Deber Enzimo Paraestudiar

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ENZIMOLOGÍA
NOMBRES: Calderón Evelyn NIVEL: 5to Competencias

Staël Carina
FECHA: 24/05/2011
1.- Una enzima hipotética tiene actividad con respecto a la hidrólisis de un sustrato neutro, y no es
afectada por un amplio margen de pH. Sin embargo, muestra actividad en un margen más
estrecho de pH cuando se usa un sustrato alternativo que contiene un grupo imidazol. Se llevaron
a cabo un total de 50 ensayos usando 10 concentraciones distintitas de sustrato con una cantidad
fija de enzima, a 5 valores de pH. En cada valor de pH la enzima dio gráficas lineales de Lineweaver
Burk, y las estimaciones de Km y Vmáx son las siguientes:
pH Km (mmol/L) Vmáx (µmol/L/min)
8.0 1.1 75
7.5 1.3 80
7.0 2.0 77
6.5 4.2 83
6.0 11.0 75
a) Descríbase el efecto de la variación del pH sobre Km y Vmáx.

b) ¿Qué significa el hecho de que con un sustrato no cargado, casi no se altere la actividad de una
enzima a valores de pH entre 6-8?
c) Propóngase un esquema de reacción que sea coherente con los resultados.
d) Calcúlese la constante de disociación relevante de hidrógeno reactivo complejo.
RESOLUCIÓN
a) Observando la tabla dada por el ejercicio, se puede ver que a medida que el pH disminuye, Km
aumenta y Vmáx se mantiene en un rango constante, por lo tanto se trataría de un caso de
ionización de sustrato.
b) Significa que, ya que al no tener grupos que cedan o donen electrones, no se ve afectado por los
cambios del pH en ese rango, con lo que la enzima reaccionará de igual forma con el sustrato, a
cualquier valor de pH dentro del rango establecido.
c)
d) pH=-log[H+]
pH [H+] [H+] Km
0,0000000100 1,1
8 10-8
0,0000000316 1,3
7.5 3.162*10-8 0,0000001000 2
7 10-7 0,0000003162 4,2
0,0000010000 11
6.5 3.162*10-7
6 10-6
Km real cuando [H+]=0, reemplazando en la ecuación de la recta se tiene que:

Km=1.0021
EJERCICIOS DE “EFECTO DE PH”
2.- La ribonucleasa se inactiva pro fotooxidacion, en presencia de azul de metileno. Esta
inactivación es un fenómeno de orden 1, del que se puede medir la constante de velocidad, K inac.
Esta constante de velocidad se ha determinado a diferentes pH.
pH Kinact min-1
4 0.0033
5 0.0315
5.5 0.088
6 0.205
6.5 0.35
7 0.46
8 0.52
Cuál es el pK del grupo cuya fotooxidación provoca una inactivación del enzima? ¿Reacciona en
forma protonizada o desprotonizada?
RESOLUCIÓN
H+ Kinact H+ Kinact min-1
0.0001 0.00000033 0.0033
0.00001 3.15E-07 0.0315
3.1623E-06 2.7828E-07 0.088
0.000001 2.05E-07 0.205
3.1623E-07 1.1068E-07 0.35
0.0000001 4.6E-08 0.46
0.00000001 5.2E-09 0.52
Pendiente
-1587590.689
6.29885E-07
3.- Los parámetros cinéticos de la hidrolisis enzimática del éster etílico de la acetil tirosina pro una
proteasa se han estudiado a diferentes valores de pH.
pH Kcat (103 seg-1) Km 10-5 M

4 0.005 0.32
5 0.05 0.32
6 0.49 0.36
7 3.85 0.63
8 12.2 1.3
9 15.5 1.56
10 16 1.6
Determinar el pK del grupo que se ioniza en el enzima libre. ¿En qué forma (protonizada o
desprotonizada) condiciona este grupo la actividad de la enzima?
H+
(Kcat/Km)H+ Kcat/KM
0.0001 156.25 1562500
0.00001 156.25 15625000
0.000001 136.111111 136111111
0.0000001 61.1111111 611111111
0.00000001 9.38461538 938461538
1E-09 0.99358974 993589744
1E-10 0.1 1000000000
Pendiente
-6342268.81
1.57672E-07
4.- El efecto del pH sobre el comportamiento de una enzima puede describirse por el esquema.
Se han medido diferentes pH, V M (expresado en 10-4 M/min) y Km (expresada en mM) la
concetracon de enzima fue 1 μmol.
pH VM Km
3 0.057 1
4 0.537 1.07
5 3.21 1.45
6 6.4 1.89
7 7.05 1.99
8 6.55 2
9 3.6 2
10 0.655 2
11 0.07 2
1) Determinar Ka, Kb, K’a, k’b

pH log(V/Vmax)
3 -2.09231426
4 -1.11821483
5 -0.34168408
6 -0.04200914
7 0
8 -0.03194782
9 -0.29188662
10 -1.03194782
11 -2.00309108
[H+] 1/Vm
0.001 175438.596
0.0001 18621.9739
0.00001 3115.2648
0.000001 1562.5
0.0000001 1418.43972
y=0
x=-7.74*10-6=-K
pK=-log(7.74*10-6)
pK’a = 5.11
Zona básica
1/[H+] 1/Vm
10000000 1418.43972
100000000 1526.71756
1000000000 2777.77778
1E+10 15267.1756
1E+11 142857.143
y= 1*10-6x + 1322
y=0 x=-9339917975=-K
pK=log(9339917975)
pK’b= 5.11
2) Calcular ks en seg-1
Ks= kcat
Vmax= kcat[E]
Kcat= 7.05 *104 M / 1 *10-6 mol. min
Kcat= *7.05 *1010 M/mol.min
5.- La velocidad de hidrólisis de la benzoil-glicil-glicil-L-fenilalanina, por carboxipeptidasa A varía
con el pH de la experiencia. Al estudiar las variaciones de la constante catalítica en función del pH
se ha podido determinar el pK de un grupo cuya ionización modifica la veñocidad de reacción. L
atabla siguiente resume las experiencias.
pH Kcat(min-1)
8.2 1170
7.8 1145
7.5 1115
7.3 1080
6.9 955
6.7 860
6.3 610
6.1 475
5.8 300
5.6 205
5.35 125
5.2 92
5.05 67
4.95 54
¿En qué estado de ionización debe hallarse presente el grupo para que la enzima sea activa?
Determinar el pK de este grupo.
H 1/kcat
6.30957E-09 0.0008547
1.58489E-08 0.00087336
3.16228E-08 0.00089686
5.01187E-08 0.00092593
1.25893E-07 0.00104712
1.99526E-07 0.00116279
5.01187E-07 0.00163934
7.94328E-07 0.00210526
1.58489E-06 0.00333333
2.51189E-06 0.00487805
4.46684E-06 0.008
5.01187E-06 0.01086957
8.91251E-06 0.01492537
1.12202E-05 0.01851852
x=0
y=0.0009
Pendiente
-1608.7
5.59458E-07

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a) Descríbase el efecto de la variación del pH sobre Km y Vmáx.

Km real cuando [H+]=0, reemplazando en la ecuación de la recta se tiene que:

pH Kcat (103 seg-1) Km 10-5 M

1) Determinar Ka, Kb, K’a, k’b

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