Prácticas de Bioquímica Mgr.

Soledad Bornás Acosta

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PRÁCTICA 7
CATABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
(FERMENTACIÓN)

1. INTRODUCCION
Todos los seres vivos requieren un continuo aporte de nutrientes para suplir sus
necesidades de materia y energía. El principal nutriente de la célula es la glucosa, la
que es catabolizada para producir ATP, siendo la forma más importante de energía
utilizable en la célula. El metabolismo de la glucosa ocurre a través de una serie de
reacciones:
Glicólisis: Glucosa, Piruvato ATP.
Ciclo de Krebs: Acetil CoA, CO2, NADH+H+, FADH2, ATP
Cadena respiratoria: NADH+H+, FADH2, O2, ATP, H2O
En ausencia o deficiencia de oxígeno, ocurre respiración celular anaeróbica o
fermentación, en que el piruvato (producto de la glucólisis) se transforma en etanol
(levaduras) o ácido láctico (músculo.
En presencia de oxígeno suficiente ocurre respiración celular aeróbica, en que el
piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a través
del ciclo de Krebs origina CO2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se
incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son reoxidados por O2,
produciendo ATP y H2O.
Esta vía aeróbica es la principal vía de producción de ATP. Algunas células como los
glóbulos rojos y las bacterias anaeróbicas estrictas tienen en la fermentación la única
vía de producción de ATP, en tanto que otras células como las levaduras, que son
anaerobios facultativos, en ausencia de oxígeno realizan fermentación y en presencia
de él, realizan fermentación y respiración celular.
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:
C6H12O6 CH3CH2OH + CO2

2. OBJETIVOS
• Observar experimentalmente los fenómenos de respiración celular anaeróbica
(fermentación) en levaduras.
• Comprobar el efecto de inhibidores de la glucólisis y de la respiración celular.
• Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores, oxido-reducción en la interpretación
de sus resultados.
3. MATERIAL Y METODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. Materiales biológicos
• Suspensión de levaduras al 7%
3.1.2. Materiales de vidrio
• Tubos de ensayo
• Pipetas
• Frascos de penicilina
• Vasos de precipitación
3.1.3. Reactivos
• Glucosa 0,1M
• NaF 0,1N
• Rojo Neutro 0,02M
• H2O destilada
3.1.4. Equipos y otros
• Cocina
• Regla
• Guantes
3.2. METODOS
Mediante la observación y exploración se aplicará el método de fermentación que nos
demuestra la cantidad de CO2 generado.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Fermentación alcohólica en levaduras (Sccharomyces cerevisiae).
• En 4 tubos de ensayo medir lo siguiente-.

• Agitar por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo.

 • Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionando y girando
rápidamente, de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco.
• Marcar el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo.
• Poner a incubar los tubos en un baño María a 43°C por 30 minutos.
• Medir el volumen de gas producido con una regla.

5. RESULTADOS
5.1.Fermentación alcohólica en levaduras
6. CONCLUSIONES
7. CUESTIONARIO
7.1. ¿Qué función cumple NaF en la fermentación alcohólica en levaduras?
7.2. ¿Qué importancia tiene el uso de rojo neutro en el experimento?
7.3. ¿Cómo evidenciamos la fermentación alcohólica en levaduras? Explique.
7.4. ¿Cómo se aprovecha la fermentación alcohólica en la industria? .
8. BIBLIOGRAFIA
• En 4 tubos de ensayo medir lo siguiente: 1 2 3 4 Suspensión de levaduras al 7% 1mL
1mL 1mL 1mL Solución de glucosa 0,1M 1mL 1mL 1mL Solución NaF 0,1M 1mL H2O
destilada (43°C) 2mL 1mL Solución de rojo neutro 0,02M 1mL
Experimento 4.1. (Efecto del PH sobre la actividad enzimática)
 1 2 3 4 5
Na2CO3 10% 0,25mL 1mL
Pre-Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Pepsina 1% 1,5mL 1,5mL 1,5mL 1,5mL 1,5mL
Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL
HCl 1% 1mL 0,25mL
Agua destilada 0,75mL 1mL 0,75mL
TABLA N°01: Protocolo de trabajo del experimento 4.1.
Figura n°10:
Resultados del experimento 4.1. Observación del grado de turbidez (1 al 5).
 1 2 3 4 5
pH 1 2 7 9 11
Turbidez
(1-5) 2 1 5 3 4
actividad 1/2 1/1 1/5 1/3 1/4
enzimática 0.2 1 0.33 0.25 0.25
TABLA N°02: Resultados del experimento 4.1. Se observa el grado turbidez de cada sistema
de tubos en una escala del 1 al 5, a diferentes pH y asimismo, la actividad enzimática de la
pepsina.
INTERPRETACIÓN:
¿Cuál es el Ph óptimo para que la enzima pepsina tenga actividad enzimática sobre la proteína
ovoalbúmina?
Según los resultados, el tubo N°2 tiene el pH óptimo (2), este tubo es el más claro de
todos(transparente), ello significa que la pepsina si ha hidrolizado a la ovoalbúmina en
moléculas más pequeñas, sin embargo el tubo más turbio es el N°3, significa que la proteína
está intacta y no hidrolizó por ende el pH 7 no condiciona a la pepsina.
Teóricamente, sabemos que la pepsina es una enzima estomacal y tiene un pH óptimo de 2,
La pepsina solo realiza la proteólisis en medio ácido, actúa a un pH bajo, por lo que es precisa
la presencia de ácido clorhídrico para la realización de la digestión gástrica de las proteínas.
Nuestro experimento resultó factible.
GRÁFICO N°01: Actividad enzimática vs pH
Experimento 4.2. (Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática)
 1 2 3 4 5
Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL
HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25% 0,25mL
Agua destilada 1,75mL 1,75mL 1,75mL 1,75mL 1,75mL
Pre-Incubar x 5minutos 0°C 20°C 37°C 60°C 90°C
Pepsina 1% 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL 0,5mL
Incubar 0°C 20°C 37°C 60°C 90°C
TABLA N°03: Protocolo de trabajo del experimento 4.2

1 2 3 4 5
 T°(°C) 0 20 37 60 90
Turbidez
(1-5) 5 4 3 2 1
1/5 1/4 1/3 1/1 1/2
actividad
enzimática 0.2 0.25 0.3 1 0.5
TABLA N°04: Restultados del experimento 4.2. Se observa el grado turbidez de cada sistema
de tubos en una escala del 1 al 5, a diferentes Temperaturas y asimismo, la actividad
enzimática de la pepsina.
INTERPRETACIÓN:
Según los resultados, el tubo n°4 es el que tiene mayor actividad enzimática, a su vez tiene un
grado de turbidez de 2.

GRÁFICO N°02: Actividad enzimática vs Temperatura

Experimento 4.3. (Efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad enzimática)

 1 2 3 4 5

Ovoalbúmina 1% 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL

HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL

Agua destilada 2,25mL 2,00mL 1,75mL 1,25mL 0,75mL

Pepsina 1% 0mL 0,25mL 0,50mL 1,00mL 1,50mL

Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C

TABLA N°03: Protocolo de trabajo del experimento 4.3.

Figura n°

1 2 3 4 5

[E]% 0 0.05 0.1 0.2 0.3

v 16 14 10 5 1
actividad
enzimática
(1-16)
(+) 0.2 0.25 0.3 1 0.5

TABLA N°04: Resultados del experimento 4.3. Se observa el grado turbidez de cada sistema
de tubos en una escala del 1 al 5, a diferentes Temperaturas y asimismo, la actividad
enzimática de la pepsina.
GRÁFICO N°4:
Experimento 4.4. (Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática)
 1 2 3 4 5
Ovoalbúmina 1% 1,0mL 1,5mL 2,0mL 2,5mL 3,0mL
HCl 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL
Agua destilada 3,5mL 3,0mL 2,5mL 2,0mL 1,5mL
Lectura de Absorbancia 1
Pre-Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Pepsina 1% 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL 0,25mL
Incubar x 5 minutos 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C
Lectura de Absorbancia 2

TABLA N°04: Protocolo de trabajo del experimento 4.4.

CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. Para una misma cantidad de enzima, a más
moléculas de sustrato haya más probabilidad hay de encentro y de formación del complejo
enzima-sustrato, necesario para que ocurra la catálisis. La Km es la concentración de sustrato
a la cual la enzima alcanza la mitad de su velocidad máxima. Es un buen indicador de la
afinidad enzimática, ya que un valor bajo de Km supone que con poca cantidad de sustrato se
alcanza la mitad de la Vmax, indicando una gran apetencia de la enzima por el sustrato y fácil
formación de complejos enzima-sustrato.
6. CONCLUSIONES
7. CUESTIONARIO
7.1. ¿Qué es un zimógeno, cite al menos cuatro ejemplos?
Un zimógeno (o proenzima) es un precursor enzimático inactivo. Un zimógeno requiere un
cambio bioquímico (como una reacción de hidrólisis que revele el sitio activo, o que cambie
la configuración para revelar el sitio activo) para convertirse en un enzima activo. El cambio
bioquímico suele ocurrir en un lisosoma, donde una parte específica de la enzima precursora
se parte para activarla. La cadena aminoácida que se libera por la activación se llama el
péptido de activación.
Ejemplos de zimógenos:
Tripsinógeno, Quimotripsinógeno, Pepsinogen. La mayor parte de las proteínas del sistema
de coagulación Algunas de las proteínas de los sitema complementos: Procaspasas
Proelastasa Prolipasa

7.2. ¿Cuáles son las formas de evaluar la actividad enzimática?

Se puede determinar la actividad enzimática analizando:
La aparición de algún producto
La desaparición del sustrato
La variación de un cofactor o de algún componente de la reacción

En definitiva, la actividad de una enzima se mide mediante la determinación de la cantidad

de sustrato formado por unidad de tiempo, en condiciones exactamente definidas (pH, Tª…)
y estrictamente controladas.

7.3. Determinar el km gráfica o teóricamente, teniendo en cuenta la Vmáx.

7.4. ¿Cómo influye los factores de pH, temperatura, concentración de enzima y sustrato
sobre la actividad enzimática de la pepsina?
La pepsina (enzima estomacal) tiene un pH óptimo de 2, al graficar su actividad
enzimática para valores crecientes de pH, comenzando desde la zona ácida, se obtiene
una curva en forma de campana. El máximo de la curva corresponde al pH óptimo en
el cual la enzima tiene su máxima actividad. En medios muy ácidos o muy alcalinos,
la enzima se desnaturaliza y se inactiva.

Al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el

calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura
óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de la velocidad de la reacción
 debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida
a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta
anularse.

Concentración de sustrato
Al aumentar la concentración de sustrato se incrementa la velocidad de la reacción.
Esto se debe a que más moléculas de sustrato colisionarán con las moléculas de
enzima, por lo que se formará el producto más rápidamente. No obstante, al superar
cierta concentración de sustrato no habrá ningún efecto sobre la velocidad de la
reacción, pues la enzimas estarían saturadas y funcionando a su máxima velocidad.
Concentración de enzimas
A medida que aumenta la concentración de enzimas, la velocidad de la reacción
aumenta de manera proporcional. Sin embargo, esto es así solo hasta cierta
concentración, pues en un momento determinado la velocidad se hace constante.
Esta propiedad se utiliza para determinar las actividades de las enzimas séricas (del
suero sanguíneo) para el diagnóstico de enfermedades.

7.5. ¿Cómo será la actividad enzimática de la pepsina al nivel del pH del jugo gástrico?
La pepsina es un enzima proteolítico (proteasa ácida) segregada por las células
principales de las glándulas gástricas, tiene un peso molecular de 34 644 Da.
Hidroliza los enlaces peptídicos, descomponiendo así las proteínas en aminoácidos.
La pepsina solo realiza la proteólisis en medio ácido, actúa a un pH bajo, por lo que
es precisa la presencia de ácido clorhídrico para la realización de la digestión gástrica
de las proteínas. Las células de las glándulas gástricas no producen directamente
pepsina, sino que su producto es el pepsinógeno, sustancia precursora sin capacidad
digestiva que se convierte en pepsina en la luz de la glándula, al entrar en contacto
con el ácido clorhídrico y con la pepsina ya producida.

8. BIBLIOGRAFÍA
Pérez, J. & Noriega,M.(s.f.) Fisiología General-enzimas. Universidad de Cantabria.
Santander, España.
https://ocw.unican.es/pluginfile.php/879/course/section/967/Tema%25202B-
Bloque%2520I-Enzimas.pdf
Química.es
https://www.quimica.es/enciclopedia/Zim%C3%B3geno.html
ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA%205enzimologia.pdf