidos de simple cadena llamados
extremos cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN
ligasa. En el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos
extremos también pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como los
extremos no son complementarios, la unión será más inespecífica.

¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?

4. Una vez que los biólogos encontraron cómo fabricar ADN recombinante usando
enzimas de restricción y ligasas, el desafío siguiente fue cómo producir grandes
cantidades de genes y cómo introducirlos en bacterias u otras células huésped. El primer
problema fue solucionado con el uso de plásmidos, pequeñas moléculas de ADN
circular presente en muchas bacterias.
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Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces
de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite
replicarse de manera independiente del ADN genómico.
Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este proceso
consta de las siguientes etapas:
1. Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar
extremos cohesivos.
2. Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los
extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan
unirse.
3. Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-
ligasa y luego introducimos el plásmido con inserto en bacterias.
4. Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con la ayuda de
antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a
antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan
incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán, mientras que las
que no lo tengan morirán.
Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN
incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula
multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica lleva
el nombre de clonación. El término clon proviene de la jardinería; desde hace siglos los
jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas plantas son genéticamente
idénticas y constituyen un clon.
Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente idénticas.
El uso de fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en la ingeniería
genética, ya que sirven para transferir material genético de un organismo a otro.
Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a otro

¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa

5. Durante las décadas de 1970-1980, la manera más práctica de hacer múltiples copias
de una secuencia particular de ADN era introduciendo una molécula de ADN
recombinante (un plásmido más un gen) en una célula huésped. Esto podía resultar un
poco engorroso, ya que muchas veces se disponía de una cantidad muy pequeña de
moléculas de ADN para realizar pruebas.
A mediados de la década de los 80, la invención de una técnica capaz de generar
centenares de miles de copias de una secuencia sin la necesidad de clonarla en ningún
tipo de vector resolvió este problema. Kary Mullis, un bioquímico americano que
trabajaba sintetizando ADN, resolvió este problema con la invención de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés).
Esta se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión de pequeños
fragmentos (denominados primers) y la extensión de estos fragmentos usando de molde
el ADN de la muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en cada
ciclo de reacción. Para llevar a cabo esta reacción se requiere de una enzima polimerasa
que sea capaz de soportar la alta temperatura del proceso de desnaturalización. Esta
enzima es una ADN-polimerasa especial obtenida de una bacteria termófila (la Thermus
aquaticus), resistente a altas temperaturas.
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La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar la muestra de manera

espectacular y su sensibilidad es tal que alcanza con una molécula para que la reacción
genere una infinidad de copias. Esto la convierte en una importante, si no imprescindible,
herramienta para el análisis de filiación o de criminalística forense, ya que con sólo una
pequeñísima muestra se pueden realizar diferentes estudios comparativos que nos
permiten conocer el dueño de un "rastro" genético en particular.
También se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico médico, como
la detección de virus o de mutaciones que provocan enfermedades genéticas, a partir
de una muestra de ADN tan pequeña como un cabello o una gota de sangre.
Otra aplicación de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa es la
transcripción inversa de ARNm. Mediante el uso de una enzima de origen viral
denominada transcriptasa reversa puede usarse como molde una molécula de ARNm,
transcribirla a una secuencia de ADN, y luego ser amplificada como cualquier otra
secuencia por la reacción en cadena de la polimerasa, con lo que se obtiene una gran
cantidad de ADN a partir de unas pocas moléculas de ARNm. Esta técnica es muy
empleada para el estudio de expresión génica, así como para la producción de proteínas
en diferentes organismos.

¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y anticuerpos

6. Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como encontrar
una aguja en un pajar. Si tuviéramos que realizar dicha tarea, probablemente usaríamos
un imán para atraer la aguja (siempre y cuando esta sea de metal y posea propiedades
magnéticas). De manera análoga, hoy día podemos encontrar genes o proteínas
usando, respectivamente, sondas y anticuerpos, que actúan como imanes moleculares.
Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la
región de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna "marca" que permite
revelar su unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera revela presencia
de la región buscada.

¿Cómo se marcan esas sondas o fragmentos de ácidos nucleicos?

7. Las sondas pueden ser "coloreadas" durante su síntesis utilizando nucleótidos
marcados con isótopos radiactivos. Otra manera de marcarlas es mediante la unión con
una molécula que pueda ser detectada posteriormente como fluorescente, un marcador
químico que puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya actividad
produce el cambio de color de su sustrato.
Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma
(o la expresión de algún gen en particular por medio de la detección de la presencia de
su correspondiente ARNm) es la hibridación in situ. Durante este proceso se incuba el
ADN con una sonda (de ADN o ARN) complementaria a la secuencia buscada, y
marcada radiactiva o químicamente.
La sonda "navega" por el interior de la célula hasta encontrar una secuencia
complementaria a ella. Una vez que esto ocurra se formará una doble cadena que
permitirá no sólo detectar la presencia de esta secuencia, sino indicar el lugar específico
que ocupa dentro de la célula. Si se tratara de un fragmento de un cromosoma, nos
permitiría saber su localización exacta o locus.
Para revelar la presencia de hibridación de la sonda, la muestra debe exponerse a una
placa radiográfica; en el caso de las sondas marcadas químicamente se procede a su
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revelado mediante el uso de moléculas fluorescentes o que puedan ser detectadas por
colorimetría (utilizando una enzima que provoque el cambio de color de un sustrato).
Se puede también utilizar colonias de bacterias con ADN recombinante con una técnica
similar, pero que usa anticuerpos en vez de sondas. Se comienza por una colonia de
bacterias que contengan y expresen el gen de ADNc. Luego se trata las bacterias con
un anticuerpo marcado, que se unirá a la colonia que sintetice la proteína deseada. De
esta manera se puede localizar el gen en cuestión y clonarlo para obtener múltiples
copias.

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?

Si visitamos un laboratorio de biología molecular, probablemente encontraremos una
cuba con un gel al cual se le aplica una corriente eléctrica. Este método,
llamado electroforesis en gel, es muy usado para separar moléculas de diversos
tamaños y es la base de las técnicas que describiremos para identificar ADN, ARN, y
proteínas. En los párrafos siguientes describiremos entonces la electroforesis para
poder comprender luego cómo funcionan las demás técnicas.

Separación de ácidos nucleicos y proteínas. Electroforesis en gel

8. La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los laboratorios para
separar ácidos nucleicos o proteínas, de acuerdo con su tamaño. Esto se logra por la
diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo
eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas
cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva. Existen
distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida.
La velocidad de desplazamiento de las moléculas es inversamente proporcional a su
tamaño. En los ácidos nucleicos la carga está dada por los nucleótidos, por lo que el
tiempo que tardará la molécula en atravesar el gel será directamente proporcional al
número de nucleótidos que tenga, es decir a su tamaño. De esta manera, para un tiempo
determinado, las moléculas más grandes quedarán más retrasadas en el gel que las
moléculas más pequeñas.
La separación de proteínas es un poco más complicada, ya que éstas poseen una
estructura tridimensional compleja y compacta, además de una carga neta que depende
de la identidad de los aminoácidos que la componen. Esto hace más difícil separarlas
sólo por su tamaño y por eso se emplea una versión modificada conocida
como electroforesis en gel de poliacrilamida. Las proteínas forman bandas de acuerdo
con su tamaño; si se corre una muestra con proteínas de tamaño conocido se puede
determinar el tamaño de la proteína estudiada por la distancia recorrida en el gel. Las
proteínas más grandes quedarán arriba y las más chicas quedan abajo (y las de tamaño
medio quedarán entre las demás). Además, el grosor de la banda obtenida dependerá
de la cantidad de proteína que se haya sembrado; cuanto mayor sea la cantidad de
proteínas, más gruesa será la banda.
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Figura 1. Electroforesis en gel. Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un

gel que es sometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a través del gel
impulsadas por dicha corriente. Esta técnica permite separar moléculas de acuerdo a
su tamaño y carga ya que las más pequeñas (o aquellas con mayor carga) se mueven
con mayor velocidad. El gráfico muestra bandas de distinto ancho, correspondientes a
distinta cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y

Western Blot
9. Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como
primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una
muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección
de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de
las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utilizó el mismo
sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión al nombre
del científico inventor de la técnica basada en ADN).
Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean
secuencias específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a
identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección
de las moléculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay
diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho
más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones.
Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta
lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir
las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta
manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con
sondas específicas para detectar la presencia de determinadas secuencias.
Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia
de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el
genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en
determinadas condiciones. Hemos visto que dos células del mismo organismo se
distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite
evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes
genes.
Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot,
que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de
anticuerpos específicos. Una vez que la muestra con las proteínas que se quiere
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identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una membrana especial donde las

proteínas quedan "ancladas" o adheridas. Después, se incuba esta membrana con el
anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica pueden
obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la
muestra sembrada.

¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarreglos

10. Otra técnica que emplea la hibridación de sondas específicas marcadas es la de
microarreglos (Microarrays), que consta de una membrana dividida en celdillas que
poseen adheridas sondas que representan un gen en particular. En conjunto, estas
celdillas contienen todos los genes conocidos de un organismo. De esta manera, cuando
se coloca una muestra en estos chips se irá hibridando cada gen que se encuentre en
la muestra con su sonda correspondiente en la casilla determinada. Cuando una celdilla
da positivo, quiere decir que ese gen determinado está presente en la muestra.
Los ensayos con microarreglos son rápidos de realizar, pero muy engorrosos de
analizar. Además, están muy limitados a los genes que ya se conocen. Permiten obtener
un pantallazo rápido sobre qué está pasando en la célula en ese momento determinado,
en cuanto a qué genes están encendidos y cuáles apagados. Sin embargo, los
resultados obtenidos nunca deberían ser concluyentes, sino que tendrían que ser
validados mediante otras técnicas (por ejemplo, Northern Blot).

Microarreglos: esta técnica permite analizar simultáneamente miles de genes.

Fuente: educ.ar portal, educar.com.ar.

https://www.educ.ar/recursos/91636/tecnologia-del-adn-recombinante/fullscreen/fullscreen