PRACTICA N°4 AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS

María P. Gamarra M, Keren E. Robles,

Alejandra L. Rodríguez
Correos: mariagamarra396@gmail.com
Kerenvaleth@gmail.com
alejandralopezrodriguez791@gmail.com
Departamento de Biología
Universidad de Sucre, Sincelejo
ABSTRACT
In this report several experiments were were carried out which resulted in a quite extensive
practice. We started by processing and macerating spinach leaves with a pH buffer in order to
break the structures of the plant cells, then we proceeded with the extraction of chloroplasts, after
macerating the leaves we proceeded to strain the sample, With this it was possible to extract a
more homogeneous solution and with less fragments, several solutions were added to the sample
and put in a centrifuge with the objective of precipitating the heavier components, thus creating a
button containing the chloroplasts and some organelles. Later, the samples were extracted and
then stained and observed under the microscope.
Keywords :chloroplasts, macerate, processing, solutions, centrifuge, microscopy

RESUMEN
En este informe se realizaron varios experimentos cuales dieron como resultado que la práctica
fuera bastante extensa. Se empezó procesando y macerando hojas de espinaca con un
amortiguador de pH con la finalidad de romper las estructuras de las células Vegetales,
seguidamente se procedió con la extracción de los cloroplastos, luego de macerar las hojas se
procedió a colar la muestra, con esto se logró extraer una solución más homogénea y con menos
fragmentos, a la muestra se le agregaron diversas soluciones y se pusieron en una centrífuga con
el objetivo de que así se precipitaran los componentes más pesados, creando así un botón que
contenía los cloroplastos y algunos orgánulos. Más tarde se extrajeron las muestras para luego
teñirlas y ser observadas en el microscopio.
Palabras clave:cloroplastos, macerar, procesar, soluciones, centrifuga, microscopio

debe a la estructura especial y las propiedades de

INTRODUCCION membrana de los cloroplastos.Estos también son
Los cloroplastos son un componente integral de los orgánulos de las células vegetales que realizan la
cloroplastos; se derivan del endosito estromático fotosíntesis al convertir la energía luminosa en
de Phaseolus coccineus. La plasmólisis permite a energía química (ATP) y producir energía reducida
los científicos aislar los cloroplastos sin afectar al (NADPH). El aislamiento de cloroplastos y la
resto de la célula. Por lo tanto, es una forma evaluación de la actividad fotosintética en
confiable de estudiar las células vegetales sin condiciones in vitro ha sido una tarea desafiante
dañarlas.Los estudios han demostrado que la debido a las alteraciones estructurales y
contaminación por metales pesados y bacterias funcionales que fufren los cloroplastos y la
durante el procesamiento se reduce presencia de fracciones celulares contaminantes.
significativamente con los cloroplastos. Esto se El proceso de aislamiento de celulas llamado
plasmolisis tambien se encuentra presente en los
cloroplastos y sus usos en el metabolismo de las Cloroplastos: Estos organelos se caracterizan por
plantas contener una doble membrana que las define.
Dentro de los cloroplastos es el estroma,que
OBJETIVO contiene los sacos aplanados llamados tilacoides.
PRINCIPAL Y/O En el talacoides las membranas son enzimas que
PREGUNTA DE capturan la energía de la luz necesaria para el
INVESTIGACION proceso de fotosíntesis, que se lleva a cabo en dos
fases: claros y oscuros. Se realiza la fase de la luz
Conocer la importancia del aislamiento de en el tolacoides. Al final del gas oxígeno
cloroplastos en la biologia. producido, que se libera a la atmósfera y la energía
Establecer para que se pueden utilizar los cloroplastos en forma de moléculas de ATP.
aislados
Reconocer los diferentes colorantes utilizados para la La fase oscura se produce en el estoma sin luz,
observacion de cloroplastos y sus efecto aunque se realiza su presencia; al final de la fase,
hay un carbohidatro simple llamado Glucosa
MARCO TEORICO Buffer fosfato: Esta solución se ocupa para
Sudan III: Se usa en el laboratorio para el
mantener a las células en condiciones fisiológicas
reconocimiento de lipidos, por lo tanto es soluble en
estables durante periodos cortos, sí como la
ellas, predominantemente utilizado para colorear preparación de tratamientos, administración
triglicéridos en secciones congeladas de agentes xenobióticos o la inoculación de células
micrótomos, pero también pueden colorear cancerígenes en ratones. La capacidad
algunos lípidos en secciones con parafina amortiguadora es proporcionada por las sales de
Eosina: Método de laboratorio de uso frecuente en fosfatos.
el que se utilizan dos tintes llamados hematoxilina METODOLOGIA EXPERIMENTAL
y eosina para observar mejor las diferentes partes Para esta practica primero comenzamos cortando
de la célula al microscopio. La eosina tiñe de rosa 10 hojas de espinacas, mientras que un grupo de
anaranjado o rosado el citoplasma, el colágeno, el estudiantes la agrego a un mortero macerándolas
tejido conjuntivo y otras estructuras ue rodean y en este, el otro grupo las llevo a un procesador
sostienen la célula. La tinción con hematoxilina y para así triturarlas, al mismo tiempo se les agrego
eosina ayuda a identificar diferentes tipos de 50ml de amortiguador de fosfato, luego de que en
células y tejidos, y a obtener información ambos grupos tuvieran la espinaca totalmente
importante sobre las características, la forma y la molida se procedió a filtrarla hasta recuperar 10
estructura celular de una muestra de tejido. Se usa ml de ambos, procedimos a centrifugar a 1000g
para el diagnóstico de enfermedades como el por min, luego se retiro el sobrenadante
cáncer. manteniendo así la pastilla que contenía los
cloroplastos y y los núcleos, se le agrego la
Azul de metileno: El azul de metileno o cloruro de solución buffer fosfato y se volvió a centrifugar
metiltioninio es un compuesto que, a dosis bajas, pero esta vez a 200g por 5 minutos y se retiró el
acelera la conversión de metahemoglobina en sobrenadante con los cloroplastos con mucho
hemoglobina. A dosis altas convierte el hierro cuidado se adiciono en la parte superior 3 ml del
ferroso en su forma férrica, por lo que facilita la gradiente de sacarosa 60% 40% 20% y 10% para
conversión de hemoglobina en metahemoglobina. asimismo proceder a centrifugar a 400g por 15
Es un colorante empleado como tintura para minutos, Por medio de una pipeta se retiró
pigmentar algunas partes del cuerpo de una cuidadosamente cada una de las bandas que se
persona, antes o durante la realización de una formaron en el gradiente de sacarosa y se colocó
cirugía. en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, sucesivamente se
agrego 1 ml de amortiguador fosfato y se agito
gentilmente volviéndolos a llevar a centrifugación
a 400g por 3 min, se Re suspendió la pastilla en 8. La eosina demuestra una gama alta de
amortiguador de fosfato y se colocó en los tubos características citoplasmaticas, nuclerares y de
eppendorf 200 microlitros de: azul de metileno, matriz extracelular
Eosina y sudan 3, cabe destacar que se hicieron 9. Las celulas de la albaca presentan grasas debido
dos muestras de cada uno el cual contenía la a que el sudan III es un colorante utilizado para
espinaca macerada y procesada, a excepción del detectar específicamente grasas ya que es
azul de metileno donde se hicieron cuatro insoluble en agua pero soluble en las grasas.
muestras debido a que se usaron dos
concentraciones de este al 20% y al 60%, primero
se adiciono la Eosina al 40 % en ambos tubos, al CONCLUSIONES
macerado y procesado, luego el azul de metileno
Los procedimientos hechos en clase son
dando en total 4 tubos, 2 macerado y procesado
estrictamente necesarios para la correcta
con un 20% de la concentración y otros dos de
observación de cloroplastos ya que al ser
estos pero con un 60% de la concentración, por
fundamental el rompimiento de la pared celular y
ultimo fue el sudan 3 donde se adiciono a los dos
de la membrana esto conlleva a que la práctica sea
tubos, posteriormente estos fueron llevados a la
bastante extensa
incubadora por 5 min, y luego se puso al mechero.
Se usa una solucion Buffer fosfato para mantener
ANALISIS DE RESULTADOS el pH controlado para el correcto aislamiento de
cloroplastos
1. La diferencia de color entre las hojas de Es necesario una centrífuga para la extracción de
espinaca del procesador con las maceradas de estos organelos debido a que cuando esta fuerza
forma mecanica,es debido a que el procesador de es ejercida la parte más soluble va a arriba y la
alimentos es un instrumento que sirve para más densa o pesada se precipita hacia abajo,
transformar alimentos de forma eficaz, en cambio asimismo la separacion de esto es mas afectiva al
el hacerlo mecanicamente es mas trabajoso. momento de ser obsevada.
2. La solucion buffer fosfato es un amortiguador
que funciona para bajar la concentracion de pH. BIBLIOGRAFIA
3. Las condiciones de luz debil es para minimizar https://www.uaeh.edu.mx/scige/boletin/prepa2/
la fotodestruccion de la clorofila y asi producir un n1/p1.html
efecto de bioluminiscencia debido a una reaccion https://www.aeped.es/comite-medicamentos/
quimica. pediamecum/azul-metileno
4. La cromatografia es un proceso que describe un https://abclaboratorios.com/producto/sudan-iii-
procedimiento químico en el que se separa na colorante-2/
mezcla en su sus componentes individuales https://www.elgencurioso.com/diccionario/
mediante una fase móvil y una fase estacionaria. plasmolisis/
5. La centrifuga separo las muestras quedando en https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/
fases debido a la fuerza que esta ejerce sobre el Membrana-celula
contenido. https://www.cun.es/diccionario-medico/terminos/
6. La formación de las diferentes bandas de los eosina
gradientes de sacarosa, es debido a la diferencia de https://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-
concentraciones y por la fuerza aplicada por la amortiguadora-de-fosfatos-pbs/
centrifuga.
7. El azul de metileno penetro dentro de las
células y las enzimas de las células vivas lo
decoloran. Mientras que en las células muertas
donde la enzima es inactiva esto no sucede y por
ello permanecen azul.