Unidad II

Replicación
Los ácidos nucleicos son las únicas sustancias biológicas que pueden autoduplicarse.
Actúan como depositarios y transmisores de información genética de cada célula,
tejido y organismo. Los planos para la construcción de un organismo están
codificados en su ácido nucleico. Gran parte del desarrollo físico de un organismo a lo
largo de su vida está programado en estas moléculas. Las proteínas que elaborarán
sus células y funciones que realizarán están todas registradas en esta cinta molecular.
Existen dos tipos de ácido nucleico, el ácido ribonucleico (ARN), y el ácido
desoxirribonucleico (ADN). Cada uno de ellos es una cadena polimérica, en las que los
monómeros se conectan por enlaces covalentes.
En cada caso, el monómero contiene
una azúcar de cinco carbonos, la
ribosa en el ARN y la 2´-desoxirribosa
en el ADN. Los átomos de C se
designan con primas para
diferenciarlos de los de las bases. La
diferencia entre los dos azúcares
radica en el grupo hidroxilo 2´ de la
ribosa, que se sustituye por H en el
ADN. La conexión sucesiva entre los
monómeros se realiza mediante un
residuo fosfato unido al hidroxilo del
C 5´ de uno y al hidroxilo 3´ del
siguiente. Esto forma un enlace
fosfodiéster entre los dos residuos de
azúcar, formando cadenas largas de
hasta millones de unidades. El grupo
fosfato es un ácido fuerte, con un
pKa aproximadamente de 1, y esta
razón es por la que se denominan
ácidos nucleicos. A pH fisiológico
cada residuo lleva una carga
negativa.
Los residuos de azúcar constituyen solo el
armazón. Los heteropolímeros permiten
almacenar y transmitir la información genética.
Cada monómero contiene una base heterocíclica,
siempre unida al C 1´ del azúcar. Existen dos tipos
de bases, las purinas y las pirimidinas. El ADN
contiene dos purinas, adenina (A) y guanina (G), y
dos pirimidinas, citosina (C), y timina (T). El ARN
posee las mismas bases, excepto la T que es
sustituida por el uracilo (U). También existen
algunas bases modificadas en la estructura, pero
en menor medida.
Los nucleótidos son los
monómeros de los ácidos
nucleicos, formados por ribosas o
desoxirribosas fosforiladas, bases
púricas o pirimidínicas unidas al C
1´ (en las purinas unidas al N 9 y
en las pirimidinas al N 1). El
enlace entre el C 1´ del azúcar y
el N de la base se denomina
enlace glucosídico. Cada
nucleótido puede considerarse el
derivado 5´-monofosforilado de
un aducto azúcar-base llamado
nucleósido, por lo que se les
puede denominar nucleósidos 5´-
monofosfato. Los nucleótidos
más grandes se les denominan
polinucleótidos, y los más
pequeños oligonucleótidos.
Tanto la ionización secundaria del
fosfato como la protonación o
desprotonación de algunos de los
grupos de las bases de los
nucleótidos pueden observarse a
pH próximo a la neutralidad. Los
tautómeros son conversiones a
isómeros estructurales con una
diferente disposición de los
átomos de H y los dobles enlaces.
Debido a los dobles enlaces
conjugados de los anillos de purina
y pirimidina, las bases y sus
derivados absorben intensamente
luz en el ultravioleta cercano,
permitiendo su cuantificación pero
también tener daños
químicamente.
La síntesis de los nucleótidos
implica a nucleósidos o
desoxinucleósidos trifosfato de
energía elevada. El nucleósido
monofosfato que se añade a la
cadena en crecimiento se
presenta como nucleósido
trifosfato, liberando pirofosfato.
La reacción final, con la
hidrólisis de un nucleósido
trifosfato y la formación de un
enlace fosfodiéster por la
eliminación de agua, es
favorable por un cambio de
energía negativo. La reacción es
fácil, y va de acuerdo con las
necesidades de consumo
energético del organismo.
Una cadena polinucleótida posee un sentido o direccionalidad. El enlace fosfodiéster
entre las unidades monoméricas se produce entre el C 3´ de un monómero y el C 5´
del siguiente. Así pues, los dos extremos de una cadena polinucleotídica lineal son
diferenciables. Un extremo lleva normalmente un fosfato 5´ sin reaccionar, y el otro
extremo un grupo hidroxilo 3´ sin reaccionar.
Una cadena polinucleotídica posee individualidad, determinada por la secuencia de
sus bases, la secuencia de nucleótidos. Esta secuencia se denomina estructura
primaria del ácido nucleico.
Watson y Crick determinaron la estructura del ADN. Sugirieron que debían haber dos
cadenas en cada molécula helicoidal con 10 residuos por vuelta. La hélice de doble cadena
se estabiliza por puentes de H entre las bases de cadenas opuestas, solo si los pares eran A-
T y G-C. Las distancias entre los C 1´ son de 1.1. nm entre sí, igual para todos. Los armazones
hidrófilos de fosfato-desoxirribosa se situaban al exterior, y los pares de bases se apilaban
unos sobre otros con sus planos perpendiculares al eje de la hélice.
El modelo actualizado tiene que las bases no son exactamente perpendiculares al eje, y la
conformación del azúcar es diferente. Se da una interacción de acoplamiento por fuerzas de
van der Waals entre las bases. Cada base tiene un ángulo de rotación de 36°, de modo que
tras 10 bases se tiene uno de 360°. La distancia entre bases es de 0.34 nm. Aunque las
bases son internas, se abordan en dos surcos espirales, uno principal que proporciona el
acceso más directo, y un secundario frente al armazón del azúcar. Las cadenas deben ir en
direcciones opuestas a derecha.
La regla de Chargaff indica que la cantidad de A y T, y de G y C son iguales, por lo que son
cadenas complementarias. Esto permite su autorreplicación, cuando una célula se divide, se
producen dos copias completas de la información genética original.
Las dos formas
principales de la
estructura
secundaria de los
polinucleótidos se
denominan A y B. La
mayor parte del ADN
se encuentra en
forma B, las hélices
ARN-ARN y ADN-ARN
están en la forma A.
La mayor parte de las moléculas de ADN in vivo son de
doble cadena, muchas son círculos cerrados. La
mayoría de las moléculas de ADN circulares de doble
cadena están superenrolladas.
El plegado de orden superior de la estructura
secundaria de un biopolímero se denomina estructura
terciaria.
La mayoría de las moléculas de ADN que se
encuentran in vivo son superhélices a la izquierda.
La mayor parte de las moléculas de ARN son de una sola cadena, pero muchas de
ellas tienen regiones autocomplementarias que forman estructuras de horquilla y
algunas poseen estructuras terciarias bien definidas.
Genes
En términos moleculares, un gen es la secuencia completa de ácidos nucleicos
necesaria para la síntesis de un producto génico funcional (polipéptido o ARN).
Incluye más que los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de una
proteína, llamada región codificadora. Incluye también todas las secuencias de ADN
requeridas para la síntesis de un transcripto particular de ARN.
Las regiones de control de transcripción son las secuencias amplificadoras. Otras
regiones no codificadoras son las secuencias que especifican la escisión 3´ y la
poliadenilación, los sitios poli(A), y las de eliminación de intrones de ARN en los
transcriptos primarios, los sitios de corte y empalme.
Existen genes que no codifican proteínas, sino moléculas de ARN.
Los exones son las porciones del gen que codifican aminoácidos. En las células
eucariotas, la mayoría de las secuencias de genes son alteradas por una o más
secuencias de ADN llamadas intrones. Las partes de la secuencia de genes que
contienen la información para producir las proteínas se llaman exones, ya que se
expresan, mientras que las partes de la secuencia del gen que no codifican se llaman
intrones, porque están en medio o interfieren con los exones.
El promotor es una secuencia de ADN necesaria para convertir un gen en activado o
desactivado. El proceso de transcripción se inicia en el promotor. Generalmente se
encuentra cerca del comienzo de un gen, el promotor tiene un sitio de unión para la
enzima que se utiliza para hacer una molecular ARN mensajero.
Una secuencia reguladora es un segmento de ácidos nucleicos capaces de aumentar
o disminuir la expresión de genes específicos dentro de un organismo.
Un potenciador es una región corta de ADN que influenciado por una proteína
llamada factor transcripcional aumentan la probabilidad de que la transcripción de un
gen se produzca. Un silenciador es una región del ADN que se unen a un represor.
Cuando un represor se une al silenciador, se interrumpe la transcripción, previniendo
la expresión de genes a proteínas.
Para codificar cada aminoácido se utilizan tripletes, codones, para permitir 64
combinaciones distintas. Esto es suficiente para codificar los aminoácidos totales, por
lo que la mayoría de los aminoácidos tienen múltiples codones.
El código genético es casi universal, prácticamente todos los organismos utilizan los
mismos codones para traducir sus genomas a proteínas.
El código genético se representa en tripletes de mRNA que corresponden a los
distintos residuos de aminoácidos. UAA, UAG, y UGA, no codifican ningún
aminoácido, sino que funcionan como señales de parada para finalizar la traducción
en el C-terminal de la cadena.
El codón AUG, que normalmente codifica metionina, también funciona como señal de
comienzo. Cuando comienza una cadena polipeptídica, AUG dirige la colocación de la
N-formilmetionina o metionina en la posición N-termnal.
La consecuencia es que todas las proteínas procariotas deberían empezar con N-
formilmetionina y las proteínas eucariotas con metionina.
La totalidad de la información de un organismo es el genoma, que puede
considerarse constituido por las secuencias de bases de todas las moléculas de ADN
de una célula. Estas secuencias están formadas por genes individuales, cada uno en
un cromosoma o en un pequeño fragmento de ADN extracromosómico.
Un mapa genético identifica las posiciones relativas de los genes en los cromosomas.
Se puede generar un mapa de ligamento midiendo las frecuencias de recombinación
o un mapa físico que identifica las localizaciones físicas de los genes en un
cromosoma.
Cualquier característica de un organismo que pueda detectarse en términos de
aspecto, estructura u otra propiedad que pueda medirse, se denomina fenotipo. La
composición genética de un organismo, que especifica sus propiedades fenotípicas,
es el genotipo. Las personas con genotipos diferentes pueden tener el mismo
fenotipo.
Un alelo es una forma determinada gen. Un marcador es cualquier alelo cuya
frecuencia pueda determinarse cuantitativamente. El número de copias indica la
cantidad de copias de un determinado gen u otra secuencia de ADN por célula. La
mayor parte de las células eucariotas son diploides, donde el número de copias de la
mayoría de los genes cromosómicos es dos; mientras que la mayor parte de las
procariotas tienen un genoma haploide, con una sola copia.
Los genes extracromosómicos pueden tener un número de copias mucho más alto,
tanto si se encuentran en el ADN de los organelos en células eucariotas, como un
plásmido bacteriano, este último una pequeña molécula de ADN circular cuyo
número de copias se controla de manera independiente en los mecanismos
reguladores que afectan la replicación del ADN cromosómico.
Un individuo diploide en un medio natural tiene al menos un alelo de cada gen, con
un fenotipo natural. Puede sufrir una mutación que genere un genotipo y fenotipo
mutantes. Un lugar mutante en un gen puede mutarse y restablecerse a modo
natural, por reversión. Una supresión se da cuando un fenotipo natural puede
restablecerse por una mutación en un lugar diferente, también llamada reversión de
segundo lugar.
Replicación
Es el proceso esencial para la continuidad de la vida, al pasar la información genética
de célula a célula y de generación a generación.
Se construye una copia complementaria de cada una de las dos cadenas del ADN,
dando lugar a dos copias idénticas de la original. Existe un error cada 1,000,000,000
bases, aunque cuando se dan equivocaciones provoca mutaciones para evolucionar.
Se produce por un complejo de enzimas, con múltiples funciones, concentrado
respecto a la ADN polimerasa.
Abre el ADN de doble cadena y guía el apareamiento de cada desoxirribonucleósido
trifosfato que se incorporará con su pareja complementaria sobre la cadena que va a
copiarse.
Se cataliza la formación del enlace fosfodiéster para ligar este residuo a la nueva
cadena que crece. En muchos casos, el complejo enzimático también comprueba la
adición antes de proceder a añadir el siguiente residuo, aumentando la exactitud
global de la replicación.
Este método comporta el desenrollamiento de las dos cadenas del ADN progenitor,
de tal manera que cada cadena sirva de molde para la síntesis de una cadena nueva,
complementaria y enrollada sobre la cadena progenitora.
La replicación completa de una molécula de ADN producirá dos dobles cadenas hijas,
cada una consistente en una mitad del ADN del progenitor (una cadena de la
estructura de doble cadena original), y otra mitad de material nuevo. Esta forma se
denomina semiconservativa, siendo la que describe fielmente el sistema.
En una forma conservativa se daría que una de las dos estructuras de doble cadena
hijas es la doble cadena conservada del progenitor y la otra se sintetizaría de cero, y
de forma dispersiva donde el material progenitor se distribuye por las estructuras de
las dobles cadenas hijas. Ambos modelos han sido rechazados en base a estudios.
Replicación
La transferencia de la información implica simplemente desenrollar las cadenas de
una doble hélice de ADN original, acompañada de la síntesis de dos cadenas hijas
complementarias.
Es semiconservativa, dando lugar a moléculas de ADN hijas que contienen una
cadena original y una material de nueva síntesis.
Es ordenada y secuencial, iniciando en unos puntos fijos del cromosoma, y el
crecimiento de la cadena de ADN se produce de manera simultanea el
desenrollamiento de la doble hélice general.
Utiliza sustratos activados, los desoxirribonucleósidos 5´-trifosfatos (dNTP). Es
discontinua, ya que la necesidad de extender cadenas de ADN de polaridad opuesta
dentro de una horquilla hace que una cadena crezca en la dirección del movimiento
de la horquilla y la otra en dirección opuesta.
Es mucho más exacta que cualquier otro proceso catalizado por enzimas.
De los tres procesos de la replicación (iniciación, elongación y terminación), el más
conocido es el de elongación.
Los componentes proteicos que se sabe actúan en la horquilla de replicación o cerca
de esta son las ADN polimerasas, proteínas de unión al ADN de cadena única,
helicasas, primasas, y topoisomerasas y ADN ligasas.
La ADN polimerasa cataliza la reacción de síntesis de ADN, creando enlaces
fosfodiéster entre los desoxirribonucleótidos en una cadena de ADN. El grupo
hidroxilo 3´ del final de una cadena de ADN realiza un ataque nucleófilo sobre el
fosfato alfa de un dNTP, el cual es posicionado para la incorporación de un cebador o
cadena en crecimiento, mediante enlaces de H con el nucleótido apropiado en la
cadena molde. La reacción comporta la salida del pirofosfato, cuya hidrólisis impulsa
la reacción energéticamente.
Dada la necesidad de los grupos hidroxilo 3´ y de sustratos 5´ dntp, la ADN polimerasa
puede catalizar el crecimiento de la cadena de ADN solo en dirección 5´-3´. La ADN
polimerasa dimérica permite la replicación en dirección opuesta para la cadena
antiparalela, realizando una reacción contraria.
El término de cadena conductora identifica la
cadena hija que se extiende en la misma dirección
que la horquilla, y la cadena que se sintetiza hacia
atrás se denomina cadena retardada.
La síntesis de la cadena conductora se produce
simultánea al desenrollamiento de la doble cadena
original, mientras que la de la retardada solo se da
después del desenrollamiento de una parte de la
doble cadena original, dejando descubierta una
región del molde de ADN de una sola cadena.
Debido a que ambas síntesis se dan en la horquilla,
la ADN polimerasa debe permanecer en esta. La
cadena retardada se sintetiza de manera
discontinua, mediante segmentos cortos, mientras
que la conductora lo hace sin interrupciones. Los
fragmentos de la cadena retardada se denominan
fragmentos de Okazaki.
La ADN polimerasa solo puede actuar extendiendo las cadenas a partir de un hidroxilo
3´. Para iniciar la síntesis de un fragmento de Okazaki se requiere una primasa, debido
a que no existe el grupo funcional opuesto al molde de la cadena retardada. Esta
enzima copia una cadena molde de ADN para formar un producto polinucleótido, en
este caso ARN. Una vez formados varios ARN cebadores, la primasa se retira y
permite a la ADN polimerasa se añade un 5´ desoxirribonucleótido al extremo 3´ del
cebador de ARN, continuando añadiendo dNTP habitual.
Cuando el extremo 3´ del fragmento de Okazaki en crecimiento alcanza el extremo 5´
del fragmento sintetizado previamente, se puede eliminar el ARN cebador, se
sustituyen los ribonucleótidos por desoxirribonucleótidos, o se puede unir
covalentemente del extremo 3´ del fragmento recién sintetizado con el 5´ del previo.
Intervienen la ADN polimerasa I y la ADN ligasa. La primera tiene un actividad
exonucleasa para la translación de mella, la eliminación de ribonucleótidos del
extremo 5´ del ARN cebador, acoplada con la extensión del extremo 3´ del fragmento
de Okazaki con la incorporación de desoxirribonucleótidos. La mella es una
interrupción de cadena única en un ADN dúplex, en el que no falta ningún nucleótido,
contrario a un hueco.
Una vez eliminados los ribonucleótidos, la ADN polimerasa llega a una mella, una
estructura que no puede cerrar. Ya que la mella tiene un extremo 3´ hidroxilo y uno 5´
fosfato, la ADN ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre estos.
Al menos dos de las proteínas de la horquilla de replicación son helicasas, por lo que
catalizan el desenrollamiento de los ácidos nucleicos de doble cadena. Cada cadena
original tiene su propia helicasa, la que se asocia a la retardada forma complejos con
la primasa generando una unidad llamada primosoma.
El desenrollamiento catalizado por la helicasa de las cadenas del ADN original
requiere la hidrólisis de ATP, que proporciona la energía necesaria para abrir la doble
cadena de ADN estable. Este proceso descubre el ADN en una sola cadena. Para que
esta se aparee con los nucleótidos que llegan para formar las cadenas hijas, la
proteína de unión al ADN de cadena única (SSB), o proteína estabilizadora de la
hélice, genera una orientación en los puentes de H de las bases de la cadena única
para que se unan a los nucleótidos que llegan a esta.
Existe una proteína circular unida a cada molécula de ADN polimerasa, la abrazadera
deslizante, que asegura la unión entre la polimerasa y el ADN molde, rodeando al
ADN. El cargador de la abrazadera es un dispositivo multiproteico que abre la
abrazadera para que pueda disociarse la polimerasa en el momento adecuado. La
polimerasa replicativa es dimérica, de modo que las dos proteínas catalíticas están
ligadas de forma física para coordinar sus acciones en los moldes replicativos.
El ADN original está forzado topológicamente, ya sea por el cromosoma circular de
procariotas, o por la unión a las proteínas cromosómicas en los eucariotas. La doble
cadena está sobreenrollada por encima de la horquilla por el desenrollamiento. Las
topoisomerasas permiten girar el complejo para aliviar la tensión. Estas enzimas
modifican el número de ligazón del ADN sin modificar su estructura. Rompen
transitoriamente las cadenas de ADN, lo que permite la relajación de la estructura
tensionada mediante la rotación libre del ADN, permitiendo la formación de nuevo de
los enlaces fosfodiéster en las rupturas de cadena.
Replicación in vitro (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa es la técnica más importante y revolucionaria
de la biología molecular, esto debido a que permite obtener in vitro millones de
copias de un fragmento de ADN a partir de una sola molécula.
Se basa en la replicación celular en la que actúan varias proteínas para sintetizar dos
nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde.
En procariontes se han encontrado al menos 12 proteínas involucradas en la
replicación que actúan en diferentes funciones: identificación del sitio de origen de
replicación, el desenrollamiento de la doble hélice, la estabilización de la estructura
desenrollada, la generación de cadenas iniciadoras complementarias con un extremo
3´ libre que sirve de iniciador para que el ADN polimerasa catalice, el avance de la
bifurcación replicadora por desenrollamiento, los pasos finales del ensamblaje de dos
cadenas complementarias, identificación de sitios de terminación, y el
superenrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN.
La enzima más importante en la replicación es la ADN polimerasa, que es la
encargada de incorporar nucleótidos durante la síntesis de las nuevas cadenas de
ADN.
En la PCR se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicación celular. La síntesis
de nuevas cadenas de ADN se llevan a cabo mezclando el ADN que contiene el o los
fragmentos que se van a amplificar, la polimerasa, los iniciadores (fragmentos de ADN
de 15-30 nucleótidos que flanquean la región a amplificar y que aportan el extremo
3´ libre para que inicie la transcripción), desoxinucleótidos, cloruro de magnesio u
otro cofactor necesario para que la enzima lleve a cabo su actividad catalítica, y una
solución amortiguadora que mantenga el pH apropiado para la síntesis.
La mezcla se somete a repetición de varios ciclos a diferentes temperaturas,
sustituyendo la mayoría de las proteínas que actúan en la replicación celular.
La PCR inicia con la desnaturalización o separación de la doble hélice del ADN
mediante el calentamiento de la muestra entre 94 y 96°C para romper los enlaces de
H que la unen, de modo que cada cadena queda como molde para la síntesis de una
nueva.
Una vez separadas, se alinean los iniciadores a sitios específicos complementarios de
las cadenas sencillas de la región que se va a amplificar, esto con una exposición de
entre 40 y 60°C para permitir el alineamiento y unión de los iniciadores.
Se sintetiza una nueva cadena final en sentido 5´-3´ incrementando la temperatura a
72°C, debido a que es la temperatura óptima de actividad catalítica para la ADN
polimerasa en iniciar y comenzar la replicación.
Estas tres etapas (desnaturalización, alineamiento, extensión), se repiten
sucesivamente, en cada nuevo ciclo se amplifica simultáneamente la región de interés
de las dos cadenas complementarias.
Los productos generados aumentan su concentración de manera exponencial porque
cada nueva copia sirve de molde en los ciclos subsecuentes, dando origen a millones
de copias del fragmento seleccionado.
Secuenciación del ADN
A finales de los 70´s se desarrollaron métodos que permitieron determinar de manera
simple y rápida la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN purificado.
A partir de esto, se han obtenido las secuencias de ADN completas de muchos cientos
genes de mamíferos, incluyendo los que codifican la insulina, la hemoglobina, el
interferón, y el citocromo c.
La cantidad de información respecto a las secuencias de ADN es muy grande, por lo
que deben utilizarse ordenadores para almacenarla y analizarla. Se han determinado
así varias secuencias continuas de más de 100,000 pares de nucleótidos, como el
genoma del virus de Epstein-Barr, el del cloroplasto vegetal, y la levadura.
Existen dos métodos de secuenciación: el químico y el enzimático, este último el más
común por basarse en la síntesis in vitro del ADN en presencia de nucleósidos
trifosfato terminadores de cadena.
El proceso de secuenciación química inicia con
la obtención de un conjunto de moléculas de
ADN de doble cadena marcadas en un
extremo 5´ por el polinucleótido quinasa.
En la primera etapa, las cadenas de la doble
hélice se disocian y se someten a un
tratamiento suave con un agente químico que
destruye una de las cuatro bases. Debido a
que el tratamiento es suave, solo se rompe
una A por molécula al azar. Esto genera una
colección de fragmentos de diferentes
longitudes que reflejan los lugares donde se
encontraban las A en la cadena original.
Los fragmentos se separan en un gel y se
detectan por autorradiografía, donde
solamente los fragmentos que poseen un
extremo 5´ terminal fosfato aparecen en el
gel, y su tamaño indica la distancia desde el
extremo marcado hasta la base A.
Para determinar la secuencia completa, se realizan
procedimientos similares a cuatro muestras
separadas de la misma molécula de ADN marcada
en su extremo 5´, utilizando compuestos químicos
que rompan el ADN de forma preferente por T en
la primera muestra, luego C, G, y A finalmente.
Los fragmentos resultantes son separados en
carriles paralelos al mismo gel, obteniéndose un
patron de bandas de ADN radiactivas a partir de
las cuales se lee la secuencia del ADN. El
nucleótido más cercano al extremo 5´ de la
secuencia se determina mirando el gel al nivel 1
(inferior) y observando en que carril aparece la
banda (T). El mismo procedimiento se utiliza para
todos los niveles, hasta obtener la secuencia
completa.
En el método enzimático, el ADN a secuenciar se utiliza por la ADN polimerasa como molde
en la síntesis in vitro, de una serie de réplicas parciales que comienzan siempre en el mismo
sitio, pero terminan en puntos diferentes a lo largo de la cadena del ADN.
Se utiliza didesoxirribonucleósidos trifosfato, que no tienen el grupo desoxirribosa 3´-OH,
presente en los nucleótidos normales. Cuando un nucleótido modificado de estos se
incorpora a una cadena de ADN, bloquea la adición del siguiente. A partir de esto, cada
cadena sintetizada terminará al azar en una base diferente de la secuencia.
Esta reacción genera fragmentos similares a los del proceso anterior, donde son detectados
por un marcaje que incopora o bien el oligonucleótido o uno de los desoxirribonucleósidos
trifosfato usados para la extensión.
Para determinar la
secuencia completa, se
utilizan cuatro nucleósidos
trifosfato diferentes de
cadena en cuatro
reacciones de síntesis
separadas, sobre el mismo
molde de ADN.
Cuando los productos de
estas cuatro reacciones se
analizan en cuatro carriles
paralelos en un gel de
poliacrilamida, la secuencia
de ADN puede deducirse
de una manera análoga
como se hace en el
método químico.
Estos dos métodos son muy rápidos y seguros. El sistema más fácil y exacto de
determinación de la secuencia de aminoácidos de una proteína consiste en
determinar la secuencia de nucleótidos de su gen, generando un clon de cADN a
partir del mRNA apropiado, determinando la secuencia de nucleótidos y analizándolo
utilizando el código genético para estimar la secuencia de aminoácidos.
Aunque existen seis pautas de lectura por medio de las cuales la secuencia de ADN se
puede traducir a proteína (3 por cada hebra), se reconoce la correcta por ser la única
que no presenta un gran número de codones de terminación. Habitualmente se
determina un pequeño trozo de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada
para confirmar la secuencia determinada a partir del ADN.
El principal reto futuro es la secuenciación del genoma humano, lo cual implicaría un
método más sofisticado y automatizado.
Reparación del ADN
Se producen alteraciones químicas sin programar en todas las macromoléculas
biológicas, debidas a daños de causa ambiental, o a errores de síntesis.
El ADN requiere una estabilidad metabólica debido a que su contenido de
información debe de transmitirse de manera intacta de una célula a otra durante la
división o reproducción del organismo.
Su estabilidad se mantiene mediante un proceso de replicación con una exactitud
muy elevada, y mediante mecanismos que corrigen la información genética cuando el
ADN se ha dañado.
En la replicación los principales mecanismos de reparación son la corrección de
pruebas 3´-exonucleolítica, que corrige los errores de las ADN polimerasas, y la ruta
de la uracilo-ADN N-glucosilasa, que impide las mutaciones que pudiesen producirse
por la desaminación de la citosina a uracilo en el ADN.
Los demás procesos de reparación se dan cuando el ADN se daña por errores de
replicación no corregidos, o por daños de causa ambiental, estos por la modificación
química de los nucleótidos del ADN o alteraciones fotoquímicas causadas por la
absorción de radiación de energía elevada.
La mayor parte de los estudios sobre reparación de ADN se han dado con muestras
alteradas mediante alquilación química o entrecruzamiento de las cadenas de ADN,
por desaminación de bases o radiación ultravioleta.
La lesión oxidativa genera especies reactivas como la 8-oxoguanina o la timina glicol,
contribuyendo principalmente a la mutagénesis. Uno de los procesos de reparación
de este daño es una enzima nucleótido hidrolasa.
Esta enzima rompe el nucleótido alterado en las células sometidas a la presencia de
oxígeno con acumulación de 8-oxo-dGTP, justo antes de que se pueda utilizar como
sustrato en la replicación del ADN. Existen dos enzimas semejantes en bacterias y
mamíferos.
Las consecuencias del daño de la radiación o la alquilación son la mutagénesis,
resultado de la replicación errónea de una base del molde dañada, y la muerte
celular, consecuencia de la incapacidad del aparato de replicación para copiar un
lugar dañado.
Existen diversos sistemas de reparación, agrupados en diversas clasificaciones:
reparación directa, por escisión de un nucleótido, por escisión de una base,
recombinatoria, y de mal apareamiento.
El ADN es la diana biológica de la radiación UV, esto se determinó por los espectros
de acción, irradiación de bacterias o fagos con luz UV, y la determinación de las
longitudes de onda más eficaces en la estimulación de la mutagénesis o la muerte,
cercanas a los 260 nm.
Cuando se estudia el ADN irradiado con luz UV se detectan cantidades de
componentes de ADN alterados de diversas materas, llamados fotoproductos. De
estos destacan los dímeros intracatenarios formados por dos bases pirimidínicas
unidas mediante una estructura de anillo de ciclobutano donde participan los C 5 y 6.
Estos dímeros de timina, formados por dos residuos de ADN, son fotoproductos
biológicamente importantes debido a que su abundancia está asociada con la muerte
de bacterias y fagos.
La capacidad de un organismo para sobrevivir la radiación se asocia con su capacidad
de eliminar estos dímeros. La dimerización de la timina distorsiona la hélice,
bloqueando la polimerización replicativa.
Existen otros dímeros, los primidina-pirimidina, que están mas asociados con las
mutaciones por radiación.
La reparación directa es aquella donde una base del ADN dañada sufre una reacción
química para restablecer la estructura original. En este caso se cambian las bases
dañadas en lugar de eliminarlas. Existen dos métodos en esta clasificación.
La ADN fotoliasa, o enzima fotorreactivadora, repara los dímeros de ciclobutano
pirimidina en presencia de luz visible. La enzima se una al ADN en un proceso que es
independiente de la luz, específicamente en el lugar de los dímeros de pirimidina. En
presencia de luz de longitud de onda visible, se rompen los enlaces que ligan los
anillos de pirimidina, tras lo cual la enzima puede disociarse en la oscuridad. Contiene
dos cromóforos, el dinucleótido de flavina y adenina unido desprotonado y reducido,
en algunas fotoliasas es el 5,10-metenltetrahidrofolato y en otras es la 8-hidroxi-5-
desazaflavina. El segundo cromóforo actúa como factor de captación de la luz,
transmitiendo energía luminosa a FADH, transfiriendo un electrón al dímero y
rompiendo los enlaces pirimidina-pirimidina mediante radicales libres. La fotoliasa no
está presente en los humanos actualmente, atribuido al estrechamiento de la capa de
ozono.
El tratamiento del ADN con un agente metilante o etilante es comparable a la
radiación ultravioleta, por cuanto se forman diversas bases el ADN modificado,
algunas de las cuales resultan letales si no se reparan, mientras que otras son
mutágenas. Algunos agentes alquilantes se utilizan para bloquear la replicación del
ADN en cáncer.
Las bases alteradas por estos reactivos son fundamentalmente las purinas y la gama
de productos formados varía con el reactivo. El más mutágeno es la O-alquilguanina,
a causa de que la base modificada tiene una probabilidad muy elevada de aparearse
con la timina cuando se replica la cadena modificada. Así pues, la alquilación de una
guanina del ADN estimula una transición GC a AT.
En la reparación de este tipo de lesión interviene la O-alquilguanina alquitransferasa,
que transfiere un grupo metilo o etilo de un residuo de O-metilguanina u O-
etilguanina a un residuo de cisteína en el lugar activo de la proteína. Esta catálisis solo
puede darse una vez. Tras alquilarse, no puede eliminar el grupo alquilo y la molécula
proteica se recambia. La forma alquilada de la alquiltransferasa es la forma específica
del activador de la transcripción, lo cual permite una adaptación al daño causado por
la alquilación mediante una proteína alquilada como señal específica.
La reparación por escisión de nucleótidos usando escinucleasas se da
cuando en una región del ADN que contiene un lugar dañado se corta
y se sustituye con ADN normal. Se descubrió como un sistema
enzimático capaz de reparar los dímeros de timina creados en el ADN
por radiación UV. Puede ocurrir en oscuridad. Las enzimas son
producto de los genes uvrA, B y C. Actúan sobre diversos lugares del
ADN dañado que contienen lesiones voluminosas que distorsionan la
doble hélice. Es un sistema universal.
La enzima UvrABC reconoce una lesión, y con la ayuda de la hidrólisis
del ATP, hace que se doble el ADN, lo cual divide la lesión en dos partes
y deja un hueco en medio. En este hueco, la polimerasa y la ligasa la
sustituyen por una parte no dañada. La helicasa II desenrolla y elimina
el nucleótido escindido. La enzima se clasifica cono escinucleasa.
También interviene en lesiones por entrecruzamiento covalente,
reparando secuencialmente dos cadenas.
En el ser humano se utilizan dos endonucleasas, una para cortar del
lado 5´, y otra del 3´. Ocurre principalmente como una reparación
acoplada a la transcripción, iniciándose cuando el ARN polimerasa está
transcribiendo y queda atascada en el lugar de la lesión del ADN. Esto
ayuda a la integridad de los genes requeridos para sintetizar las
endonucleasas.
La reparación por escisión de bases usando ADN-N-
glucosilasas comienza con la rotura del enlace glucosídico
que conecta una base dañada al esqueleto azúcar-fosfato del
ADN. Una glucosilasa rompe entre la timina del lado 5´ del
dímero y su desoxirribosa asociada, y una AP endonucleasa
reconoce el lugar apirimidínico que consiste en una
desoxirribosa sin una base de pirimidina asociada, y rompe
en el lado 5´. Una segunda ruptura en 3´ por la
desoxirribofosfodiesterasa libera la desoxirribosa-5-fosfato.
La translación de la mella y la acción de la ligasa sustituyen el
ADN dañado y cierran la mella resultante. La reparación de
bases utiliza enzimas diferentes para la ruptura glucosídica y
endonucleolítica. Las ADN-N-glucosilasas son específicas para
las bases alquiladas.
El daño oxidativo se repara por este sistema. El gen mutT
rompe el 8-oxo-dGTP, un nucleótido que contiene la base
dañada de 8-oxoguanina, antes de que se incorpore al ADN.
Su efecto mutagénico depende de su apareamiento con la
adenina. Los productos de los genes mutM y mutY son ADN-
N-glucosilasas que actúan igualmente en lugares del ADN
que contienen 8-oxoguanina y otras bases oxidadas.
La reparación recombinatoria sucede cuando los dúplex de ADN replicados
recientemente sufren recombinación genética, que en última instancia elimina el
segmento de ADN dañado. Sucede posterior a la replicación, ya que la polimerasa no
continúa su acción en el lugar dañado debido a la distorsión de la doble hélice,
generando un proceso de inserción y ruptura exonucleolítica. Si se sintetiza un
fragmento de Okazaki frente al lugar dañado, se deja un hueco frente al dímero de
timina. Si no se reparara sería letal, pues generaría una ruptura de doble cadena en el
siguiente proceso de replicación.
Existen dos procesos para reparar este hueco, la reparación por recombinación o
reparación del hueco de la cadena hija, y la reparación SOS o reparación propensa a
errores. Ambos tienen una dependencia de la proteína RecA. Esta cataliza el
apareamiento de cadenas o asimilación de estas, uniendo dos ADN diferentes
mediante apareamientos de bases homologas entre sí. Además es un regulador
genético, activando la síntesis de muchas proteínas que ayudan a la reparación y
adaptación del ADN ante las tensiones metabólicas.
REPARACIÓN POR RECOMBINACIÓN
Dado que el hueco que se genera frente al dímero de timina lo
crea una replicación defectuosa, este hueco está próximo a la
horquilla de replicación y a la región de la otra doble cadena
hija. Si esta región no ha sufrido daños, la proteína RecA puede
iniciar la recombinación entre dos dobles cadenas homólogas.
La cadena de origen no afectada, que es complementaria de la
cadena de origen dañada, se recombina en el hueco, frente al
lugar dañado. Existe entonces un hueco en el brazo
previamente no dañado, pero como no está frente a un molde
no dañado, puede llenarse por la acción de la ADN polimerasa
y ligasa.
El dímero de timina en sí no se repara en este proceso, pero el
proceso proporciona el tiempo suficiente para que luego
intervenga el sistema de escisión y repare el daño. Es
necesaria la intervención de la proteína RecA para la
reparación del hueco creado en la cadena hija. Esta proteína
es bacteriana, pero tiene su homóloga en eucariotas.
RESPUESTA SOS
Es un sistema de alarma metabólico que ayuda a que la célula consiga salvarse en
presencia de tensiones que pueden resultar letales. Los inductores de la respuesta
SOS son la radiación ultravioleta, la falta de timina, el tratamiento con reactivos
modificadores, y la inactivación de genes esenciales. Las respuestas incluyen la
mutagénesis, filamentacion, activación de reparación por escisión y activación de
genomas latentes.
Las ADN polimerasas son incapaces de replicar más allá de un lugar dañado en la
cadena molde. Lo mismo sucede cuando la cadena molde contiene un lugar sin una
base ligada a la desoxirribosa. La holoenzima ADN polimerasa III puede replicar más
allá con la ayuda de otras proteínas: SSB, RecA, y umu. Sin embargo, la unión de este
complejo proteico es altamente propenso a errores.
Si existe un acumulamiento excesivo de mutaciones y errores la célula puede tener
muerte celular.
La reparación de mal apareamientos es un proceso que reconoce estos daños en el
ADN que se crean por errores de replicación, por recombinación no homóloga, o por
daño de una base del ADN. Estos daños se dan cuando los pares de bases que no
corresponden a los de Watson-Crick se dan en la doble cadena, producidos por
errores de replicación, desaminación de la 5-metilcitosina de ADN, o por
recombinación de segmentos de ADN no homólogos. También ocurren cuando la
ADN polimerasa se desliza en el molde y crea bucles en la doble cadena.
Cuando la ADN polimerasa introduce un nucleótido incorrecto, el error se corrige
normalmente por la corrección de pruebas 3´ exonucleolítica. Si el error no se corrige
inmediatamente, el ADN totalmente replicado contendrá un mal apareamiento.
Entonces de debe reparar este daño. Las proteínas que participan son las mut H, L y
S. Además del MutU, la ADN helicasa II.
El sistema de corrección de mal apareamiento examina el ADN recién replicado, buscando
todas las bases mal apareadas, así como inserciones y pérdidas de bases aisladas. MutS se
une al ADN en el lugar del mal apareamiento, luego se unen L y H. La primera es una
proteína promotora que utiliza la energía de la hidrólisis del ATP para tirar del ADN en
ambas direcciones hasta que alcanza el lugar en el que debe reparar. Cuando encuentra un
mal apareamiento, parte de la cadena que contiene la región mal apareada se elimina y
sustituye. Las enzimas de este sistema identifican la cadena recién replicada, ya que durante
un corto tiempo este ADN no está metilado. Las secuencias –GATC- se metilan
inmediatamente después de la replicación, por lo que las enzimas buscan estas secuencias
sin metilar. Una vez reconocida esta secuencia, el sistema ya no puede reconocer la cadena
sintetizada más recientemente, por lo que se pierde la ventaja de la fidelidad de replicación.
El complejo MutHLS se mueve a lo largo del ADN en ambas direcciones hasta encontrar la
secuencia 5´-GATC más cercana. Se da una actividad endonucleasa de MutH, rompiendo en
el lado 5´ de la cadena sin metilar. La helicasa II desenrolla el ADN retrocediendo hasta
pasado el mal apareamiento, seguido por una endonucleasa que digiere la cadena
desplazada. El hueco lo llena la holoenzima ADN polimerasa III y una ligasa.
El sistema eucariota es similar pero más complejo. En este participan tres homólogos
MutS236. Estas forman heterodímeros, con diferentes especialidades (2-6 reconocen
apareamientos de una sola base, inserciones y pérdidas; 2-3 reconocen inserciones y
pérdidas de dos a cuatro nucleótidos).
Control genético
Los distintos tipos celulares de un organismo superior suelen diferir profundamente
tanto en estructura como en función. Ya que la diferenciación celular suele ser
irreversible, inicialmente se pensaba que en la diferenciación celular los genes se
perdían de modo selectivo, sin embargo, ahora se sabe que la diferenciación depende
de cambios en la expresión génica y no en su pérdida.
Los tipos celulares de un organismo se diferencian unos de otros porque sintetizan y
acumulan distintas moléculas de ARN y proteínas sin alterar de modo irreversible el
ADN.
Se han llevado a cabo diversos experimentos, comprobando que el genoma se
conserva durante la diferenciación celular, no teniendo ni pérdida ni reorganización
de grandes bloques de ADN. Los conjuntos de cromosomas del ser humano en todas
sus células diferenciadas son idénticos.
Muchos procesos son comunes a todas las células, por lo tanto, dos células
cualesquiera de un organismo presentarán muchas proteínas en común. Entre ellas se
encuentran algunas proteínas altamente abundantes y otras poco perceptibles.
Algunas proteínas son abundantes en las células especializadas en las que actúan
pero no se pueden detectar en ningún otro tipo celular, aunque se utilicen métodos
muy sensibles.
Si se comparan las 2000 proteínas más abundantes de distintos tipos celulares del
mismo organismo, utilizando electroforesis, se detectan muy pocas diferencias. Tanto
si se comparan dos líneas celulares en cultivo como si se extraen.
Cada célula típica de un eucariota superior sintetiza entre 10,000 y 20,000 proteínas
distintas. La mayoría de ellas son demasiado escasas para ser detectadas. Es probable
entonces que las proteínas diferentes suficientes para generar cambios morfológicos
grandes y comportamientos celulares distintos sea una cantidad muy pequeña.
La mayor parte de las células especializadas de un organismo pluricelular son capaces
de alterar su patrón de expresión génica como respuesta a señales extracelulares.
Frecuentemente, diferentes tipos celulares responden en diferente forma a la misma
señal extracelular.
Existe una serie de rasgos de no cambian, y que confieren a cada tipo celular sus
propiedades características. Estos reflejan la expresión constante de diferentes
conjuntos de genes.
Las diferencias entre los tipos celulares dependen de los genes que estas expresan.
Las células pueden regular la síntesis de proteínas en diversas etapas: regular el
momento y frecuencia de transcripción de genes concretos (control transcripcional),
control del modo de maduración o procesamiento de los transcritos primarios de
ARN (control de procesamiento de ARN), selección de los mRNA maduros a exportar
al citoplasma (control traduccional), desestabilización selectiva de mRNA
citoplasmático (control de degradación de los mRNA), y
activando/desactivando/ubicando selectivamente las proteínas sintetizadas (control
de actividad proteica).