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p6. Cinética Enzimática

La práctica estudia cuatro factores que regulan la actividad de la enzima pepsina: pH, temperatura, concentración de enzima y concentración de sustrato. Se realizaron experimentos variando cada factor individualmente y midiendo el grado de turbidez producido por la hidrólisis de la ovoalbúmina. Los resultados mostraron que la actividad de la pepsina es máxima a pH 2, a una temperatura de 37°C, y que aumenta con la concentración de enzima y sustrato hasta alcanzar una saturación.

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NORA PILAR NINAJA MAMANI
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p6. Cinética Enzimática

La práctica estudia cuatro factores que regulan la actividad de la enzima pepsina: pH, temperatura, concentración de enzima y concentración de sustrato. Se realizaron experimentos variando cada factor individualmente y midiendo el grado de turbidez producido por la hidrólisis de la ovoalbúmina. Los resultados mostraron que la actividad de la pepsina es máxima a pH 2, a una temperatura de 37°C, y que aumenta con la concentración de enzima y sustrato hasta alcanzar una saturación.

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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN – TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD


ESCUELA PROFESIONAL DE ENFERMERÍA

GUÍA DE PRACTICAS: BIOQUIMICA

PRÁCTICA 6:
CINETICA ENZIMATICA
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que modifican las velocidades de las reacciones químicas
dentro del organismo, esta acción se conoce como “BIOCATÁLISIS". La actividad de una enzima es
bastante ESPECÍFICA es decir que solo catalizará una o unas cuantas reacciones. Algunas enzimas
dependen para su actividad solamente de su estructura proteica, en cambio otras, dependen además, de
estructuras no proteicas o cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico (Fe 3+,Mg2+, etc), o una molécula
orgánica llamada coenzima (NAD, FAD, etc).

En la presente práctica estudiaremos cuatro factores que regulan la actividad enzimática:


 Temperatura
 PH
 Concentración de sustrato
 Concentración de la enzima

Para ello utilizaremos como modelo la acción hidrolítica de la pepsina sobre las proteínas (albúmina de
huevo). La ovoalbúmina es una proteína globular presente en la clara del huevo a elevadas concentraciones.
Esta proteína es en su estado natural mide 13 x 3 nm y está constituida por 584 residuos de aminoácidos
agrupados en una sola cadena y con un “PM de 64000 y un PI de 4.6”. La ovoalbúmina debe ser
desnaturalizada previamente para su uso; esto se consigue sometiendo al huevo a ebullición se extrae la clara
y se licua con agua destilada y esta solución se filtra a través de una gasa. Obteniéndose así una solución
turbia y su aclaración será producto de la degradación de la ovoalbúmina por la pepsina. La pepsina es una
enzima proteolítica, secretada por las células principales del estómago, al estado de zimógeno o
proenzima pepsinógeno)

MATERIALES

 Muestra
Huevo de gallina

 Reactivos
Solución de ovoalbúmina
Ácido clorhídrico 1 N
Carbonato de sodio al 10%
Agua
Pepsina al 1 %
Papel indicador de PH
Hielo.

 Equipo y Otros
Baño María
Termómetro
Fotocolorímetro
Gradilla y cocina
Material de vidrio necesario
METODOLOGIA

Experimento Nº 1: Efecto del pH

 Fundamento: La actividad de una enzima es máxima a un determinado PH; por debajo o por encima de
éste la actividad disminuye.

 Procedimiento: Preparar cinco tubos enumerados de acuerdo a la tabla adjunta:

REACTIVOS Tubo 1 Tubo 2 (mL) Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


(mL) (mL) (mL) (mL)
Sol. de ovoalbúmina 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
HCI 1 N 1.0 0.25 - - -
Agua destilada - 0.75 1.0 0.75 -
Na2CO3 - - - 0.25 1.0
 Llevar los 5 tubos a baño María y preincubarlos por 5 minutos.
 Luego añadir a cada tubo 1.5 ml de una solución de pepsina al 1 %
 Continuar la incubación de los 5 tubos a 37°C por 5 minutos

 Resultados
 Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


Valor de pH 1 2 7 9 13
Turbidez (*) ++ + +++ ++++ ++++
Actividad(**) 1/2 1 1/3 1/4 1/4
-

(*) Expresado por medio de cruces, más turbidez más cruces.


(**) Expresado como el inverso del número de cruces.

Experimento Nº 2: Efecto de la temperatura

 Fundamento: Una reacción enzimática se ve favorecida por el aumento gradual de la temperatura; las
moléculas de la reacción adquieren progresivamente una mayor energía cinética favoreciendo su
interacción. Este aumento sólo es hasta cierto límite ya que a partir de él se ve afectada la estructura de la
enzima.

 Procedimiento: Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS Tubo 1 Tubo 2 (mL) Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


(mL) (mL) (mL) (mL)
Sol. de ovoalbúmina 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
HCl 1 N 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua destilada 1.75 1.75 1.75 1.75 1.75
T °C de incubación 0°C 20°C 37°C 60°C 90°C

 Llevar los 5 tubos a sus respectivas temperaturas de incubación por 5 minutos.


 Luego añadir a cada tubo 0.5 ml de solución de pepsina al 1 %.
 Continuar la incubación de los 5 tubos por 5 minutos en sus respectivas temperaturas

 Resultados
 Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
Temperatura de incubación (°C) 0 20 37 60 90
Turbidez (*) ++++ ++ + +++ ++++
Actividad(**) 1/4 1/3 1 1/3 1/4
(*) Expresado por medio de cruces, más turbidez más cruces.
(**) Expresado como el inverso del número de cruces.

Experimento Nº 3: Efecto de la concentración de la enzima

 Procedimiento: Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS Tubo 1 Tubo 2 (mL) Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


(mL) (mL) (mL) (mL)
Sol. de ovoalbúmina 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
HCI 1 N 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua destilada 2.25 2.00 1.75 1.25 0.75
Pepsina 1% - 0.25 0.50 1.00 1.50
Mezclar bien cada tubo y llevarlos a baño María, a 37°C por 5 minutos.

 Resultados
Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
Enzima (*) 0 0.05 0.1 0.2 0.3
Turbidez +++++ ++++ ++ + +
Actividad 0 1/4 1/2 1 1
(*)Calcule teóricamente la concentración de la enzima (mg%)

Experimento Nº 4:Efecto de la concentración del sustrato

 Fundamento: Al aumentar la concentración de sustrato, manteniendo fija la concentración de la enzima,


se produce al comienzo un incremento en la velocidad de la reacción y luego una estabilización
(saturación por el sustrato) y la velocidad en que no existe ya incremento se llama velocidad máxima.

 Procedimiento: Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

REACTIVOS Tubo 1 Tubo 2 (mL) Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


(mL) (mL) (mL) (mL)
Sol. de ovoalbúmina 1% 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00
HCI 1 N 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua destilada 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50
 Mezclar bien cada tubo.
 Realice una primera lectura al fotocolorímetro de todos los tubos utilizando filtro azul.
 Llevarlos a incubación a 37°C por 5 minutos.
 Cumplido el tiempo de incubación agregue a cada tubo 0.25 ml de pepsina al 1%
 De inmediato vuelva a incubar a 37°C por 5 minutos más.
 Cumplido este segundo tiempo de incubación realice una nueva lectura al fotocolorímetro de
cada uno de los tubos.

 Resultados
Observar cuidadosamente los tubos y anotar el grado de turbidez en la siguiente tabla:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


Sustrato
Absorbancia inicial 0.209 0.623 0.774 0.979 1
Absorbancia final 0.017 0.060 0.083 0.110 0.248
Actividad Enzimática(**)
(*) Calcule teóricamente la concentración del sustrato para cada tubo asumiendo que la concentración de la
albúmina utilizada es aproximadamente 1%
(* *) Se obtienen restando a la absorbancia inicial la absorbancia final de cada tubo.

CUESTIONARIO
1 º.¿Cuál es el PH óptimo encontrado para la actividad de la pepsina?
2º.¿Cómo será la actividad de la pepsina al PH del jugo gástrico? Explique
3º.Calcule teóricamente el PH para el tubo en dónde se observa la mayor turbidez.
4º.¿A qué temperatura la pepsina tiene mayor actividad para este sustrato?
5°.¿Qué es un zimógeno? Cite al menos 4 ejemplos.
6º.¿Cómo define Ud. Velocidad de una reacción enzimática?
7º.Con el valor de Vmax calcule el Km tanto gráfica como teóricamente (para esto último la ecuación de
Michaelis-Menten y saque un promedio con los resultados para cada tubo).

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