PRÁCTICA 4

PRÁCTICA 4: IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM

NEGATIVOS

1. OBJETIVOS
Al finalizar las actividades y ejercicios complementarios de la práctica 4 de
laboratorio, el estudiante:
1.1. Observará y reconocerá los pasos del proceso que se utiliza en un laboratorio
de microbiología para la identificación de enterobacterias mediante el uso de
la Galería API 20E.
1.2. Reconocerá cuándo algunas especies de enterobacterias se consideran parte
de la microbiota normaldel microbiota normal, y cuándo estas especies son
consideradas responsables de una infección.

2. INTRODUCCIÓN
Las bacterias tipo bacilos Gram negativos suelen agruparse en dos
grandes familias: la Enterobacteriaceae y la No Enterobacteriaceae. Ambos
grupos se diferencian en que las Enterobacteriaceae suelen ser oxidasa negativas
(ausencia de la actividad de la citocromo oxidasa), y fermentadoras de glucosa;
mientras que las No Enterobacteriaceae suelen ser no fermentadoras de glucosa y
oxidasa positivas 1.
La familia Enterobacteriaceae se encuentra ampliamente distribuida en la
naturaleza. Sus miembros habitan plantas, suelos y animales, incluyendo el ser
humano en el cual forman parte de la microbiota normaldel microbiota normal del
tracto gastrointestinal. Los miembros más comúnmente asociados a infecciones
del tracto gastrointestinal son: Salmonella sp., Escherichia coli (únicamente las
especies patogénicas), y Yersinia enterocolitica 1,2.
La familia No Enterobacteriaceae también está distribuida ampliamente en la
naturaleza, sin embargo, no son parte de la microbiota normaldel microbiota
normal del ser humano. A algunas especies del grupo de las No
Enterobacteriaceae causan infecciones oportunistas. Uno de sus miembros más
importantes es la Pseudomonas aeruginosa que se encuentra en la tierra, en la
materia orgánica en descomposición, en la vegetación y en el agua. P. aeruginosa
es responsable de infecciones de heridas causadas por quemaduras de tercer
grado, de la “foliculitis del jacuzzi”, del “oído de nadador”, entre otras infecciones
en humanos 1,3.
 PRÁCTICA 4

2.1. Identificación de los bacilos Gram negativos en el laboratorio:

La identificación microbiológica de las enterobacterias se realiza comúnmente
mediante la caracterización del metabolismo de la bacteria. Es así que las
diferencias metabólicas de este grupo de bacterias nos permiten diferenciar e
identificar el género e incluso la especie a la que pertenecen 2.

¿CÓMO SE DETECTA EL METABOLISMO BACTERIANO?

Las pruebas de rutina que se utilizan para detectar el metabolismo bacteriano
permiten determinar características fenotípicas de las bacterias. Para realizar estas
pruebas se utilizan medios de cultivo que contienen sustratos específicos
(glucosa, citrato, urea, entre otros) y permiten determinar la presencia de una
enzima bacteriana (o complejo de enzimas) al reaccionar sobre su sustrato 4.

A continuación, se describe la prueba de la oxidasa. Esta es una prueba que nos

permite discriminar, si una bacteria que al microscopio se observa como bacilo
Gram negativo, pertenece al grupo de las Enterobacteriaceae o a las No
Enterobacteriaceae.

2.1.1. Prueba de la oxidasa

El sistema citocromo-oxidasa participa en la cadena de transporte de electrones y
en la vía metabólica del nitrato de ciertas bacterias; se encuentra en la membrana
2,4
celular (son proteínas transmembrana) de diversas especies de bacterias . El
sistema citocromo-oxidasa no está en bacterias de la familia
Enterobacteriaceae, por lo que es una prueba que se utiliza al inicio del algoritmo
de identificación de los miembros de esta familia. Las bacterias que pertenecen al
grupo de las NO Enterobacteriaceae son generalmente positivas para la
prueba de la oxidasa (Ej. Pseudomonas auriginosa) 2.
La prueba de la oxidasa o citocromo-oxidasa consiste en la detección de la
enzima oxidasa bacteriana, la cual reacciona con el tetrametil-p-fenilenediamina
dihidrocloruro (reactivo oxidasa) que se encuentra impregnado en una almohadilla
localizada al final de una tirilla de plástico. Una reacción positiva da lugar a un
cambio de la coloración a púrpura causado por el indofenol, que se forma por la
oxidación del reactivo oxidasa (Figura 14; derecha) 2. La ausencia de citocromo –
oxidasa no implica cambio de coloración (Figura 14 - izquierda).
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Figura 1: Prueba de la oxidasa: izquierda prueba negativa, derecha prueba positiva.

Es importante tener en cuenta que, al igual que en otras pruebas con

reacciones parecidas, la tirilla que contiene la prueba de la oxidasa puede dar
falsos positivos. Esta falsa positividad se da cuando la tirilla está expuesta por
periodos largos de tiempo al oxígeno ambiental, que promueve la reacción de
oxidación y el color de la tira puede cambiar en ausencia de la citocromo-
oxidasa. También se han observado falsos positivos cuando se utiliza un asa
de metal (hierro), por lo que se recomienda el uso de asas de platino o palillos
de madera al transferir las colonias a la tirilla 2.

En la actualidad existen pruebas semi-automatizadas y pruebas automatizadas

que permiten que el personal de salud obtenga una identificación precisa y en
menos cantidad de tiempo que con las pruebas tradicionales.

Un ejemplo de prueba semi-automatizada es la Galería API.

Las galerías API son sistemas múltiples para diferenciar e identificar
microorganismos mediante el uso de pruebas bioquímicas. En esta práctica
utilizaremos las Galerías del tipo API-20E para la identificación de
enterobacterias. La prueba consta de 20 microtubos que contienen dentro de
ellos sustratos deshidratados. Durante el período de incubación (18-24 horas)
el metabolismo de la bacteria actúa sobre los sustratos. Las veinte reacciones
son realizadas y leídas simultáneamente.

Observa el video de cómo se realiza esta técnica:

https://edpuzzle.com/media/5d3869f387b6054092322a07

2.2. Susceptibilidad antimicrobiana en enterobacterias

El tratamiento adecuado de un proceso infeccioso está relacionado con tres aspectos:
1) El sitio de localización de la infección.
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2) El conocimiento del agente etiológico de la enfermedad.

3) La susceptibilidad del agente infeccioso a las drogas antimicrobianas.

Es por esto, por lo que la prueba de sensibilidad de los microorganismos a los

antibióticos es una de las más importantes de los laboratorios de microbiología clínica.
El antibiograma define la capacidad in vitro de un antibiótico de inhibir el crecimiento
de una bacteria 3,4.

2.2.1. El método más utilizado para determinar la susceptibilidad en

enterobacterias es el de DIFUSIÓN EN DISCO O KIRBY BAUER
Los antibióticos que se utilizan para este método están impregnados en discos de
papel filtro de 6mm de diámetro en concentraciones predeterminadas por comités
internacionales y establecidas en normas estandarizadas. En Estados Unidos rige el
Clinical and Laboratoy Standards Institute (CLSI) y Eucast es el ente regulador en la
Unión Europea. La concentración de antibiótico de los discos permite una correlación
con la concentración mínima inhibitoria que dicho antibiótico alcanzaría “in vivo”. El
antibiótico se difunde radialmente a través de la superficie del agar a partir del disco
formándose un gradiente de concentración 3,4.
Transcurridas 18 a 24 horas de incubación, los discos aparecen rodeados por una
zona de inhibición del crecimiento de la bacteria, si esta es sensible al antibiótico. El
diámetro de los halos de estas zonas de inhibición debe ser medido con una regla por
observación visual. Una vez medidos los tamaños de las zonas de inhibición para cada
antibiótico, se debe utilizar los valores de referencia y determinar si es sensible,
resistente o de sensibilidad intermedia. Para la elección de los discos de sensibilidad,
se debe tomar en cuenta el microorganismo aislado y el proceso infeccioso en estudio
3,4
.

2.2.2. Betalactamasas de espectro extendido en enterobacterias (BLEE)

La resistencia de los organismos patógenos a los antibióticos que se utilizan de

manera rutinaria es actualmente un problema mundial y tiene serias consecuencias en
el tratamiento de infecciones 3,4.

Uno de los mecanismos que produce multiresistencia en enterobacterias es la

producción de betalacamasas de esprectro extendido. Estas enzimas proveen
multiresistencia a antibióticos β-lactámicos como son las penicilinas, cefalosporinas,
cefamicinas y carbapenems 3,4.
 PRÁCTICA 4

3. MATERIALES
Para esta práctica deberás tener a la mano:
 Una bata
 Un par de guantes
 Una regla que tenga milímetros
 Tu bitácora impresa
 Un esfero
 Lápices de colores
En esta práctica recibirás:
 Galería API 20E preparada hace 18 horas con microorganismos aislados de los
casos 1 y 2
 Microorganismo 1: Caso clínico 1
 Microorganismo 2: Caso clínico 2
 Cultivo de P. aeruginosa
 Tiras de oxidasa
 Solución alcalina
 Placas de tinción Gram que corresponden a los aislados bacterianos de un
caso
 Antibiograma de aislado de caso1 y antibiograma de asilado de caso 2.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Observación microscópica de Enterobacterias
Observa al microscopio una enterobacteria. Se la observa como un bacilo
Gram negativo.
4.2. Prueba de la oxidasa
Toma la caja Petri del caso y realiza la prueba de la oxidasa de la siguiente
manera.
4.2.1. Con un palillo de madera estéril y siguiendo las normas de asepsia,
toma una colonia bacteriana que se encuentra sembrada en un agar
nutritivo.
4.2.2. Coloca la bacteria sobre la tira de papel (en forma de rayas).
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4.2.3. En caso de ser positivo, el papel cambia de color pasando a morado o

negro. Observar los resultados luego de un máximo de 5 minutos (cuando
esta reacción pasa más de 10 minutos, los resultados ya no serán
fiables).
4.2.4. Como control positivo de la prueba de oxidasa utiliza un aislado de
Pseudomonas sp.

4.3. Observación de crecimiento de bacterias en Medio MKL

4.3.1. Sobre tu mesón encontrarás cultivos de caso 1 y caso2 en medio MKL.
Observa las diferencias en las colonias, su color, su morfología.

4.4. Galería API 20 E

4.4.1. Las galerías API 20E que se encuentran sobre sus mesones y que
corresponden a los casos 1 y 2, fueron incubadas por 18 a 24horas a 37°C.
4.4.2. Antes de interpretar el resultado del crecimiento bacteriano sobre los
sustratos específicos, algunas de estas pruebas requieren que adicionemos
un reactivo de revelación, el cual producirá el cambio de color según el
metabolismo de la bacteria. Específicamente, los reveladores TDA, Kovac‟s,
VP1 y VP2 ya fueron añadidos en la galería, cada uno de los pocillos se
debe interpretar como un resultado positivo o negativo (ver Tabla 2).
4.4.3. La interpretación de los resultados debe hacerse utilizando la tabla de
interpretación de resultados (puedes encontrarla abajo) para luego llenar la
hoja de identificación que se encuentra en tu bitácora. Cada conjunto de
reacciones tiene un valor, el cual se encuentra identificado en la hoja de
identificación. Con estos valores se obtiene un perfil numérico del
microorganismo a identificar, el cual se ingresa en el catálogo de API en
línea, y como resultado obtendremos la identificación del microorganismo.
 PRÁCTICA 4

Tabla 1: Criterios de interpretación de resultados del API-20E.

Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

ONPG beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja
LDC lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ODC ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
CIT utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa
H2S producción de H2S sin precipitado negro precipitado negro
URE Ureasa amarillo rojo o naranja
TDA triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo
IND producción de indol amarillo color rosa o anillo rosa-rojo
VP producción de acetoína (Voges-Proskauer) sin color rosa-rojo
GEL Gelatinasa sin difusión difusión de pigmento
GLU fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo
MAN fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo
INO fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo
SOR fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo
RHA fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo
SAC fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo
MEL fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo
AMY fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo
ARA fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo
OX citocromo oxidasa

4.5. Lectura e interpretación de antibiogramas

Utilizando una regla, mide el diámetro de los halos de inhibición de cada uno de los
antibiogramas de los casos 1 y caso 2. Interpreta según las instrucciones en tu
bitácora.

5. RESULTADOS
Observa todo el material para cada uno de los casos clínicos, no olvides mirar los
microscopios en donde está el Gram de las bacterias asiladas de cada caso. En
clases virtuales covid19 sincrónicas, resultados obtenidos y esperados serán
 PRÁCTICA 4

fornecidos en D2L, a través de imágenes, vídeos y tablas en la sección

denominada „‟Resultados‟‟. Anota en la bitácora tus observaciones.

6. CUESTIONARIO Y ACTIVIDAD
En tu D2L encontrarás el cuestionario de esta práctica de laboratorio.

7. REFERENCIAS

1. Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. Medical Microbiology. 8 ed. Philadelphia:

Elsevier; 2016:1-932. doi:10.1016/B978-0-323-29956-5.00079-3.

2. Tille PM. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. 14 ed. St. Louis: Elsevier Inc.;
2017:1-1137. doi:10.1016/B978-0-323-35482-0.00001-5.

3. Carroll KC, Miller S, Morse SA, et al. Jawetz Melnick & Adelbergs Medical
Microbiology 27 E. 27 ed. New York: McGraw-Hill Education.; 2016:1-867.

4. Engelkirk PG, Duben-Engelkirk J. LABORATORY DIAGNOSIS of INFECTIOUS

DISEASES: Essentials of Diagnostic Microbiology. Baltimore: Lippincott Williams
& Wilkins; 2008:1-770.
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PRÁCTICA 4 – BITÁCORA: IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

Nombre del estudiante: _____________________ Grupo: ______ Fecha:

__________

Caso 1:
Un paciente de 80 años, hombre, presenta síntomas como tos, expectoración, dolor
de espalda y fiebre compatibles con un cuadro clínico de neumonía. El médico
solicita un cultivo de esputo.

En ASC crecen colonias blancas y mucoides. Se

realiza un Gram de la muestra de esputo del
paciente y se observa lo siguiente:

1.1. En el microscopio que tienes sobre el mesón, observa el Gram. ¿La bacteria es
Gram +/-, es un coco/bacilo?

1.2. Realiza la prueba de oxidasa. Los resultados de la prueba de oxidada revelan

que el patógeno es ________ (positivo/negativo).

Pseudomonas Caso 1
sp. 11

1.3. Según los resultados de la oxidasa, ¿dirías que se trata de una

Enterobacteriaceae o No Enterobacteriaceae, por qué?
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
1.4. Sobretu mesón encontrarás un medio MKL en el que está sembrada la bacteria
aislada del caso 1. Según lo que observas sobre el crecimiento del aislado en este
medio. ¿Qué podemos decir sobre esta bacteria?
Recuerda: MKL es un medio de cultivo en el que crecen selectivamente bacterias que habitan
normalmente en el tracto intestinal (bacilos Gram negativos y enterobacterias). Contiene cristal violeta y
sales biliares, lo que inhibe el crecimiento de organismos Gram positivos. Adicionalmente, permite
 PRÁCTICA 4

diferenciar si los microorganismos pueden fermentar lactosa, este metabolismo se evidencia debido a
que las colonias y el medio de cultivo cambian de color a rosado gracias a la presencia del indicador de
pH rojo neutro.

1.5. Anota el resultado de las pruebas bioquímicas (API 20E) de la bacteria aislada
del caso 1 y a qué microorganismo corresponden según el programa APIWEB:

1.6. Observa el antibiograma del aislado, mide el diámetro de los halos de inhibición
en milímetros y anota e interpreta en la siguiente tabla usando los valores de
referencia de sensible (S), intermedio (I) o resiste (R) del sistema CSLI ( Clinical and
Laboratory Standards Institute):

REFERENCIA CLSI 2019 (mm) INTERPRETACIÓN:

HALO Sensible o resistente
BACTERIA ANTIBIÓTICO
(mm) S≥ I R≤

Aislado
Caso 1

NOTA: El antibiograma sobre tu mesón se utiliza en el laboratorio clínico para identificar bacterias que
excretan betalactamasas de espectro extendido. Esta prueba utiliza los antibióticos CAZ, CTX, CAZ +
ácido clavulánico y CTX + ácido clavulánico en la misma caja. Si la diferencia entre los diámetros entre
CAZ y CAZ+ Ac. es ≥ 5 mm se considera positivo para BLEE (lo mismo es para CTX y CTX + Ac).

1.7. Encierra en un círculo las respuestas correctas. Este microorganismo es

considerado microbiota normal si se lo aísla a partir de:

Caso 2
 PRÁCTICA 4

Una paciente de 35 años, mujer que presenta dolor al orinar desde hace 3 días
acompañados de ardor al orinar, fiebre, orina turbia. El médico solicitó un eco renal el
cual sugiere la presencia de cálculos renales. Así mismo se solicitó un cultivo de la
orina.

Gram de gota fresca de la orina: muestra polimorfonucleares y bacilos Gram

negativos.

En el Gram del aislado se observa muy similar a lo que se encuentra enfocado en el

microscopio para el caso 1.
2.1. Realiza la prueba de oxidasa. Los resultados de la prueba de oxidada revelan que
el patógeno es ________ (positivo/negativo).

Pseudomonas Caso 2
sp. 11

2.2. Según los resultados de la oxidasa, ¿dirías que se trata de una Enterobacteriaceae
o No Enterobacteriaceae, por qué?
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

2.3. Anota el resultado de las pruebas bioquímicas de la bacteria aislada del caso 2
y a qué microorganismo corresponden según el programa APIWEB:

2.4. Observa el resultado de la prueba de Ureasa (URE). ¿Cuál es el resultado?

______________________________________________________________________

2.5. ¿Cuál es la importancia clínica de encontrar una bacteria con este fenotipo en
URE en un caso de IVU?
______________________________________________________________________
 PRÁCTICA 4

2.6. En este caso, ¿el microorganismo aislado es parte del microbiota o patógeno?
_______________________________________________________________________
2.7. Encierra en un círculo las respuestas correctas. Este microorganismo es
considerado microbiota normal si se lo aísla a partir de:

2.8. Lee e interpreta el antibiograma del

aislado, mide el diámetro de los halos de inhibición en milímetros y anota e
interpreta en la siguiente tabla usando los valores de referencia de sensible
(S), intermedio (I) o resiste (R) del sistema CLSI (Clinical and Laboratory Standards
Institute):

HALO REFERENCIA CLSI 2019 (mm) INTERPRETACIÓN:

BACTERIA ANTIBIÓTICO
(mm) S≥ I R≤ Sensible o resistente

Nitrofurantoina 17 15-16 14

Aislado Caso 2 Cefuroxime 23 15-22 14

Imipenem 23 20-22 19

OBSERVACIONES ADICIONALES INDIVIDUALES

_______________________________________________________________________
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Recuerda subir las fotos o el escaneado de esta bitácora en el espacio asignado en tu

D2L.
Si el instructor colocó un círculo sobre la palabra “incompleta”, debes completar tu
bitácora antes de subrila al D2L

ESPACIO EXCLUSIVO PARA EL INSTRUCTOR:

El estudiante llena la bitácora: Completa  Incompleta 

Firma del instructor: ____________________