UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISIS INSTRUMENTAL

PRACTICA DE LABORATORIO

CUANTIFICACIÓN DE FD&C BLUE No.1 EXTRAIDO DE KOOL AID UVA

POR MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Y ESPECTROFOTOMETRÍA

PROFESOR TITULAR:

ABELARDO CHÁVEZ MONTES

ALUMNA:

DIANA LAURA APOLONIO BAHENA

LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

GRUPO 422

SAN NICOLÁS DE LOS GARZA, NUEVO LEÓN MÉXICO

26 de mayo de 2021
 Practica de laboratorio

CUANTIFICACIÓN DE FD&C BLUE No.1 EXTRAIDO DE KOOL- AID UVA POR

MEDIO DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Y ESPECTROFOTOMETRÍA

INTRODUCCIÓN
Keulemans ha definido la cromatografía como un método físico de separación en el
cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales
constituye la fase estacionaria, de gran área superficial, y la otra es un fluido (fase
móvil) que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria.
La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que
actúa como soporte, de gran área superficial. La fase móvil es un fluido (puede ser
gas, líquido o fluido supercrítico) que se usa como portador de la mezcla.
En la cromatografía ocurren dos fenómenos muy importantes y que son
prácticamente los rectores del proceso de separación: la adsorción y la absorción.
La adsorción es la retención de una especie química en los sitios activos de la
superficie de un sólido, quedando delimitado el fenómeno a la superficie que separa
las fases o superficie interfacial.
Esta retención superficial puede ser física o química. La adsorción depende de la
naturaleza de la substancia adsorbida, de la temperatura, de la naturaleza y estado
de subdivisión del adsorbente, y de la concentración.
La absorción es la retención de una especie química por parte de una masa y
depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente
con la misma.
Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos. Según, Giddings,
se puede clasificar la Cromatografía por sus variantes:

• Fase Móvil (puede ser gaseosa, líquida ó fluido supercrítico)

• Fase Estacionaria
• Mecanismo de Retención (tipos de equilibrios implicados en la transferencia de los
solutos entre las fases).
• Forma de Contacto entre las fases (columna ó superficie plana)
• Dimensionalidad
• Escala Física
• Gradientes

La cromatografía en columna es un método físico de separación e identificación en el cual

los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases; una de estas fases
constituye una capa estacionaria de gran área superficial, la otra es un fluido que eluye a
través o a lo largo de la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser un sólido o un
líquido. Mientras que la fase móvil puede ser un líquido, dando origen a un grupo de técnicas

Diana Laura Apolonio Bahena 2075708 27 de mayo de 2021

conocidas como cromatografía líquida (p.ej. cromatografia de líquidos de alta resolución,
CLAR, o del ingles "high performance liquid chromatography", HPLC) o puede ser un gas,
en el cual la técnica fundamental se conoce como cromatografía de gases (del ingles "gas
liquid chromatography", GLC). (Columbia University, 2007).
De este modo, los diferentes tipos de cromatografía se clasifican con base al estado físico
de las dos fases involucradas (líquido-sólido, gas-sólido, líquidolíquido y gas-líquido) y por
el tipo de fenómenos por los cuales los compuestos son retenidos en la fase estacionaria
(adsorción, reparto e intercambio iónico).
En la cromatografía en columna por adsorción (líquido-sólido), la fase estacionaria está
constituida por un sólido adsorbente que se empaqueta en una columna, normalmente de
vidrio, mientras que la fase móvil es un líquido llamado eluyente.
La tendencia que tienen los compuestos de adsorberse sobre la fase sólida retarda su
movimiento, mientras que su afinidad por la fase móvil líquida (polaridad) los mueve a lo
largo de la columna.
Por lo tanto, las propiedades de la fase estacionaria, la polaridad de la fase móvil, la
complejidad y la naturaleza química de la mezcla a separar son algunos factores que deben
tomarse en cuenta para obtener un proceso cromatografíco eficiente. Algunos de los
adsorbentes utilizados en la cromatografia en columna son los siguientes:

Adsorventes:
Alumina (Al203)
Talco (MgO.SiO2 hidratado)
Gel de sílice (ácido silícico)
Almidón
Cal (Ca0)
Celulosa
Magnesia (Mg0)
Polivinilpirrolidona (PVP)
Carbonato de magnesio (MgC03)
Nylon 66
Fosfato de calcio Ca3(P04)2
Carbonato de calcio CaC03
Carbonato de potasio K2C03
Carbonato de sodio Na2C03
Tabla 1. Adsorbentes en orden decreciente de polaridad.
La columna es el lugar donde ocurre la separación. Se dice que es el corazón de un
cromatógrafo, y los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las
columnas son: cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio ó teflón. El relleno puede ser un
sólido, ó un líquido recubriendo un sólido. (Columbia University. 2007)
Factores que Afectan la Eficiencia de una Columna

• Longitud de la Columna
• Diámetro de la Columna (1/4", 1/8", 1/16" de diámetro externo)
• Tamaño de las partículas del relleno
• Naturaleza de las fases

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 • Cantidad de fase estacionaria
• Temperatura de la columna
• Velocidad del gas portador
• Cantidad de muestra inyectada
• Material del cual está elaborada la columna
• Enrollado de la columna

En cromatografía fase normal, el componente menos polar eluye primero, debido a que
relativamente es el que menos interacciona con la fase estacionaria. Mientras que los
compuestos más polares eluyen al último, debido a que interaccionan electrostáticamente
más con la fase estacionaria y sólo serán eluidos de la columna utilizando una fase móvil
lo suficientemente polar como para desplazarlos de la fase estacionaria.
Las etapas necesarias para realizar una cromatografía en columna son (Figura 1):
1- Inyección de la muestra: es el equivalente a sembrar la muestra en la
cromatografía plana, el lugar de inyección será en un extremo de la columna.
2- Desarrollo de la cromatografía: la fase móvil empuja a los analitos obligándolos
a atravesar la fase estacionaria contenida en la columna. Durante este proceso
los analitos se separan dentro de la columna.
3- Elución: en las cromatografías en columna es necesario que los analitos
separados dentro de la columna lleguen a salir de la columna para poder
detectarlos. Se hace circular fase móvil hasta que los analitos se recuperen a la
salida de la columna. Por este motivo muchas veces se nombra a la fase móvil
como “eluyente”.

Figura 1: Representación esquemática de las etapas de una cromatografía en

columna. 1 representa la inyección de la muestra; 2 el desarrollo de la cromatografía
y 3 representa la elución de analitos. (Simpson, M. J. 2019)

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OBJETIVOS
Que el alumno:
Conozca la cromatografía en columna como una técnica de separación de mezclas, sus
características y los factores que en ella intervienen.
Aplique la técnica de cromatografía en columna para separar el colorante FD&C Blue 1
extraído de Kool Aid de uva.
Sea capaz de cuantificar el FD&C Blue 1 empleado en el Kool Aid de uva usando las
técnicas de cromatografía en columna y espectrofotometría.

MATERIAL, EQUIPO Y SUSTANCIAS

1. (1) Columna cromatografía de un centímetro y medio de diámetro
2. (1) Pie Metálico
3. (2) Nueces
4. (2) Pinzas metálicas
5. (1) Balanza analítica
6. (2) Pipetas de 1 a 10 ml
7. (3) Vaso de precipitado de 250 ml
8. (2) Varilla de vidrio
9. (6) Matraz Erlenmeyer de 100 ml
10. (4) Matraz de aforación de 10 ml y 25ml
11. (1) Embudo cónico
12. (1) Pera Richard
13. (1) Vidrio de reloj

Sustancias:
1. Agua Destilada
2. Gel de sílice o Silica Gel
3. Arena de mar
4. Un sobre de kool-Aid sabor Uva de 538 gr.
5. Una disolución de la mezcla uva Kool-Aid en agua al 10% p/v

METODOLOGÍA

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El proceso de cromatografía en columna consta de cuatro etapas.
1. Empaque de la columna con el adsorbente y el eluyente adecuados.
2. Adición a la mezcla a separar dentro de la columna.
3. Elución de la columna hasta lograr la separación de los componentes de la
mezcla.
4. Recuperación de las sustancias ya separadas.
Paso 1.-
1. Se coloca la columna de vidrio vacía en posición vertical al soporte, utilizando
dos pinzas. (La cantidad de adsorbente determina la elección de la columna
adecuada, ya que el nivel del adsorbente debe ser 4 veces el diámetro de la
columna, en este caso es de un centímetro y medio de volumen).
2. Para impedir la caída del adsorbente, colocamos en el estrechamiento
inferior de la columna, una pequeña cantidad de algodón, y la compactamos
hasta tapar la parte inferior de la columna con la ayuda de una varilla de vidrio
larga.
Paso 2.-
1. Una vez colocada la columna en el soporte, añadimos una capa de arena de
0,5 a 2,0 cm dentro de la columna.
2. Después de esto, procedemos a pesar en la balanza analítica 15 g de gel de
sílice para después pasarlo a un vaso de precipitado con 30 ml de agua
destilada.
3. Utilizando una varilla de vidrio, eliminamos las burbujas de aire de esta
mezcla, hasta obtener una suspensión homogénea fluida, y sin dejar de
agitar agregamos la suspensión de gel de sílice, en el interior de la columna
cromatográfica ayudándonos de un embudo cónico.
4. Colocamos un matraz de 100 ml por debajo de la columna y dejamos que la
sílice se asiente.
5. A continuación, abrimos la llave de la columna y dejamos caer el eluyente en
el Erlenmeyer de 100 ml colocado debajo de la columna.
6. Lavamos los restos de sílice que pudieron haber quedado por las paredes de
la columna, con un poco de eluyente, ayudándonos de una pipeta.

Paso 3.-
1. La columna se va compactando por gravedad después de haber abierto la
llave, y para terminar de compactarlo, con la ayuda de una Pera Richard
hacemos presión para compactar más rápido. (Nunca se deje que la columna

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 se seque. Se debe asegurar siempre que el nivel de disolvente esté por
encima de la sílice) En este momento cerrar la llave.

2. En seguida agregamos una capa de arena de aproximadamente 1 a 2 cm de

profundidad en la punta de la columna, para después pipetear la solución de
Kool-Aid de Uva por los lados de la columna con mucho cuidado.

3. Seguidamente abrimos la llave para que la disolución de la muestra problema

se vaya introduciendo sobre la arena y la sílice.

4. Cerramos la llave justo, cuando la disolución desaparece de la parte superior

y queda inmersa en el adsorbente.

Paso 4.-
1. Para evitar disturbios y asegurarnos que la disolución se haya introducido
completamente, añadimos una pequeña porción de eluyente con una pipeta
para enjuagar el interior de la columna, y un poco más vertiendo desde el
sitio hasta completar la parte superior de la columna.
2. Una vez hecho esto, abrimos la llave.
- Los componentes de la mezcla a separar deben, eluir manteniendo un
flujo constante de disolvente. Los colorantes de la mezclan eluyen en
orden de polaridad creciente.
- Cuidar el tiempo de cuando sale el primer analito y el segundo analito
(Tomar el tiempo de retención)
- Durante la elución nunca debe secarse el silica gel, por lo que se deberá
ir rellenando tantas veces como sea necesario
- Se utilizará tubos de ensayo o erlenmeyers para separar en fracciones
distintas los componentes de la mezcla problema a medida que van
eluyendo.

En esta sección se presenta la metodología empleada para determinar la

cuantificación de FD&C Blue No.1 en una muestra obtenida de Kool-Aid sabor uva.
Los equipos, los reactivos y las condiciones en que se realizaron las mediciones de
absorbancia. Así como los materiales y las instrucciones para realizar dicho
procedimiento.
Para poder realizar la curva de calibración usando FD&C Blue #1 como
analito:
1. Deben tomarse 8 ml con una pipeta de 10 ml (0.01 L) de la solución FD&C Blue
No.1 obtenidos de la cromatografía realizada.

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2. Se vierte la cantidad obtenida en un matraz de aforación con 25mL de capacidad.
Aforar hasta la marca y agitar ligeramente para su homogeneización.
3. De la solución madre (SM), se tomarán las siguientes cantidades con pipetas de
vidrio con capacidad de 1mL y se vertirán en matraces de aforación con capacidad
de 10mL: 1mL, 0.75mL, 0.5mL, 0.25mL y 1.15mL.
4. Se aforarán los matraces con agua destilada y se procederá a agitar
manualmente.
5. La concentración de los matraces se calcula de la siguiente manera, utilizando
reglas de 3 buscando calcular las “x”: además para su identificación se deberán
etiquetar los matraces con las concentraciones respectivas.
6. Los pasos 1-5 se deben repetir 3 veces, por tanto, habrá al final 3 soluciones
madre y 15matraces de 10 mL.
Se procede a realizar una tabla, con los valores obtenidos:
No. De Matraz Mililitros de SM en 10 ml Cocentración

Y los cálculos necesarios:

 ( ml) presentes en ➔

Para la calibración del espectrofotómetro se acatarán las siguientes

instrucciones:
1. Conectar el espectrofotómetro a la toma de corriente y encenderlo durante 10
minutos antes de utilizarlo. El botón de encendido se encuentra colocado en la parte
posterior del aparato hacia el lado superior izquierdo.
2. Llenar hasta 2/3 de capacidad una celda para el espectrofotómetro con la solución
blanco, en este caso el agua destilada.
3. Abrir el compartimiento para muestras y colocar la celda con agua destilada
preparada en la posición No. 1. Cerrar la tapa del compartimento.
4. Oprimir la tecla “GO TO WL” presente en el teclado del aparato.
5. Teclear el número que corresponde a la longitud de onda a la que se quiere
trabajar. En este caso trabajaremos con 628nm, pues corresponde a la absorbancia
máxima del colorante FD&C Blue #1 es decir, el punto donde la sensibilidad es
máxima.

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6. Una vez anotado el número, oprimir la tecla “ENTER”. Presionar la tecla
“AutoZero” y esperar un momento a que el aparato efectúe la calibración respectiva.
7. Tomar las absorbancias de cada una de las soluciones de concentración distinta
y registrarlas en la bitácora junto con su absorbancia.
8. Se procederá a realizar una regresión lineal para una curva de calibración.
Utilizando la calculadora, los valores en el eje x (las concentraciones en ppm) y la
absorbancia en el eje y.
9. Una vez obtenido un valor mayor a 0.98 en el valor de r^2, se procede a formar
la ecuación y=mx+b utilizando los datos obtenidos en la regresión lineal. Es decir,
se reemplazarán los valores m y b por los obtenidos anteriormente en la calculadora,
siendo A el valor de b, y B el valor de m

Concentración de disolución del Absorvancia

colorante FD&C Blue #1

Para la toma de muestra y la ubicación en la curva de calibración:

1. La muestra será de 5mL proveniente de la disolución realizada de kool-aid uva al
10% p/v.
2. Estos 5mL tomados con pipeta volumétrica se trasladarán a un matraz de
aforación con capacidad de 25mL (Solución A) y se aforará hasta la marca con agua
destilada.

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3. De esta última solución se tomará 1mL con pipeta volumétrica, y se aforará a
10mL con agua destilada (Solución B)
4. Esta última solución será llevada a la lectura del espectrofotómetro. En teoría, su
concentración deberá estar dentro de los valores aceptados por la curva de
calibración.
5. Para poder buscar la concentración de analito, se hará una estimación en base a
la absorbancia obtenida en la lectura de la solución B.
6. Una vez hecho esto, el valor de la absorbancia se convierte en el valor de Y, y es
el que se utilizará junto con la ecuación que se hizo en la regresión lineal.
Despejando la x en la ecuación y=mx+b, se puede obtener la concentración en ppm
de la solución B. De esta forma, se tendrán que realizar los cálculos necesarios para
llegar a la concentración de la
muestra que se tomó (5mL).

BIBLIOGRAFÍA
Columbia University. (2007). 2007 Columbia University, New York NY. All rights
reserved. http://www.columbia.edu/cu/chemistry/ugrad/hssp/EXP_6.html
Domíngues-Martínez, L. (2019). Evaluación de la remoción de colorantes
mediante humedales subsuperficiales. SciELO.
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2224-
54212019000100108&lng=es&nrm=iso&tlng=es
Simpson, M. J. (2019, 4 junio). Quantitative Analysis of Kool-Aid | Middlebury
College Chem 103 lab. Quantitative Analysis of Kool-Aid.
https://sites.middlebury.edu/chem103lab/2019/06/04/limiting-and-excess-reagents/
• Universidad Complutense de Madrid. (2010, 12 noviembre). Técnicas
cromatográficas [Vídeo].YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=Vo_-
Zov2NEE
What dyes are in grape Kool Aid? (2020). What Dyes Are in Grape Kool Aid?
https://askinglot.com/what-dyes-are-in-grape-kool-
aid#:%7E:text=The%20ingredients%20of%20grape%20Kool,to%20the%20polar%
20solvent%E2%80%94water

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