PRACTICA II - Perfil Acidos Grasos

Universidad de Cartagena Código: LAI-GC-001
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Versión : 000

Laboratorio de Análisis Instrumental Fecha : 29-07-2019
Prácticas de Laboratorio
Cromatografía de gases – Espectrometría de masas Página : 1 de 6
PRACTICA II: Identificación del perfil de ácidos grasos en muestras de aceite

comercial.
Objetivos
1. Identificar en un cromatograma, los componentes de un estándar de ácidos

grasos usando la base de datos de NIST mediante los espectros de masas.
2. Analizar el perfil de ácidos grasos de muestras de aceite comercial.
3. Calcular el porcentaje de ácidos grasos en muestras comerciales.
Introducción
En la cromatografía de gases, el puerto de inyección del instrumento es la zona

donde se introduce la muestra al cromatógrafo, además de vaporizarla y arrastrarla
a la columna con ayuda del gas de arrastre. La inyección debe hacerse en el menor
tiempo posible y la evaporación debe ser efectiva, es decir la temperatura del puerto
de inyección debe ser superior a la del punto de ebullición del solvente y también a
la temperatura de los compuestos a analizar. La muestra se introduce en el puerto
de inyección mediante una micro jeringa de 5 o 10 µl, de manera manual o de forma
automática mediante un automuestreador (un carrusel de muestras que permite
realizar secuencias cíclicas de muestras con lavados programados de la jeringa).
Existen varios tipos de puertos de inyección adaptados a diferentes aplicaciones,
entre los cuales se tienen: Puertos de Inyección dividida / sin división (Split/Splitless
Injection, S/SL), inyección pulsada dividida / pulsada sin división, inyección de
vaporización programada de temperatura (Programmed Temperature Vaporizing.
PTV), inyección de gran volumen (Large Volume Injection, LVI), Inyección de
enfriamiento en columna (Cool-On-Column Injection, CoC), Inyección de espacio de
cabeza con trampa criogénica (Headspace-CryoTrap Injection, HCTI) para análisis
de gases e inyección por desorción térmica (TD) para compuestos orgánicos
volátiles.
Uno de los inyectores más utilizados por su uso general y facilidad de uso es el
inyector Split/Splitless.
Inyector Split/Splitless. (Split: Inyección con división de flujo - Splitless:

Inyección sin división de flujo). Cuando se utilizan columnas capilares de poca
capacidad de muestra, en la que volúmenes muy pequeños pueden saturar la
columna, suelen utilizarse inyectores de este tipo. En el modo de inyección split, la
muestra se diluye con el gas de arrastre o portador, un caudal grande del gas llega
a la cámara de vaporización y se mezcla con la muestra inyectada, una válvula de
fuga se ajusta normalmente entre 50-100 mL/min y divide este caudal en dos
fracciones desiguales, la mayor es desechada de la cámara de inyección y con ella
Elaborado por : K. Mejia Grau Revisado por : B. Jaramillo y R. Fernández Aprobado por : B. Johnson y A. Marrugo
la mayor parte de la muestra que se introdujo. Es decir que solo una parte entra en
la columna. El resto de la muestra sale por el respiradero de purga. El modo split se
utiliza generalmente para analizar componentes mayoritarios de muestra o para
analizar muestras que, por su estado físico, no se pueden diluir antes de la
inyección. Además, en modo split la resolución puede ser más alta porque, evita
saturaciones y formación de «colas» en los picos.
El modo splitless funciona sin realizar división del caudal, en este modo las muestras
casi siempre se encuentran muy diluidas y se inyecta lentamente el contenido de la
microjeringa haciendo que la válvula de división se encuentre cerrada durante 0.5 -
1 minuto para que los compuestos vaporizados con el solvente se concentren en el
inicio de la columna. Este modo de inyección se hace a una temperatura más baja
al inicio para que el solvente anteceda los compuestos en la columna. Cuando se
abre la válvula de división se elimina del inyector el exceso de muestra.
Modo Split Modo Splitless

Figura 2. Puerto de Inyección Split / Splitless
Procedimiento experimental
Equipo
El instrumento utilizado para realizar este ensayo es un cromatógrafo de gases
7890A acoplado a un espectrómetro de masas 5975C, marca Agilent Technologies,
equipado con inyector Split/splitless, automuestreador ALS G4513A y software de
operación Chemstation.
Condiciones instrumentales GC-MS

Cromatógrafo de gases Espectrómetro de masas
 Volumen de inyección: 1 µL Inicio: 5.00 min
 Puerto de Inyección: Split/ Splitless Modo: Full Scan
 Modo de operación: splitless Rango de masas: 50-400 m/z
 Temperatura del Puerto de Inyección: 260°C Línea de transferencia: 300°C
 Gas de arrastre: Helio Fuentes de iones: 260°C
 Flujo del gas de arrastre: 1.5 ml/min a flujo constante
Programación de temperaturas del Horno
# Rampa Temperatura Tiempo
Inicial 80°C 0 min
1 7°C/min 220°C 20 min
Materiales
 Viales para cromatografía de 2.0 mL
 Balón aforado de 10 + 0.04 mL
 Dos vasos de precipitado de 50 mL
 Tubos de ensayo con tapa
 Micro pipeta 20- 200 µL
 Micro pipeta 100- 1000 µL
 Pipetas Pasteur
Reactivos
 Estándar de esteres metílicos de ácidos grasos – FAME(FAMQ-005)
 N-Heptano (99.9 %)
 Solución de BF3 (14 % en metanol)
 Ácido clorhídrico 37%
 Hidróxido de sodio, grado analitico
 Metanol, grado analítico
Identificación de ácidos grasos en estándar de referencia

Estándar de referencia FAME (Fatty acid methyl esters) o esteres metílicos de
ácidos grasos. El estándar seleccionado es FAMQ – 005. Este estándar viene en
una ampolla de 1 mL y se ha preparado a una concentración de 80 µg/mL. La Tabla
1, muestra los componentes del estándar FAMQ – 005 y la Figura 3, muestra el
cromatograma del estándar FAMQ – 005.
Tabla 1. Componentes de estándar FAMQ-005

# Analito Número Concentración Peso Tiempo de
CAS molecular retención
1 Éster metílico del ácido butírico 623-42-7 400 µg / mL
2 Éster metílico del ácido caproico 106-70-7 400 µg / mL
3 Éster metílico del ácido caprílico 111-11-5 400 µg / mL
4 Éster metílico del ácido cáprico 110-42-9 400 µg / mL
5 Éster metílico del ácido undecanoico 1731-86-8 200 µg / mL
6 Éster metílico del ácido láurico 111-82-0 400 µg / mL
7 Éster metílico del ácido tridecanoico 1731-88-0 200 µg / mL
8 Éster metílico del ácido mirístico 124-10-7 400 µg / mL
9 Éster metílico del ácido miristoleico 56219-06-8 200 µg / mL
10 Éster metílico del ácido pentadecanoico 7132-64-1 200 µg / mL
11 Éster metílico del ácido cis-10-pentadecenoico 90176-52-6 200 µg / mL
12 Éster metílico del ácido palmítico 112-39-0 600 µg / mL
13 Éster metílico del ácido palmitoleico 1120-25-8 200 µg / mL
14 Éster metílico del ácido heptadecanoico 1731-92-6 200 µg / mL
15 éster metílico del ácido cis-10-heptadecenoico 77745-60-9 200 µg / mL
16 Éster metílico del ácido esteárico 112-61-8 400 µg / mL
17 Éster metílico del ácido elaídico 2462-84-2 200 µg / mL
18 Éster metílico del ácido oleico 112-62-9 400 µg / mL
19 Éster metílico del ácido linolelaídico 2566-97-4 200 µg / mL
20 Éster metílico del ácido linoleico 112-63-0 200 µg / mL
21 Éster metílico del ácido araquídico 1120-28-1 400 µg / mL
22 Éster metílico del ácido g-linolénico 16326-32-2 200 µg / mL
23 éster metílico del ácido cis-11-eicosenoico 2390-09-2 200 µg / mL
24 Éster metílico del ácido linolénico 301-00-8 200 µg / mL
25 Éster metílico del ácido heneicosanoico 6064-90-0 200 µg / mL
26 Éster metílico del ácido cis-11,14-eicosadienoico 2463-02-7 200 µg / mL
27 Éster metílico del ácido beenico 929-77-1 400 µg / mL
28 Metil cis-8,11,14-eicosatrienoato 21061-10-9 200 µg / mL
29 Éster metílico del ácido erúcico 1120-34-9 200 µg / mL
30 Éster metílico del ácido cis-11-14-17- 55682-88-7 200 µg / mL
eicosatrienoico
31 Éster metílico del ácido araquidónico 2566-89-4 200 µg / mL
32 Éster metílico del ácido tricosanoico 2433-97-8 200 µg / mL
33 Éster metílico del ácido cis-13,16- 61012-47-3 200 µg / mL
docosadienoico
34 Éster metílico del ácido lignocérico 2442-49-1 400 µg / mL
35 Éster metílico del ácido cis-5,8,11,14,17- 2734-47-6 200 µg / mL
eicosapentaenoico
36 Éster metílico del ácido nervioso 2733-88-2 200 µg / mL
37 Éster metílico del ácido cis-4,7,10,13,16,19- 301-01-9 200 µg / mL
docosahexaenoico
Figura 3. Cromatograma de estándar FAMQ – 005

Solución intermedia: Prepare una solución de 10 µg/mL, para esto tome 125 µL del
estándar de 80 µg/mL con ayuda de una micropipeta y llévelas a un vial limpio,
complete hasta 1000 µL con heptano.
Solución de trabajo: Tome 300 µL de la solución de 10 µg/mL y transferirlos a un

vial complete volumen hasta 1000 µL, esta solución tendrá una concentración final
de 3 µg/mL.
Extracción de ácidos grasos en muestras de aceite comercial

Técnica de extracción 1
En un tubo de ensayo se adicionan 25 mg de muestra de aceite y 1 ml de trifloruro
de boro (BF3) (solución al 14% en metanol), se calienta en un baño de maría por 60
minutos a 60 °C y se deja en reposo a temperatura ambiente, luego se adiciona 1
ml de heptano y un 1 ml de agua destilada. Se agita la mezcla en un vórtex, para
mejorar separación de la fase orgánica que contiene los esteres metílicos de los
ácidos grasos de la fase acuosa. Se retira el 1 ml de la fase orgánica superior
(FAME) del tubo de ensayo y se le agrega una pequeña cantidad de sulfato de sodio
anhídrido para retirar trazas de humedad. Este extracto se conserva para su
análisis.
Técnica de extracción 2
En un tubo de ensayo con tapa, se adicionan 100 mg de muestra de aceite y 3 ml
de NaOH (solución al 5% en metanol), se calienta en un baño de maría por 10
minutos a 95°C y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos,
luego se adicionan 4 ml HCl al 37% dejando reposar durante unos minutos. Llevar
el tubo nuevamente a baño de maría durante 10 minutos a 95°C y dejar en reposo
5 minutos, todos los calentamientos a baño de maría deben realizarse con la tapa
del tubo semi cerrada para evitar que se volatilicen los solventes. Se adiciona 1 mL
de heptano y se mezcla en un vórtex, para mejorar separación de la fase orgánica
que contiene los esteres metílicos de los ácidos grasos de la fase acuosa. Se retira
1 ml de la fase orgánica superior (FAME) del tubo de ensayo y se le agrega una
pequeña cantidad de sulfato de sodio anhídrido para retirar trazas de humedad.
Este extracto se conserva para su análisis.
Cálculos y preguntas
1. Complete la Tabla 1. Con los tiempos de retención de cada uno de los ácidos
grasos presentes en el estándar, para identificarlos debe conocer cuál es
peso molecular de cada uno.
2. Inyecte las muestras de aceite de oliva, girasol, soja y una muestra problema,
compare los cromatogramas. Indique cuales son los porcentajes de ácidos
grasos más abundantes en cada muestra, compárelos con referencias
bibliográficas e indique si la cantidad determinada por usted está de acuerdo
con la reportado.
3. Indique cuales son a) Los ácidos grasos saturados e insaturados, b) mono

insaturados y poliinsaturados, c) Cuales son la omega 3, 6 y 9 presentes en
las muestras de referencia y muestra problema.
4. Realice un cuadro comparativo de los beneficios y perjuicios que puede

causar en la salud humana el consumo continuo de diferentes tipos ácidos
grasos, por ejemplo, a) Los ácidos grasos saturados e insaturados y b)
omega 3, 6 y 9.

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1. Identificar en un cromatograma, los componentes de un estándar de ácidos

En la cromatografía de gases, el puerto de inyección del instrumento es la zona

Inyector Split/Splitless. (Split: Inyección con división de flujo - Splitless:

Modo Split Modo Splitless

Condiciones instrumentales GC-MS

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Tabla 1. Componentes de estándar FAMQ-005

Figura 3. Cromatograma de estándar FAMQ – 005

Solución de trabajo: Tome 300 µL de la solución de 10 µg/mL y transferirlos a un

Extracción de ácidos grasos en muestras de aceite comercial

3. Indique cuales son a) Los ácidos grasos saturados e insaturados, b) mono

4. Realice un cuadro comparativo de los beneficios y perjuicios que puede

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