Quimotripsina Activación de zimógenos por proteolisis

• Proteasa Secretada por células

del duodeno
• Aumenta la velocidad 109 veces

Activación de la quimotripsina Estudios cinéticos

p-nitrofenil acetato

O O
CH3–C–O– –NO2
-C N-
H
+ H2O Quimotripsina
Enlace peptídico

O HO– –NO2
acetato
-C O-
O p-nitrofenol
Enlace éster CH3–C–OH
 Estudios cinéticos Estudios cinéticos
O
Hartley & Kilby (1954) CH3–C–O– –NO2
O
CH3–C + HO– –NO2
Acilación
OH O
C C

p-nitrofenol
(estallido)

CH3COOH H2O
(s)
tiempo (s)
Desacilación (lento)

Inhibidores irreversibles: organofosforados Inhibidores irreversibles: DIPF

100 Sin sustrat
DIFP

%Inhibición
50

DIFP + sustrato Con sustrato

Diisopropil fluorofosfato
S
0
DIPF (gas nervioso) reacciona con la serina en la acetilcolinesterasa
tiempo de reacción
 El DIPF se une a la Ser195 Inhibidores irreversibles: TPCK
Diisopropilfluorofosfato (DIFP) X
O
X
=
(CH3)2CH–O– P –O–CH(CH3)2 + HF
F
O

=
(CH3)2CH–O– P –O–CH(CH3)2
S
OH O
CH2 CH2 TPCK Sustrato

Ser 195 Ser 195

El TPCK se une a la His 57
Quimotripsina: ¡¡28 Ser!!

Estudios estructurales: Estudios estructurales:

Difracción rayos X Difracción rayos X

Los datos estructurales explican varias cuestiones:

¾¿Por qué son la Ser195 y la His57 tan reactivas?

¾¿Cómo se une el sustrato a la enzima?
¾¿Por qué distintas serín proteasas tienen diferente
especificidad?
¾¿Cómo se activa el quimotripsinógeno?
Estudios estructurales: Tríada catalítica
Difracción rayos X H
O
C

=
C–O - H–N N H–O–CH2 Ser
195
C C
Asp 102 H
CH2
Aromatic ring
His 57

Ser activada

Estudios cinéticos
Tríada catalítica O
O
CH3–C–O– –NO2
CH3–C + HO– –NO2
Acilación
OH O
C C

p-nitrofenol
CH3COOH H2O
tiempo (s)
Desacilación (lento)
 Mecanismo catalítico quimotripsina
Mecanismo catalítico quimotripsina

http://bcs.whfreeman.com/lehninger/
Fig. 6.21

Mecanismo catalítico quimotripsina Mecanismo catalítico quimotripsina

Mecanismo catalítico quimotripsina Fijación preferencial del estado de
transición ……………………………
-C-C-N-C-C-N-C-C-N-
H H
Hueco oxianiónico O- O-
-C N- -C N-
HO H HO H

O
-C N-
H
O
E+S -C-OH

NH2-

Estabilización del estado de transición

Sitios de unión del sustrato
Gly 193
Triada catalítica
Ser 195 Asp 194
Especificidad
Met 192

His 57
Sitio activo
Asp 102 Cys 191

Thr 219
Cys 220

Ser 214
Sitio de especificidad
Trp 215

Gly 216 Ser 218

Ser 217
 Pruebas de la distorsión del sustrato
Pruebas de la distorsión del sustrato
sitio P1 (especificidad)
sitios P3, P4
E + RCO 2 CH 3 ←⎯
KS
→ E ⋅ RCO 2 CH 3 ⎯⎯
k2
→ RCO ⋅ E ⎯⎯
k3
→ E + RCO 2 CH 3
Subsitios en quimotripsina k2 k3 Km kcat/Km
Subsitios en quimotripsina kcat Km kcat/Km
P2 P1 (P’1)
P2 P1 (P’1) (P’2)
Ac- Gly- OCH3 0.5 0.14 3400 0.13
Ac- Phe- NH2 0.06 31 2
Ac- But- OCH3 8.8 1.7 417 21
Ac- Phe- Gly- NH2 0.14 15 10
Ac- NorVal- OCH3 36 5.9 100 360
Ac- Phe- Ala- NH2 2.8 25 114
Ac- NorIle- OCH3 103 19 34 3.000
Ac- Phe- OCH3 796 111 7.6 100.000
• Casi todo el cambio en kcat, no en Km
• 1 millón de veces aumenta kcat/Km cuando se llena el bolsillo • Uno de múltiples experimentos
de especificidad.
• 500 veces aumento en unión, > 1000 veces en velocidad

Activación del quimotripsinógeno:

Mecanismos catalíticos de las serín
Ile 16
proteasas
Tríada catalítica
• Gran parte del efecto catalítico se debe a la Gly 193
His 57 Ser 195
fijación preferencial del estado de transición
Asp 102 Asp 194
• Pocos cambios en la estructura de la enzima
• La NMR muestra que el sustrato debe cambiar de
conformación ANTES de unirse a la enzima +NH
3

• De hecho los datos para P'1 indican que el sitio Ile 16

es incompatible con la conformación nativa
 Conformación de El pH afecta a la actividad de la quimotripsina
quimotripsinógeno y quimotripsina

Relative Activity
La interacción electrostática
entre el Asp 194 y la Ile 16
esencial para la actividad.

Sólo es posible en la
quimotripsina 5 6 7 8 9 10 11
pH

La dependencia del pH confirma el mecanismo Desprotonación de la Ile16

Nuevo NH2-terminal
• Protonación de la

Relative activity
His57
L13 I16 Y146

pH 5 6 7 8 9 10 11

NH2– Ile 16
• Desprotonación Ile16
Asp 194
pH<9 pKa
+ 0
pH>10
–CH2COO-

+ NH
3– Ile 16
 Protonación de la His57 Otras serín proteasas
pH 6 H H pH 7
C + C
H–N N–H H–N N
H+
C C C C
H H

H
Inactiva
O
C +
=

C–O - H–N N–H H–O–CH2 Ser

195
C C-H
Asp 102
CH2

His 57 Tripsina
Quimotripsina Elastasa

Las serin proteasas difieren en

Otras serín proteasas especificidad

Quimotripsina Elastasa Tripsina

grandes pequeño
grande + aromáticos hidrofóbico
Lys, Arg Phe, Tyr, Trp Ala
Evolución convergente y divergente Requerimientos de una proteasa

Clases de proteasas Mecanismos de proteasas

• Clasificadas por el grupo catalítico

principal:
¾ Serín proteasas
¾ Aspartil proteasas
¾ Metalo proteasas
¾ Cisteín proteasas
 Estructura cuaternaria de la LDH
Carboxipeptidasa

Mr = 140.000

(subunit 35.000)

Estructura cuaternaria de la LDH: isoenzimas LACTATO DESHIDROGENASA:

Mecanismo de Acción

Aproximación experimental:
¾ Cinética del estado estacionario
¾ Cinética del estado preestacionario
¾ Ensayos de unión de ligandos
¾ Modificación química de cadenas de aminoácidos
¾ Difracción de rayos X: estructura de la enzima
¾ Mutagénesis dirigida
LDH-1 (H: Heart) Lactate + NAD+ → Piruvato + NADH

LDH-5 (M: Muscle) Piruvato + NADH → Lactate + NAD+

 LACTATO DESHIDROGENASA: Cinética en el estado preestacionario:
Mecanismo de Acción stopped flow
Lactate + NAD+ → Piruvato + NADH

kcat = 80 s-1

kdis NADH = 450 s-1 (binding experiment)

kcat = 80 s-1

Experimentos de unión de ligandos

Modificación química de aminoácidos Difracción rayos X: estructura LDH

Inactiva y:
Complejos:
- Marca la His 195 de la enzima (sólo 1)
¾ E-NAD+
¾ E-NAD+-piruvato
¾ E-NAD+-oxalato
¾ E-NADH-oxamato
- Marca la His 195 en presencia de NAD+
¾ E-NADH-aducto piruvato

- Marca la His 195

Fenilglioxal (relativamente selectivo para Arg) Marca 1 Arg

Difracción rayos X: estructura LDH Integración: mecanismo LDH
*

*
¾ Especificidad NADPH
¾ Esteroespecificidad de la enzima

Integración: mecanismo LDH Formación aducto NAD+-piruvato

 Mecanismo de la LDH: Confirmación mecanismo:
mutagénesis dirigida mutagénesis dirigida

Permite múltiples estudios:

¾ Función de cada aminoácido en la catálisis

¾ Estudio de los cambios conformacionales
¾ Alterar especifidad de la enzima

Cambio de especificidad: Mecanismo de la alcohol

ingeniería de proteínas deshidrogenasa

Lactato DH Malato DH

Gln → Arg-102 (loop móvil)

↑ Actividad oxalacetato 103
↓ Actividad piruvato 104

Variación especificidad 107

Convierte una LDH en una malato DH