Técnicas para Determinar Proteínas

Técnicas analíticas para la determinación
de Proteínas
BROMATOLOGÍA
NUTRICIÓN Y DIETÉTICA
Identifica técnicas analíticas cuantitativas
para la determinación de nutrientes.
R.A. clase
TÉCNICAS DE ANÁLISIS PARA PROTEÍNAS
¿qué recordamos de las proteínas?

Cuantificación del contenido de nitrógeno
total y proteínas
Las proteínas constituyen un grupo de biomoléculas muy importante,

puesto que son las responsables de muchas funciones biológicas:
Como la formación de tejidos y la actividad enzimática.
Conocer los contenidos de proteínas presentes en los tejidos, ha sido

objeto de varios estudios y en consecuencia se han desarrollado
muchas técnicas de análisis.
Existen varios métodos mediante los cuales se puede determinar el

contenido de proteína bruta, proteína real y nitrógeno no proteico en
muestras tanto de origen vegetal como de origen animal.
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Estos métodos son particularmente útiles en la valoración del contenido de
proteína real, puesto que se basan en la formación de complejos coloreados
entre algunos aminoácidos proteicos ó el enlace peptídico, con reactivos
específicos.
Dentro de los métodos clásicos están el que emplea el reactivo del biuret, el
que se fundamenta en la formación de un complejo coordinado entre los iones
cúpricos del reactivo y el enlace peptídico de la proteína, reacción que
transcurre en medio alcalino. También es de uso frecuente el método que
emplea la espectrofotometría con base en el reactivo de Folin.
En los dos casos anteriores, se elaboran curvas de calibración con una proteína
patrón, normalmente la albúmina de huevo o la albúmina bovina estabilizada
estándar, y en las mismas condiciones de reacción se hace el desarrollo de la
coloración para la muestra que se esté analizando.
Reconocimiento de proteínas por reacción de Biuret
https://es.slideshare.net/melitoc1/determinaci
on-de-proteinas-por-el-metodo-de-biuret-2
MÉTODO KJELDAHL
El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido
sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de
hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en
ácido bórico. El borato de amonio formado se valora con ácido sulfúrico
ó acido clorhídrico.
El método de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son:

digestión de la muestra, destilación con arrastre de vapor del amoniaco
producido y valoración ácido base de este amoniaco.
Destilación
Digestión Valoración
Arrastre de
vapor
Digestión:
En la primera etapa, el hidrógeno y el oxígeno proteico, son

oxidados hasta dióxido de carbono y agua, mientras que el
nitrógeno es convertido en sulfato de amonio, por la acción
de un agente oxidante en medio ácido y con la ayuda de un
catalizador.
Se han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia

el catalizador ó el agente oxidante, pero en todos los casos,
el objetivo final de la etapa de digestión es el de convertir el
nitrógeno proteico en sulfato de amonio.
Arrastre con vapor
En la etapa siguiente, mediante la acción de

una base fuerte, generalmente hidróxido de
sodio al 40%, se libera el amoníaco de la sal
de amonio.
Cuando la valoración se va a efectuar por

retroceso, el amoniaco liberado se arrastra
con vapor y se recoge sobre un volumen
exactamente medido de un ácido estándar.
Una variante utilizada comúnmente, consiste

en recibir el amoniaco (hidróxido de amonio)
sobre ácido bórico aproximadamente al 4%
de tal manera que se forma borato de
amonio, el cual se titula directamente.
En la etapa final, se hace la valoración de acuerdo con el proceso empleado
para la recolección. Así por ejemplo, si el hidróxido de amonio, se recibió
sobre un volumen exactamente medido de un ácido estándar, la titulación se
hace con una base valorada y en presencia de un indicador adecuado, de tal
manera que se determina el ácido que no reaccionó con el hidróxido de
amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidróxido de amonio
producido.
Una variante del método, el hidróxido de amonio se recoge sobre ácido

bórico no valorado y luego se titula directamente el borato de amonio que
se forma, con un ácido estándar.
Determinación de Proteínas
Digestión
Destilación – Arrastre de vapor
VALORACION
Obtención de Porcentaje
de N en la muestra
% N · (Factor)
Obtención de % de Proteínas
DIGESTION
Muestra:
- Tamizada
Muestra
- Secada a 105ºC
-Pesada y transferida
cuantitativamente al tubo de
digestión.
Pesar y transferir
Cuantitativamente al tubo
de digestión
5 gr. K2SO4
0,4 gr. Catalizador Selenio
12 ml H2SO4 conc.
2 ó 3 esferas
Digestión por arrastre de vapor:
Set 1: 150ºC a 30 min.
Set 2: 420ºC a 30 min.
Enfriar a 50-60ºC
DESTILACIÓN
Colocar el tubo de digestión

En el destilador de vapor
Agregar 50 ml de
NaOH 35% - 40%
Colectar 100 ml de destilado
(Salida de Destilador)
Recibir en 25 ml de H3BO3 4%
Retirar Erlenmeyer Titular con HCl 0,1 N

de recolección Indicador Mixto
Violeta rojizo a verde

CALCULO Y EXPRESION DE RESULTADOS
% Proteína = 1. 4 x N x V x factor
m
Donde:
N: normalidad del ácido sulfúrico

V: Volumen gastado de ácido sulfúrico en la titulación
m: masa de la muestra
factor:
6.25: para carne, pescado, huevo, leguminosas y proteínas en general.
5.7 : para cereales y derivados de soya.
6.38: leche
5.55: gelatina
5.95: arroz
Se indicará en el informe : identificación de la muestra, factor utilizado y

resultado obtenido con 2 decimales.
Repetibilidad. La diferencia entre 2 resultado no debe ser superior a un 2%
del promedio.
Factores de conversión de Nitrógeno a proteínas según método Kjeldahl:
Factor Alimentos
5,30 Semillas oleaginosas, frutas con cáscara y derivados

5,55 Gelatina
5,70 Trigo y derivados, fideos, pan
5,71 Soya y derivados
5,77 Panes de diversas harinas
5,88 Avena, cebada, centeno y derivados, productos integrales
5,95 Arroz y derivados
6,25 Carnes, pescados, huevos, maíz y derivados, verduras, frutas
(excepto las con cáscaras), leguminosas (excepto Soya), levaduras
y derivados.
6,31 Afrecho
6,34 Leche y derivados (suero, mantequilla, queso), aceites y grasas
METODO DE DUMAS
La muestra, finamente molida y pudiendo pesar hasta 3 g, se coloca en un
pequeño recipiente de estaño o en una cápsula especial de porcelana.
Después de purgar el nitrógeno atmosférico, se calcina a una temperatura entre

850 y 1.400°C en presencia de oxígeno.
Los productos de la combustión (dióxido de carbono, óxidos de azufre y agua)

son adsorbidos selectivamente en columnas, mientras que los óxidos de
nitrógeno se reducen catalíticamente en presencia de cobre a gas nitrógeno que
será cuantificado en un detector de conductividad térmica.
El equipo debe ser calibrado diariamente con ácido EDTA como patrón. El
equivalente en «proteína bruta» se calcula, como en el método Kjeldahl, a partir
de los datos de nitrógeno.
La automatización del equipo permite realizar rápidamente las tres fases del
ciclo analítico: purga, combustión y análisis.
Existe una estrecha correlación entre este método y el método Kjeldahl: el
método de combustión proporciona resultados ligeramente superiores (+
0,04%) a los del Kjeldahl, en donde los nitritos no se determinan.
El método de Dumas se aplica a los productos lácteos (Jacob et al, 1995),

cárnicos King-Brink y Sebranek, 1993; Grundig, 1994; Pezzani et al, 1994),
cereales y oleaginosas (Bicsak, 1993; Daun y De Clercq, 1994) y en la
industria cervecera (American Society of Brewing Chemist, 1992 y 1993;
Buckee, 1994; Baccanti et al, 1992).
Basado en el mismo principio que el método de Dumas, la

piroquimiluminiscencia permite cuantificar el nitrógeno total (Gorimar et al,
1984; Uhlenbrock et al., 1993). A 1.000°C el nitrógeno orgánico, tras pirólisis
oxidativa, sigue el siguiente esquema de reacciones:
R-NH2 + O2 → NO + productos de combustión

El NO, en contacto con el ozono, da dióxido de nitrógeno,
metaestable, que emite un fotón:
NO + O3 → NO2* + O2 → NO2 + O2 + hv
La emisión es proporcional a la cantidad inicial de nitrógeno. La señal

específica es medida cuantitativamente y amplificada por un
fotomultiplicador.
El análisis de muestras líquidas requiere de 30 a 45 segundos y el de

los productos sólidos, de 5 a 10 minutos.
El contenido de nitrógeno se convierte en proteína bruta considerando que
la totalidad del nitrógeno está en forma proteica. La conversión del nitrógeno
(Kjeldahl o Dumas) en proteína se realiza multiplicando por un coeficiente
basado en el porcentaje de nitrógeno en la proteína.
Salvo casos particulares (Tabla 3.1), se usa un factor de 6,25 porque

muchas de las proteínas contienen un 16% de nitrógeno (16 g x 6,25 = 100 g).
Si el porcentaje de nitrógeno excede el 16% (abundancia de aminoácidos
básicos o amidas) el factor es inferior a 6,25 y viceversa. En todos los casos es
necesario determinar el factor que se desea emplear.
De esta forma se obtiene un cantidad de proteína llamada «bruta» o «total»

para distinguirla de una medida real y directa de las fracciones proteicas que
contiene la muestra.
Tabla 3.1 Factor de conversión que aplicamos para obtener la tasa de
proteína bruta a partir del nitrógeno total (Kjeldahl o Dumas).
Factor por defecto 6,25
Factor específico
Productos animales huevos, carne 6,25
leche y derivados 6,38
gelatina 5,35
Productos vegetales cereales trigo: grano entero 5,83

almendra 5,70
germen 5,80
salvado 6,31
avena, mijo, cebada 5,83
maíz 6,25
arroz 5,95
centeno 5,83
sorgo 6,25
leguminosas cacahuetes 5,46

judías y guisantes 6,25
soja 5,71
frutos secos almendras 5,18

y gra s 5,30
algodón, lino 5,30
girasol, sésamo 5,30
VENTAJAS RESPECTO DEL MÉTODO KJELDAHL
a) SEGURIDAD
No utiliza ácidos calientes y/o corrosivos ni catalizadores tóxicos como el
antiguo método Kjeldahl.
Evita exponer sus operadores a peligros, quemaduras o accidentes.
No hay manejo de material de vidrio.
b) ECOLÓGICO
No utiliza sustancias tóxicas
No hay necesidad de gestión de residuos.
Evita stock y bodega especial para sustancias corrosivas
Cumple y excede cualquier legislación ambiental vigente
c) MÉTODO de ANÁLISIS PRIMARIO

AprobadoAOAC
No requiere calibraciones secundarias y costosas
Se calibra fácilmente con sustancias puras (EDTA)
d) PRODUCTIVIDAD
Realiza un análisis cada 4 minutos.
El modelo automático de carga de 30 muestras expandible a 120, puede
operar 8 hrs consecutivas sin intervención del operador.
e) COSTOS
Un análisis DUMAS tiene 7 veces menos costo que un análisis por
digestión Kjeldahl.
Reducido costo de mantenimiento anual y bajo índice de recambio de
partes.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR ANÁLISIS INSTRUMENTAL
https://www.news-medical.net/life-sciences/What-are-Fluorescent-Proteins-(Spanish).aspx
https://desayunoconfotones.org/2014/07/17/el-paisaje-celular-3-de-3/
Revisar linkografía:
Actividad de clase.
Realizar una comparación entre los distintos métodos revisados para la
determinación de proteínas en alimentos:
- Nombre del método.

- Fundamento
- Aplicaciones.
-Ventajas y desventajas

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¿qué recordamos de las proteínas?

Las proteínas constituyen un grupo de biomoléculas muy importante,

Conocer los contenidos de proteínas presentes en los tejidos, ha sido

Existen varios métodos mediante los cuales se puede determinar el

El método de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son:

En la primera etapa, el hidrógeno y el oxígeno proteico, son

Se han desarrollado diferentes variantes en las cuales cambia

En la etapa siguiente, mediante la acción de

Cuando la valoración se va a efectuar por

Una variante utilizada comúnmente, consiste

Una variante del método, el hidróxido de amonio se recoge sobre ácido

Destilación – Arrastre de vapor

Colocar el tubo de digestión

Retirar Erlenmeyer Titular con HCl 0,1 N

Violeta rojizo a verde

N: normalidad del ácido sulfúrico

Se indicará en el informe : identificación de la muestra, factor utilizado y

5,30 Semillas oleaginosas, frutas con cáscara y derivados

Después de purgar el nitrógeno atmosférico, se calcina a una temperatura entre

Los productos de la combustión (dióxido de carbono, óxidos de azufre y agua)

El método de Dumas se aplica a los productos lácteos (Jacob et al, 1995),

Basado en el mismo principio que el método de Dumas, la

R-NH2 + O2 → NO + productos de combustión

La emisión es proporcional a la cantidad inicial de nitrógeno. La señal

El análisis de muestras líquidas requiere de 30 a 45 segundos y el de

Salvo casos particulares (Tabla 3.1), se usa un factor de 6,25 porque

De esta forma se obtiene un cantidad de proteína llamada «bruta» o «total»

Productos vegetales cereales trigo: grano entero 5,83

leguminosas cacahuetes 5,46

frutos secos almendras 5,18

c) MÉTODO de ANÁLISIS PRIMARIO

- Nombre del método.

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