Identificación bioquímica de los diversos tipos de Salmonella

en el Área Natural Protegida “Las Musas” en Manuel Doblado,

Guanajuato

Ramírez-Corona Ana Brenda1, Márquez-Lucio Maria Azucena2, Alejo-Iturvide

Francisco3
1
Departamento de Ingeniería Bioquímica, Instituto Tecnológico Superior de
Irapuato | is15111602@es.itesi.edu.mx
2
Departamento de Ingeniería Bioquímica, Instituto Tecnológico Superior de
Irapuato | mamarquez@itesi.edu.mx
3
Departamento de Licenciatura en Biología | frajelo@itesi.edu.mx

Resumen
La determinación de microorganismos patógenos en agua es de gran importancia
a través de parámetros microbiológicos para garantizar la inocuidad del medio. En
el presente trabajo se realizó la determinación de Salmonella y sus especies en
muestras de agua en el Área Natural Protegida “Las Musas” en Manuel Doblado,
Guanajuato usando como referencia la NOM-210-SSA1-2014. Se registró la
presencia de especies patógenas de Salmonella en la mayoría de las muestras del
cuerpo hídrico. Entre ellas se encontró Salmonella typhi con origen presuntivo de
escorrentías fecales de ganado aledaño a la zona de estudio que abastece a las
comunidades de agua, siendo de vital importancia puesto que en la zona se
desempeñan actividades tanto recreativas como ecoturismo, lo que significa la
potencial generación de enfermedades gastrointestinales en los visitantes o
habitantes de la zona de estudio.

Introducción
Los parámetros microbiológicos de calidad del agua son de gran relevancia desde
el punto de sector salud debido a su impacto en la proliferación de enfermedades
Vol. 6 (2019) 7º Encuentro de Jóvenes Investigadores

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(principalmente gastrointestinales) y su posible diseminación en el ambiente y la
población, siendo foco de infección en las comunidades o zonas afectadas.
Bajo el presente proyecto se seleccionó Salmonella spp. como parámetro
microbiológico de calidad del agua debido a su distribución en el ambiente y su
patogenia en la población y cantidad de casos presentados. Salmonella spp. es un
género de bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, asociados a
enfermedades entéricas y siendo causa importante de mortalidad en lactantes,
niños y ancianos (Parra, 2002). En el caso de las especies de mayor relevancia
clínica destacan las especies: typhi, paratyphi y entérica, teniendo una estimación
del 99% de los casos de salmonelosis son causados por Salmonella entérica
subespecie I (Betancor & Yim, 2012).
Para elucidar el comportamiento y patogenia de las especies de Salmonella spp.
Se desglosará la determinación en el cuerpo de agua del ÁNP Las Musas, a lo
largo de un año con base a la NOM-210-SSA1-2014 y las especificaciones que se
indica, una vez establecida la presencia, se obtiene una identificación bioquímica
de las especies cotejando los resultados con manuales previamente establecidos,
cada una de las cepas provenientes de diferentes cultivos con la finalidad de
comparar resultados y características morfológicas, bioquímicas y tipos de
colonias macroscópicas en medios como Salmonella-Shigella o xilosa-lisina-
desoxicolato. Finalmente se realizará un antibiograma usando diferentes
concentraciones de diversos antibióticos que brinda una particularidad de
resistencia o sensibilidad de las especies ante los antibióticos y principalmente
posibles resistencias desarrolladas, siendo de carácter principal una bacteria
permanente que una bacteria emergente en la zona.

Objetivos
1. Realizar la determinación de Salmonella spp. en muestras de agua usando
la norma NOM-210-SSA1-2014.
2. Realizar la identificación bioquímica de las especies aisladas de Salmonella
en muestras de agua.

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 3. Obtener el grado de sensibilidad de las especies de Salmonella bajo
diferentes concentraciones de diversos antibióticos usando antibiogramas
como referencia.
4. Realizar muestreos en diferentes estaciones del año que permitan
establecer dinámica de comportamiento y presencia.

Justificación
Las Musas es un ÁNP ubicada en el municipio de Manuel Doblado, Guanajuato.
Es considerada un área de uso sustentable; cuenta con una flora de 218 especies
registradas y una fauna de 149 especies registradas (Instituto de Ecología del
Estado). En el ÁNP se realizan actividades recreativas como ecoturismo y/o
pesca; su cuerpo hídrico abastece comunidades aledañas por lo que la
determinación de las especies patógenas de Salmonella como foco de infección
es de vital importancia para obtener los principales orígenes de enfermedades
entéricas en la zona y poder elucidar cuáles son los principales períodos en los
cuales se manifiesta una mayor concentración a través de un año.

Metodología
1. Muestreo

El procedimiento para el muestreo de agua en el ÁNP se realizó con base a los

procedimientos establecidos en la Norma Oficial mexicana NOM-014-SSA1-1993
“Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano
en sistemas de abastecimiento de agua públicos y privados” (Diario Oficial de la
Federación, 1994).

La toma de muestra se realizó en 7 puntos representativos al cuerpo hídrico de los

cuales en cada punto se tomó 125 mL de agua en un frasco previamente
esterilizado y con flujo a contracorriente con enjuagues hasta en 3 ocasiones
previas a la toma de muestra, siendo posteriormente transportadas a 2-6°C en un
periodo menor a 8 horas a su procesamiento para la determinación de Salmonella
spp.

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 2. Determinación de la presencia de Salmonella en agua

Para la determinación de Salmonella spp. en muestras de agua se realizó con

base a la Normas Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014 “Productos y servicios.
Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos
indicadores. Determinación de microorganismos patógenos” (Diario Oficial de la
Federación, 2015).
El procedimiento de la norma indica un pre-enriquecimiento de la muestra usando
como medio Caldo Lactosado de cual se preparan 125 mL de medio en un frasco
para su esterilización y posteriormente se inoculan 25 mL de muestra obteniendo
una dilución 1:10, para su incubación a una temperatura de 36°C ± 1°C por 24h ±
2h. Posteriormente se realiza un enriquecimiento de la muestra empleando como
medio Caldo Tetrationato y Caldo Selenito Cistina, inoculando 1 mL de muestra
por cada 9 mL de medio en un tubo para su posterior incubación a 36°C ± 1°C por
24h ± 3h.
Posteriormente se realiza el aislamiento e identificación de las especies,
resembrando de las muestras de Caldo Tetrationato y Caldo Selenito Cistina a
Agar XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato) y Agar SS (Salmonella- Shigella) mediante
técnica de estría masiva bajo las mismas condiciones de incubación que Caldo
Tetrationato, todo el procedimiento descrito previamente en la determinación de
Salmonella se realizó para cada una de las muestras analizadas.
3. Identificación bioquímica de las especies de Salmonella spp.

Para la identificación bioquímica de las especies de Salmonella en muestras de

agua se realizaron las pruebas bioquímicas de:
 Agar Triple Hierro Azúcar (TSI): medio preparado en pico de flauta en tubo
y sembrado en estría simple
 Agar Hierro Lisina (LIA): medio preparado en pico de flauta en tubo y
sembrado en estría simple
 Agar hierro Kligler (KIA): medio preparado en pico de flauta en tubo y
sembrado en estría simple

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  Agar Sulfato Indol Motilidad (SIM): medio preparado en tubo y sembrado
con punción

Cada una de las muestras se incubaron a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h para su
posterior interpretación de resultados y usando como referencia la tabla 1 de
comparación de crecimiento con las obtenidas en el presente trabajo
(Organización Mundial de la Salud (OMS), 2004).
Tabla 1. Cotejo de resultados para pruebas bioquímicas de identificación de
especies de Salmonella

MEDIO / Salmonella Salmonella paratyphi Salmonella

ESPECIE typhimurium A paratyphi B o C

Superficie/Profundi
Superficie/Profundidad: Superficie/Profundidad:
dad: reacción
reacción alcalina (color reacción alcalina (color
alcalina (color rojo)
rojo) /reacción ácida rojo) /reacción ácida
/reacción ácida
(color amarillo) (color amarillo)
TSI - (color amarillo)
(color Producción de gas
Producción de gas (-) Producción de gas (-)
rojo) (+)
Producción de
Producción de ácido
Producción de ácido ácido sulfhídrico
sulfhídrico H2S (+)
sulfhídrico H2S (-) H2S (+): (negro
(negro débil)
débil)
Superficie/Profundi
LIA - Superficie/Profundidad: dad: reacción
Descarboxilación de
(color reacción alcalina (color alcalina (color
Lisina (fondo) (+): color
púrpura púrpura) /reacción púrpura) /reacción
púrpura
rojizo - ácida (color amarillo) alcalina (color
tenue) púrpura)
Desaminación de Lisina Producción de gas (-) Producción de gas

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 (-): color púrpura (+)
Producción de
Producción de ácido
Producción de ácido ácido sulfhídrico
sulfhídrico H2S (+):
sulfhídrico H2S (-) H2S (+): (negro
(color negro)
débil)
Superficie/Profundi
Superficie/Profundidad: Superficie/Profundidad:
dad: reacción
reacción alcalina (color reacción alcalina (color
alcalina (color rojo)
rojo) /reacción ácida rojo) /reacción ácida
/reacción ácida
(color amarillo) (color amarillo)
KIA - (color amarillo)
(color Producción de gas
Producción de gas (-) Producción de gas (-)
rojo) (+)
Producción de
Producción de ácido
Producción de ácido ácido sulfhídrico
sulfhídrico H2S (+):
sulfhídrico H2S (-) H2S (+): (negro
(negro débil)
débil)
Motilidad (+):
Motilidad (+): presencia Motilidad (+): presencia presencia de
de turbidez o de turbidez o turbidez o
crecimiento más allá de crecimiento más allá de crecimiento más
la línea de siembra la línea de siembra allá de la línea de
siembra

SIM Indol (-): el color del Indol (-): el color del Indol (-): el color del
reactivo permanece reactivo permanece reactivo permanece
incoloro-amarillento incoloro-amarillento incoloro-amarillento

Producción de ácido Motilidad positiva, indol

Motilidad positiva,
sulfhídrico H2S (+): positivo y sulfuro
indol y sulfuro
ennegrecimiento del negativo
positivos
medio

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 4. Prueba de sensibilidad de antibióticos para Salmonella por antibiograma

Se empleo el método de Kirby-Bauer (Bernal & Guzmán, 1984), realizando un

antibiograma de discos, el cual consiste en preparar medio Mueller-Hinton con un
pH de 7.2-7.4. Después se prepara el inóculo seleccionando de 4 a 5 colonias del
microorganismo obtenido de un cultivo puro o que haya sido obtenido antes de 24
h, se transfieren las colonias a tubos con 3-5 cm3 de caldo estéril Soya-Tripticasa,
se incuba a 35 °C por 8-10 horas, una vez teniendo el inoculo incubado, se toma
un aplicador de algodón estéril el cual se sumerge en el inoculo que ha sido
incubado, se siembre el inoculo con el aplicador de algodón sobre la superficie del
medio Mueller-Hinton en la caja de Petri posterior a ello se deja secar la caja con
la tapa cerrada alrededor de 5-10 minutos y finalmente se colocan los discos sobre
la superficie del agar con unas pinzas estériles. A continuación, en la tabla 2 se
muestran los antibióticos que se emplean en el antibiograma:

Tabla 2. Antibióticos empleados para el antibiograma de Salmonella

ANTIBIÓTICO CONCENTRACIÓN
Amikacina 30 mcg
Ampicilina 10 mcg
Cefalotina 30 mcg
Ceftriaxona 30 mcg
Cloranfenicol 30 mcg
Dicloxacilina 1 mcg
Enoxacina 10 mcg
Eritromicina 15 mcg
Gentamicina 10 mcg
Netilmicina 30 mcg
Penicilina 10 U
Trimetroprim-Sulfametoxazol 25 mcg

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Resultados
Se determinó Salmonella spp. En los puntos de muestreo usando medio XLD
(ilustración 1) y medio SS (ilustración 2) en los muestreos realizados siguiendo el
punto 2 de la metodología descrita.
Posteriormente se realizaron las pruebas bioquímicas de identificación tomando
diferentes cepas provenientes de las placas de XLD y SS ya sea de Caldo
Selenito Cistina (SC) o Caldo Tetrationato (CT) siendo cada una la más
representativa de un punto de muestreo y desglosada la identificación en la tabla
3.

Ilustración 2. Determinación de Salmonella Ilustración 1. Determinación de Salmonella spp.

spp. en medio XLD en medio SS

Tabla 3. Identificación de especies de Salmonella acorde al medio y muestra

procesada

PUNTO CEPA ESPECIE, ESPECIE,

MUESTREO 1 MUESTREO 2

E1 Placa SS proveniente de SC S. typhimurium S. typhimurium

Placa XLD proveniente de SC S. typhimurium S. typhimurium
Placa SS proveniente de CT S. paratyphi A S. paratyphi B
E2 Placa XLD proveniente de SC S. paratyphi A S. paratyphi B
Placa XLD proveniente de CT S. paratyphi A S. paratyphi B
Placa SS proveniente de CT S. typhimurium S. paratyphi A

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 E3 Placa XLD proveniente de SC S. typhimurium S. paratyphi A
Placa XLD proveniente de CT S. typhimurium S. paratyphi A
Placa SS proveniente de SC S. typhimurium S. typhimurium
E4 Placa SS proveniente de CT S. typhimurium S. typhimurium
Placa XLD proveniente de CT S. typhimurium S. typhimurium
Placa SS proveniente de SC S. paratyphi A S. paratyphi A
E5 Placa XLD proveniente de SC S. paratyphi A S. paratyphi A
Placa XLD proveniente de CT S. paratyphi A S. paratyphi A
E6 Placa XLD proveniente de CT Salmonella spp. S. paratyphi B
E7 Placa SS proveniente de CT Salmonella spp S. typhimurium

Finalmente se realizaron las pruebas de sensibilidad de antibióticos con

multidiscos a diferentes concentraciones de antibióticos en placa con la
metodología del punto 3 descrita anteriormente, presentando resistencia y
crecimiento en diferentes antibióticos (ilustración 3).

Ilustración 3. Antibiograma de especies de Salmonella,

usando multidiscos

Los resultados obtenidos para todas las muestras se desglosan en la tabla 4

donde S representa sensibilidad de la bacteria al antibiótico, es decir, no presenta

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crecimiento cercano al multidisco y R que representa la resistencia al antibiótico,
es decir, se manifiesta crecimiento cercano al multidisco.
Tabla 4. Resultados de antibiograma a especies de Salmonella bajo diferentes
antibióticos y concentraciones. Donde S:sensible; R:resistente

Salmonella
MUESTREO ANTIBIÓTICO CONCENTRACIÓN DEL SENSIBILIDAD
ANTIBIÓTICO

Amikacina (AK) 30 mcg S

Ampicilina (AM) 10 mcg R
Cefalotina (CF) 30 mcg R
Ceftriaxona (CRO) 30 mcg S
Cloranfenicol (CL) 30 mcg S
1 Dicloxacilina (DC) 1 mcg R
Enoxacina (ENX) 10 mcg S
Eritromicina (E) 15 mcg R
Gentamicina (GE) 10 mcg S
Netilmicina (NET) 30 mcg S
Penicilina (PE) 10 U R
Trimetroprim- 25 mcg S
Sulfametoxazol (SXT)
Amikacina (AK) 30 mcg S
Ampicilina (AM) 10 mcg R
Cefalotina (CF) 30 mcg R
Ceftriaxona (CRO) 30 mcg S
Cloranfenicol (CL) 30 mcg S
Dicloxacilina (DC) 1 mcg R
2 Enoxacina (ENX) 10 mcg S
Eritromicina (E) 15 mcg R
Gentamicina (GE) 10 mcg S
Netilmicina (NET) 30 mcg S

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 Penicilina (PE) 10 U R
Trimetroprim- 25 mcg S
Sulfametoxazol (SXT)

Conclusiones
El análisis de muestras de agua para la identificación de especies de Salmonella
arroja una alta concentración y resistencia a una amplia diversidad de antibióticos
que pudieran inhibir su crecimiento. En el caso de puntos extremos del cuerpo de
agua (1,7), se puede observar una mayor sensibilidad a antibióticos por la bacteria
esto a causa de un aislamiento del contacto humano con la zona.
Las especies determinadas son en su mayoría patógenas (Salmonella
typhimurium), siendo más resaltadas en los puntos centrales (3,4,5) esto en zonas
donde se realiza ecoturismo y por lo que pueden causar enfermedades entéricas
en los habitantes y visitantes de la zona, sobre todo en los periodos determinados.
El origen de la contaminación del cuerpo de agua para presentar especies de
Salmonella se manifiesta en escorrentías fecales provenientes de ganado aledaño
a la zona y de contaminación de carácter antropogénico de visitantes que realizan
ecoturismo.

Referencias
Bernal, M., & Guzmán, M. (1984). El antibiograma de discos. Normalización de la
técnica de Kirby-Bauer. Biomédica vol. IV n°3-4, 112-121.
Betancor, L., & Yim, L. (2012). Samonella y salmonelosis. Uruguay: Departamento
de Bacteriología y Virología, Departamento de Desarrollo Biotecnológico,
Facultad de Medicina, UdelaR.
Diario Oficial de la Federación. (1994). Norma Oficial Mexicana. NOM-014-SSA1-
1993 "Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y
consumo humano en sistemas de abastecimiento de agua públicos y
privados". Ciudad de México.
Diario Oficial de la Federación. (2015). Norma Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-
2010, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos.

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 Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de
microorganismos patógenos. Ciudad de México.
Instituto de Ecología del Estado. (s.f.). Área Natural Protegida Las Musas.
Guanajuato: IEEG.
Organización Mundial de la Salud (OMS). (2004). Salmonella Serotipo Typhi. En
Manual de laboratorio para la identificación y prueba de susceptibilidad a
los antimicrobianos de patógenos de importancia para la salud pública en el
mundo en desarrollo (Vol. 1, págs. 118-120). Atlanta, Georgia: OMS.
Parra, M. (2002). Microbiología, patogénesis, epidemiología, clínica y diagnóstico
de las infecciones producidas por Salmonella. MVZ-Córdoba, 187-189.

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