Citometria de Flujo - 1

CITOMETRÍA DE FLUJO
TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO
AINARA GRANDAGONZÁLEZ
ALBA PEREZ LÓPEZ
JOSÉ ANTONIO PINTOR FOLGUERAL
BEATRIZ TUÑÓN GONZÁLEZ
23/03/2021
CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN
1. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA
2. CONCEPTOS GENERALES
3. ANÁLISIS DE RESULTADOS
4. APLICACIONES CLÍNICAS
INTRODUCCIÓN 
Los microscopios nos permiten identificar células de acuerdo a

sus características morfológicas, pero en cuanto a características funcionales no nos
aportan información. Existen casos en los que
las células son prácticamente idénticas morfológicamente, como es el caso de los
linfocitos B y T, en las cual es imposible distinguir entre ellos, sino es por sus diferentes
funciones. Es aquí donde la citometría de flujo nos ayuda, y nos
aporta información sobrediferentes parámetros celulares que permiten una identificación 
celular concreta. 
La citometría de flujo es una técnica de análisis cuantitativo con gran potencial

analítico, que reside principalmente en la posibilidad de medir diversos parámetros en
decenas de millares de células individuales en pocos segundos. Básicamente el citómetro
de flujo mide propiedades de absorción y dispersión de luz por la célula o partícula
subcelular, y fluorescencia emitida por fluorocromos unidos a componentes celulares de
interés, inducidas por una iluminación apropiada.
1. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA
Para llevar a cabo dicho análisis, el citómetro de flujo se

sirve de un equipamiento sofisticado y relativamente
complejo que podemos dividir:
SISTEMA FLUÍDICO
  Las células a analizar en la muestra pasan por una
cámara de flujo, un circuito líquido que permite la
separación y alineación de las células a través del circuito.
Algo de gran utilidad pues situamos cada célula
individualmente, y de una manera precisa y estable, frente al
rayo lumínico. 
SISTEMA ÓPTICO
  Compuesto por láseres y filtros, que se encargan de iluminar a las células y dirigir las
señales resultantes hacia los detectores. Con este sistema conocemos el tamaño y
granularidad celular. A su vez,  para una determinación más concreta,  podremos utilizar
marcadores que nos permitan identificar las proteínas que expresan dichas células. Estos
marcadores pueden ser Ac monoclonales acoplados a fluorocromos.
SISTEMA ELECTRÓNICO
Compuesto de una serie de fotomultiplicadores  (que
amplifican la señal recibida)  y
convertidores. Cuya función principal es convertir la
señal lumínica en señal eléctrica.
Para ello, este sistema consta de:
 Fotomultiplicadores y convertidores analógicos
digitales, que detectan y convierten las señales
luminosas en impulsos eléctricos y estos en señales
digitales.
1 C.F.G.S. DE LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

 Ordenador para adquisición, almacenamiento y análisis de los datos en tiempo real o

en modo de matriz de datos.
2. CONCEPTOS GENERALES EN EL ANÁLISIS CELULAR
Existen varios parámetros en la citometría de flujo que permiten la evaluación celular.

Podemos distinguir:
 Parámetros intrínsecos, no dependientes de la fluorescencia pero importantes en la

evaluación celular como:
 FSC (Forward Scatter Channel) que nos informa del tamaño celular
 SSC (Side Scatter Channel) que nos informa de lo que se conoce como
complejidad (rugosidad celular, granulosidad celular,…).
Con la valoración de este parámetro es posible distinguir entre los grandes grupos celulares
de manera morfológica.
 Parámetros dependientes de fluorescencia
La fluorescencia celular limitada es muy limitada, está destinada a la determinación de las

funciones celulares. Que nos permitirán una identificación más concreta.
La principal metodología para llevarlo a término es la inmunofluorescencia, es decir, el

marcaje con anticuerpos combinados con fluorocromo, pero existen otras metodologías.
Actualmente, en la citometría de flujo aplicada a la clínica es habitual trabajar con un

rango de 4-10 parámetros (colores/fluorescencia) simultáneamente
3. ANÁLISIS DE RESULTADOS 
Los resultados obtenidos pueden ser representados de formatos diferentes. El objetivo más

importante es elegir el tipo de gráfico acorde a los parámetros que estemos investigando.
GRÁFICO DE PUNTOS:
En este tipo de gráficas relacionamos dos marcadores diferentes y cada célula se presenta
como un punto aislado en la gráfica. El total de puntos (correspondientes cada uno a una
célula)  nos da una idea del tipo celular en función de las agrupaciones en la siguiente
tabla:
Ilustración 1. Un ejemplo de marcador en el eje X
es el FSC (que se corresponde con los rayos que
inciden frontalmente,  proyectando
una sombra que tenga un tamaño igual al
tamaño de la célula a estudio);  y un ejemplo
de marcador Y sería el SSC  (correspondiente a los
rayos dispersos lateralmente, midiendo con ello el
grado de granularidad de la superficie de
membrana). La región R! se corresponde con una
población de linfocitos; la R2 con una población
de monocitos; y la R3 con una población de
granulocitos (neutrófilos, debido a su gran
concentración en sangre).

GRÁFICOS DE DENSIDAD:   
En este tipo de gráficos, combinamos los dos parámetros anteriores (empleados en
los gráficos de puntos) con la densidad de la población celular. Las poblaciones que tienen
mayor compendio de puntos se pueden representar en función de distintos colores, según el
tipo de gráfico: 
 Gráficos de zebra:  tonos de gris más intenso 
 Gráficos pseudocolor: colores cercanos al naranja 
 Gráfico de contornos; mediante líneas 
HISTOGRAMAS:  
En este tipo de representación relacionamos la intensidad de expresión de un marcador
con el número de partículas excitadas por el láser.
La interpretación se realiza de la siguiente manera:  
 Desplazamiento de la curva hacia la derecha:

mayor expresión del marcador 
 Altura del pico de la curva: frecuencia
de partículas capturadas 
Debemos tener en cuenta, que toda el área que queda bajo la

curva representa las células que se están analizando. 
GRÁFICAS 3D:
El uso de estas gráficas está indicado para los casos en que se pretenda plasmar tres
marcadores diferentes más la frecuencia de partículas analizadas.
Los histogramas también pueden ser representados en gráficos 3D, abarcando un total de
dos marcadores diferentes más la frecuencia relativa correspondiente.
4. APLICACIONES EN LA CLÍNICA
La citometría es una herramienta muy potente a nivel clínico, ya que permite la

identificación de poblaciones y subpoblaciones celulares. La eficiencia de esta técnica
depende tanto de la preparación del personal como de los equipos de los que se dispone.

En la determinación de subpoblaciones, encontramos diferentes maneras de realizarlo:
 Valoración de marcadores de superficie celular: La utilización de la

inmunofluorescencia directa para moléculas de superficie. Metodología más
habitual.
 Valoración de marcadoras intracelulares: La posibilidad de incluir en los marcajes
celulares, anticuerpos (marcados con fluorocromos) contra moléculas intracelulares.
APLICACION Nº1:
La Prueba de Activación de Basófilos (PAB) se define como una técnica de diagnóstico no
invasiva (in vitro) para la determinación de hipersensibilidades tipo I.
En el caso de las alergias, la respuesta inmune se desencadenará a través del

reconocimiento del alérgeno por medio de las IgE localizadas en la membrana
de basófilos y mastocitos tisulares, estimulando la liberación de una serie de mediadores
químicos, tales como la histamina (causante de la sintomatología típica de la alergia)...
A partir de una muestra de sangre periférica, pretratada con dos tipos de anticuerpos
monoclonales acoplados a fluorocromos distintos.
El citómetro de flujo va a poder distinguir:
1. Los basófilos del resto de leucocitos, por medio de un anticuerpo (Ac) específico
para las IgE (fluorocromo PE) que solo se encuentra en la membrana de
los basófilos.
2. Diferenciación entre basófilos activados o inactivos, los cuales habrán
desencadenado una RI, o no, frente a un Ag a estudio. Por medio de un Ac dirigido
contra el CD 63 que se activa cuando se produce la
degranulación (fluorocromo FITC).
Finalmente, a partir de los datos obtenidos con un control positivo y negativo en alergia, se
recaban los datos referentes a las concentraciones normales de basófilos activados en un
proceso alérgico (>5% de basófilos activados) e inactivos en
condiciones normales (<5% de basófilos activados), respectivamente.
APLICACIÓN Nº2:
El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida, fundamentalmente la cuantificación en sangre periférica de las células CD4+ y
los linfocitos CD8+, aporta un valor diagnóstico y pronóstico en esta patología.
Actualmente representa una técnica rutinaria en muchos laboratorios frente a la

necesidad de establecer controles periódicos del número de células CD4+ en los pacientes.
Estas células son las infectadas mayoritariamente y las que se multiplican para combatir
infecciones y producir más copias del VIH.
Algunos equipos utilizan un sistema automatizado para el conteo de linfocitos

CD3+,CD4+ y CD8+, permitiendo la utilización de sangre completa, haciendo una selección
automática de la población de linfocitos, y sin ser precisa la realización de pruebas
hematológicas a parte como el conteo de leucocitos. Y aunque cuenta con sus ventajas y
desventajas, esta técnica amplía la posibilidad de analizar una mayor cantidad de
marcadores para la definición de subpoblaciones celulares.

Para la realización de estas pruebas, que están destinadas a la determinación de los valores
de linfocitos T en pacientes con VIH, existen unos protocolos donde se indican estándares y
parámetros como los tipos de anticoagulantes que debemos emplear, normas de
seguridad, correcta toma de muestras, entre otros.
BIBLIOGRAFÍA
 Pérez-Lara Jocelyn Carolina, Santiago-Cruz Wendolaine, Romero-Ramírez Héctor,

Rodríguez-Alba, Juan Carlos. Fundamentos de Citometría de flujo: Su aplicación
diagnóstica en la investigación biomédica y clínica. Departamento de Biomedicina
Molecular, CINVESTAV-IPN, CDMX, México. 8/12/18.
 Manel Juan i Otero y Europa Azucena González-Navarro. Servicio de inmunología.
Centro de diagnóstico biomédico. Hospital Clínic de Barcelona. 2013-2014.
 Monteiro María-do-Céu, Martínez Marcial, O'Connor José Enrique. La citometría de
flujo en el análisis funcional de las plaquetas: II. Aplicaciones clínicas. Rev Diagn
Biol [Internet]. 2002 Sep; 51(3): 87-99.
 Barrera Ramírez Lourdes maría, Drago serrano ma. Elisa, Pérez Ramos julia, Sainz
Espuñes teresita del rosario, Zamora Ana Cecilia, Gómez arroyo Fabiola et al.
citometría de flujo: vínculo entre la investigación básica y la aplicación clínica. Rev.
inst. nal. enf. resp. mex. [revista en el internet]. 2004 mar.
 Srta. Susana Barrero: Estudiante de Bacteriología; Dres. Adriana Cuéllar, Nelly Susana
Rueda, John Mario González: Grupo de Inmunobiología y Departamento de
Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana; Claudia
Cardozo: Patóloga. Determinación de valores de linfocitos TCD3+, CD3+/CD4+y
CD3+/CD8+por citometría de flujo en adultos donantes de sangre. Laboratorio
Clínico y Banco de Sangre, Hospital Universitario San Ignacio. Bogotá, D.C.
 Alberto Orlao, Juana Ciudad, Antonio López, María Consuelo López-Berges, Belén
Vidriales, Ana Macedo, Marcos González, Jesús F. San Miguel. La citometría de flujo
en el diagnóstico clínico Servicio General de Citometría de la Universidad de
Salamanca.

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CITOMETRÍA DE FLUJO

Los microscopios nos permiten identificar células de acuerdo a

La citometría de flujo es una técnica de análisis cuantitativo con gran potencial

Para llevar a cabo dicho análisis, el citómetro de flujo se

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1 C.F.G.S. DE LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

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4 C.F.G.S. DE LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

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5 C.F.G.S. DE LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

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Debemos tener en cuenta, que toda el área que queda bajo la