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    Actividades Repaso Tema 7.62

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    Este documento presenta una serie de preguntas y actividades relacionadas con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo emparejar cebadores con sus secuencias diana, calcular el tamaño de un amplicón, identificar los componentes de una mezcla de PCR y sus funciones, y describir variantes de PCR como la PCR anidada y la PCR a tiempo real.

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    Este documento presenta una serie de preguntas y actividades relacionadas con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo emparejar cebadores con sus secuencias diana, calcular el tamaño de un amplicón, identificar los componentes de una mezcla de PCR y sus funciones, y describir variantes de PCR como la PCR anidada y la PCR a tiempo real.

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    Este documento presenta una serie de preguntas y actividades relacionadas con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo emparejar cebadores con sus secuencias diana, calcular el tamaño de un amplicón, identificar los componentes de una mezcla de PCR y sus funciones, y describir variantes de PCR como la PCR anidada y la PCR a tiempo real.

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    ACTIVIDADES TEMA 7.

    PCR

    1. A continuación, se muestran las secuencias de una molécula bicatenaria de ADN (ADN


    molde) y de dos cebadores utilizados para amplificar una región de ella. Resuelve las
    siguientes cuestiones:

    a. Empareja cada cebador con su secuencia diana en el ADN molde.


    b. Indica cuál es el cebador F y cuál el R.
    c. ¿Cuántos pb tendrá el amplicón?
    d. Marca el amplicón en la molécula de ADN molde.

    2. Sobre las ADN polimerasas termoestables:


    a. Indica las dos características principales que debe tener una ADN polimerasa para
    que se pueda utilizar en PCR y explica por qué.
    b. Explica la diferencia entre una ADN polimerasa con actividad correctora y otra sin
    actividad correctora.
    c. Una ADN polimerasa tiene una temperatura óptima de polimerización de 42 ºC y
    mantiene su actividad tras dos horas a 100 ºC. ¿Puede usarse esta enzima en PCR?
    Razona la respuesta.

    3. Haz una lista con los componentes de una mezcla estándar de PCR y explica la función de
    cada uno de ellos en la reacción.
    4. Queremos reproducir las siguientes condiciones de una PCR que hemos leído en una
    publicación cientí-fica:

    a. Volumen final de la mezcla de reacción para una PCR: 25 µl.


    b. Concentración final de MgCl2: 1,5 mM.
    c. Concentración final de dNTPs: 200 µM cada uno.
    d. Concentración final de cada cebador (F y R): 400nM.
    e. Taq ADN polimerasa: 1 U.
    f. Para ello tenemos un kit de PCR que consta de los siguientes reactivos:
    g. Tampón de reacción 10x.- MgCl2 25 mM.
    h. Solución de dNTPs con una concentración total de 10 mM.
    i. Cebadores F y R con una concentración de 10 pmol/µl cada uno.
    j. Taq ADN polimerasa con una concentración de 2 U/µl.

    Calcula las cantidades de cada componente para preparar una mezcla de reacción para 10 PCR
    teniendo en cuenta que en cada PCR se añadirá 1 µl de ADN molde.

    5. Entra a https://www.youtube.com/watch?v=DZ7uNG9dy0E y visiona el video de esta


    práctica. ¿Con qué finalidad se aplica la técnica PCR? Identifica y esquematiza los pasos
    que se llevan a cabo.

    6. Se analizan seis muestras mediante una PCR para detectar la presencia de


    citomegalovirus. La PCR se realiza con cebadores específicos para amplificar un fragmento
    de 250 pb del genoma viral, junto con cebadores específicos para amplificar un fragmento
    de 400 pb del gen de la ß-globina como control positivo. Finalizada la reacción, se realiza
    una electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos de cada reacción (líneas 2 a 7),
    junto con un marcador de tamaños (múltiplos de 100 pb) en la línea 1. El resultado de la
    electroforesis se muestra en la imagen inferior. Indica el resultado obtenido en cada
    muestra y razona las respuestas.
    7. Empareja cada tipo o variante de PCR con las enzimas o cebadores que se utilizan en ellas.

    1. PCR múltiple A. Dos cebadores externos y dos cebadores


    internos en dos PCR consecutivas
    2. PCR de grandes fragmentos B. Transcriptasa inversa + ADN polimerasa
    termoestable
    3. PCR anidada (nested-PCR) C. ADN polimerasa sin actividad correctora
    + ADN polimerasa con actividad correctora

    4. Hot Start PCR D. ADN polimerasa con actividad correctora

    5. RT-PCR E. Varias parejas de cebadores en la misma


    PCR
    6. PCR de alta fidelidad F. ADN polimerasa inactiva hasta que se
    alcanza la temperatura de
    desnaturalización por primera vez.

    8. A partir de una molécula de ARNm, dibuja un esquema de la transcripción inversa y los


    tres primeros ciclos de PCR de una RT-PCR, en la que se usa un cebador poli-T para obtener
    ADNc.

    ¿Cuántos amplicones de ADNc bicatenario especí-ficos se obtienen al final del tercer ciclo?

    9. Completa las siguientes afirmaciones sobre la PCR a tiempo real, tachando lo que no
    proceda.

    a. Cuando se usan agentes intercalantes:


    - La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación/extensión de cada ciclo.
    - La fluorescencia aumenta/disminuye con el número de ciclos.

    b. Cuando se utilizan sondas de hidrólisis o sondas TaqMan:


    - La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación/extensión de cada ciclo.
    - La fluorescencia aumenta/disminuye con el número de ciclos.

    c. Cuando se utilizan balizas moleculares:


    - La fluorescencia aumenta/disminuye con el número de ciclos.
    - Se excita el notificador/quencher y se mide la fluorescencia emitida por el
    notificador/quencher.

    d. Cuando se utilizan sondas FRET:


    - La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación/extensión de cada ciclo.
    - Se excita el notificador/quencher y se mide la fluorescencia emitida por el
    notificador/quencher.
    10. Di si son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones. Razona la respuesta en las falsas.

    a. En la qPCR el punto de corte (Cp) es el ciclo en el que se pasa de la zona de ruido a


    la zona de crecimiento exponencial en la curva de amplificación.
    b. El Cp de una muestra es directamente proporcional a la concentración inicial de la
    molécula diana en la muestra. A mayor concentración inicial mayor Cp.
    c. En la curva de picos de fusión generada por un termociclador a tiempo real se
    observan tantos picos como productos amplificados con distintas Tm (especí-ficos y
    no especí-ficos) se hayan sintetizado durante la PCR.

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